CC BY
38
УДК 612.8:615.7+576.3:594
ВЛИЯНИЕ ИЗАТИНА И БРОМИЗАТИНА НА ИОННЫЕ КАНАЛЫ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА П.Д. Шабанов1'2, А.И. Вислобоков2,3
1 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Ак. Лебедева, 6 2НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Ак. Павлова, 12 3Санкт-Петербургский государственным медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8
Изучали изменения трансмембранных кальциевого, натриевого и калиевого ионных токов под влиянием производных гетероциклических соединений индола - изатина и его производного бромизатина при внеклеточном приложении в концентрациях от 10-8 до 10-3 моль/л. Использовали метод внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала на изолированных нейронах прудовика Lymnaea stagnalis. Установлено, что оба вещества оказывают неизбирательное дозозависимое и обратимое подавляющее действие на амплитуду токов. Во всем диапазоне концентраций оно было ниже на 5-35% от контроля, при этом бромизатин оказывал более выраженное подавление. Кинетика развития токов не изменялась, наблюдали смещение вольт-амперных характеристик мембраны вправо по оси потенциалов на 5-10 мВ. Следовательно, изатин и бромизатин обладают мембранотропной активностью.
Ключевыге слова: изатин, бромизатин, ионный ток, нейрон, моллюск, lymnaea stagnalis
IMPACT OF ISATINE AND BROMISATINE ON IONIC CHANNELS OF MOLLUSKS P.D. Shabanov1,2, A.I. Visiobokov2,3
Military Medical Academy named after S.M. Kirov, Russia, 190044, St. Petersburg, Ac. Lebedev St., 6 2Institute of Experimental Medicine NWB RAMS, Russia, 197376, St. Petersburg, Ac. Pavlov St., 12 3St. Petersburg State Medical University named after I.P. Pavlov, Russia, 197022, St. Petersburg, Lev Tolstoy St., 6/8
Changes in transmembrane calcium, sodium and potassium ionic currents during extracellular administration of heterocyclic compounds, isatine and bromisatine, in concentrations from 10-8 till 10-3 мо1/1 have ben studied. Method of intracellular dialysis and fixation of membrane potential in the mollusk Lymnaea stagnalis neurons have been used. Both compounds produced dose-dependant and reversible inhibitory action on neuron currents amplitude. It was - 5-35% from control indices in all intervals of concentrations, bromisatine inhibiting action being more significant. Kinetics of currents development do not change, but the shift of voltage-amper membrane characteristics to the right according to axis of potentials by 5-10 mV was registered. Therefore, both isatine and bromisatine possess membranotropic activity.
Key words: isatine, bromisatine, ionic currents, neuron, mollusk, Lymnaea stagnalis
Многие фармакологические средства могут оказывать прямое влияние на потенциалоуправляемые ионные каналы и рецепторы плазматических мембран [3, 4, 11, 12] и тем самым корригируют нарушенные функции в организме.
Изатин (2,3-диоксоиндол) существует в двух формах (рис. 1), считается низкомолекулярным эндогенным непептидным регулятором, который обнаружен практически во всех органах, тканях и биологических жидкостях животных и человека [1, 7, 13].
н
II
Рис. 1. Лактамная (I) и лактимная (II) формы изатина
Изатинсвязывающие белки выявлены в мембранной и растворимой фракциях клеток, идентифицировано несколько мишеней действия изатина: моноаминоксидаза типа В (МАО-B), А-подтип рецепторов натрийуретического пептида, растворимая NO-стимулируемая гуанилатциклаза, пируваткиназа и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа, связывание с которыми, однако, не могут объяснить всех видов биологической активности, свойственной этому соединению [6, 12, 13]. Есть сведения, что в митохондриях именно МАО-B является основной мишенью действия изатина, поэтому изатин часто рассматривают как эндогенный обратимый ингибитор МАО-В [2, 11]. Это открывает возможности направленного влияния на обмен изатина как способа коррекции депрессивных состояний [2]. Содержание изатина в мозге и периферических тканях может увеличиваться в условиях стресса [6]. Показано облегчающее (50 мкмоль) и тормозное (100 мкмоль) влияние изатина на электрофизиологические характеристики нейронов гиппокампа, оказывающее также и противосудорожное действие в экспериментах на интактных крысах [9]. Для бромизатина продемонстрирована противомикробная активность [14]. Не исключено участие изатина и 5-бромизатина в антигипоксических и актопротекторных эффектах индолсодержащих антигипоксантов, производных тиазоло[5,4-Ь]индола, поскольку именно они идентифицированы как продукты метаболизма этих соединений [10].
Поскольку в литературе нет сведений о мембранотропной активности изатина и его производных, целью данного исследования было сравнительное изучение влияния изатина и 5-бромизатина на ионные каналы изолированных нейронов, что может способствовать пониманию механизмов их цитофармакологического действия.
Методика
Объектом исследования были неидентифицированные нейроны брюхоногого моллюска прудовика большого (Ьушиаеа 81а§паШ). Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина в течение 40 мин [3, 8]. Ферментативная обработка позволяет освободить поверхность мембраны нейронов от соединительнотканных оболочек, глиальных клеток и других диффузионных барьеров. После обработки ганглии помещали в раствор без фермента и через 15 мин подвергали механическому разделению под бинокулярным микроскопом при помощи вольфрамовых игл и полиэтиленовой пипетки. Изолированные нейроны сохраняли свои электрические характеристики в течение 1-3 суток.
Для измерения трансмембранных ионных токов применяли метод внутриклеточного диализа изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала [3, 8]. Для изготовления микропипетки с порой использовали тонкую полиэтиленовую трубку длиной 3 см, сгибали ее V-образно в струе горячего воздуха, и на сгибе тонкой стальной проволокой формировали выступ. Затем на вершине выступа под бинокулярной лупой иглой делали отверстие. Изготовленную микропипетку соединяли с системой трубочек для подачи диализирующего раствора (табл.). По величине сопротивления (200-300 кОм) оценивали диаметр отверстия (3-5 мкм) и пригодность микропипетки для дальнейшей работы.
Таблица. Ионный состав растворов (в ммоль/л) для нейронов прудовика
Регистрируемые токи NaCl CsCl CaCl2 MgCl2 KCl трис-ОН рн
Внеклеточные (перфузирующие) растворы
Суммарный входящий 100 - 2 1.5 5 2 7.5
Кальциевый входящий - 100 10 1.5 - 2 7.5
Натриевый входящий 110 - - 1.5 - 2 7.5
Калиевые выходящие 100 - 2 1.5 5 2 7.5
Внутриклеточные (диализирующие) растворы
Входящие - 120 - - - 2 7.4
Калиевые выходящие - - - - 120 2 7.4
Изолированную живую клетку помещали на полиэтиленовую пипетку, в которой создавали толчки отрицательного гидростатического давления, вследствие чего в области поры мембрана нейрона разрушалась, и создавался электрический контакт неполяризующегося электрода, соединенного с усилителем фиксации потенциала, с внутриклеточным содержимым. При гиперполяризующем сдвиге мембранного потенциала на экране осциллографа были видны емкостные токи мембраны и неспецифический ток утечки, который «вычитали» из общего тока. При переключении тестирующего импульса на деполяризацию регистрировали входящий (натрий-
кальциевый) и выходящий медленный калиевый токи. Перфузирующий раствор, в который добавляли исследуемые вещества, подавали в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий - внутрь этой пипетки.
Изатин и 5-бромизатин (субстанции Sigma, США) растворяли при подогревании и изучали в концентрациях от 10-8 до 10-3 моль/л при внеклеточном и внутриклеточном действии на изолированные нейроны прудовика. Кривые ионных токов визуально оценивали на экране осциллографа, вводили в компьютер и распечатывали на принтере. На основании полученных данных с помощью компьютера были построены зависимости «концентрация-эффект». Последние были обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента и статистического пакета «Excel».
Результаты исследования и их обсуждение
Сводные данные о характере изменений амплитуд натриевых, кальциевых и калиевых ионных токов нейронов в виде зависимостей «концентрация-эффект» при внеклеточном действии представлены на рис. 2 (верхняя диаграмма - для изатина, нижняя - для бромизатина). Видно, что оба вещества во всем диапазоне концентраций дозозависимо, но примерно в одинаковой степени подавляли ионные токи. При этом по силе подавления токов в концентрации 100 и 1000 мкмоль бромизатин несколько (на 10-15 %) превосходил изатин. Эффекты подавления токов развивались быстро (за десятки с), но снимались при отмывании медленнее (за 1-2 мин), что указывает, с одной стороны, на высокую доступность структур ионных каналов для веществ и, с другой стороны, - на невысокую степень связывания. Обратимость эффектов подавления кальциевого тока после 2-3 мин отмывания была до 100-110% от исходных значений.
Рис. 2. Изменения амплитуд ионных токов нейронов прудовика под влиянием изатина и бромизатина в различных концентрациях. Верхняя диаграмма - зависимости «концентрация-эффект» для изатина (п = 6-8), нижняя - для бромизатина (п = 5-7); по оси абсцисс - концентрация, по оси ординат - ионный ток (I - при действии, 10 - контроль), % при р = 95%
Под влиянием обоих препаратов кинетика развития ионных токов не изменялась (рис. ЗА -натриевый ток; рис. ЗВ - кальциевый ток; рис. 4А - калиевый ток), что указывает на отсутствие взаимодействия их молекул с воротными структурами каналов. Вольт-амперные характеристики натрий-кальциевых (рис. ЗБ), кальциевых (рис. ЗЕ) и калиевых медленных (рис. 4Б) каналов при действии изатина и бромизатина изменялись, демонстрируя подавление токов, смещение их максимумов по оси потенциалов вправо, что указывает на изменения потенциала фиксированных зарядов мембраны. Неспецифические токи утечки мембраны под влиянием изатина и бромизатина
в низких концентрациях практически не изменялись, но значительно (до 5 нА) возрастали при их действии в концентрации 1000 мкмоль/л, что указывает на дестабилизацию мембраны.
Влияние изатина и бромизатина на быстрые калиевые каналы подробно не изучали, но несколько наблюдений на 2-3-х нейронах получено. Характер изменений быстрого калиевого тока внешне напоминал таковые для медленного калиевого. Отмывание нейронов также быстро приводило к полному восстановлению токов. Кинетика развития быстрого калиевого тока при действии веществ не изменялась.
Рис. 3. Изменения натриевых (А и Б) и кальциевых (В и Г) ионных токов нейронов прудовика под влиянием бромизатина в различных концентрациях.А - изменения амплитуды и кинетики натриевых токов, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 - 100 мкмоль/л, 3 - 1000; Б - характер изменений вольт-амперных характеристик суммарно натриевых и кальциевых каналов, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 - отмывание, 3 - 10, 4 - 100 и 5 - 1000 мкмоль/л (уменьшение амплитуды натриевых - быстрая начальная часть и кальциевых токов, небольшой сдвиг максимума вправо); В - изменения кальциевых токов, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 -отмывание, 3 - 100 и 4 - 1000 мкмоль/л; Г - изменения вольт-амперной характеристики кальциевых каналов, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 - частичное отмывание, 3 - 1000 мкмоль/л (уменьшение амплитуды и сдвиг максимума вправо); по оси абсцисс А и В - время, Б и Г - потенциал (пилообразное смещение от -40 до 10 мВ за 20 мс); по оси ординат - ионные токи. Поддерживаемый потенциал: -90 шУ
Необходимо также отметить, что изатин и бромизатин при подаче их внутрь клеток с диализирующим раствором в концентрациях 100 и 1000 мкмоль/л не вызывали эффектов, которые проявлялись при их действии с наружной стороны мембраны нейронов.
Рис. 4. Изменения калиевых ионных токов нейронов прудовика под влиянием изатина (А) и бромизатина (Б) в различных концентрациях. А - изменения калиевого медленного тока под влиянием изатина, кривые снизу вверх: 1 - 1000 мкмоль/л, 2 - 100 мкмоль/л, 3 - 10 мкмоль/л, 4 -контроль, 5 - отмывание; Б - изменения вольт-амперных характеристик калиевых медленных каналов под влиянием бромизатина, кривые над стрелкой снизу вверх: 1 - 1000 мкмоль/л, 2 - 100 мкмоль/л (смещение вправо), 3 - контроль, 4 - отмывание; по оси абсцисс: А - время; Б -потенциал (пилообразное смещение от -40 до 30 мВ за 50 мс; по оси ординат - ионные токи. Поддерживаемый потенциал: -90шУ, тестирующий: 30шУ (для А)
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют, что изатин и бромизатин являются активными мембранотропными соединениями, способными менять проводимость натриевых, кальциевых и калиевых ионных каналов нервных клеток [3-5, 15, 16]. Доказательством этому служит обратимое неизбирательное дозозависимое подавление ионных токов во всем диапазоне концентраций. При этом бромизатин несколько превосходит по силе подавления ионных токов изатин. Следует обратить внимание на то, что в целом мембранотропная активность обоих препаратов в их действии на различные ионные каналы была примерно равноэффективной, что характеризует их неизбирательное действие. В этом действии они напоминают эффекты антигипоксантов бемитила и алмида (производные тиобензимидазола), описанные нами ранее [5]. Однако данные антигипоксанты проявляли более слабую мембранотропную активность в концентрациях 100 и 1000 мкмоль/л. Тем не менее, общий тип действия изатина, бромизатина и антигипоксантов на все ионные токи мембран моллюсков был сходным. Следовательно, модулирующее подавляющее действие изатина и 5-бромизатина на ионные каналы, на их проницаемость может лежать в основе их влияния на биопотенциалы клеток, снижая возбудимость клеток или тормозя межнейронные отношения и на функции органов и систем организма.
Список литературы
1. Арчаков А.И., Панова Н.Г., Медведев А.Е., Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Бунеева O.A. Исследование тканевого и субклеточного распределения изатин-связывающих белков при помощи оптического биосенсора // Биомед. химия. - 2008. - Т.54, №4. - С. 471-476.
2. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., Белопольская М.В., Шмальгаузен Е.В., Данилова P.A., Рудько О.И. Индукция аутоиммунитета к эндогенным нейрорегуляторам изатину и холецистокинину - путь к моделированию и коррекции депрессивного поведения // Нейрохимия. - 2006. - №3. - С. 228-233.
3. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д. Цитофармакологическое исследование механизмов действия мембранотропнык средств // Обзоры по клин.фармакол. лек. терапии. - 2003. - Т.2, №1. - С. 14-22.
4. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д., Галенко-Ярошевский П.А., Шабанов П.Д. Мембранотропное действие фармакологических средств. - СПб.-Краснодар: Просвещение-Юг, 2010. - 528 с.
5. Вислобоков А.И., Марышева В.В., Шабанов П.Д. Мембранные механизмы действия антигипоксантов бемитила и алмида на нейроны моллюсков // Эксперим. и клин.фармакология. - 2003. - Т.66, №6. - С. 911.
6. Глоба А.Г., Гловер В., Медведев А.Е. Изатин выпытает быстрое накопление АТР в синаптосомах: возможное значение при стрессе и регуляции рецепторов натрийуретических пептидов // Биомед. хим. -2008. - Т. 54, №4. - С. 471-746.
7. Жунгиету Г.И., Рехтер М.А. Изатин и его производные / Под ред. А.Б.Томчина. - Кишинев: Штиица, 1977. - 228 с.
8. Костюк П.Г., Крышталь О.А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М.: Наука, 1981. - 207 с.
9. Кудряшов И.Е., Кудряшова И.В., Гловер В., Медведев А.Е. Влияние изатина на электрическую активность клеток гиппокампа крыс // Журн. высш. нервн. деятельности. - 2001. - Т.51, №1. - С. 52-55.
10. Марышева В.В., Губанов А.И., Умаров С.З., Шабанов П. Д. Исследование механизмов актопротекторного действия производнык тиазоло[5,4-Ь]индола методом ВЭЖХ // Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение. - Томск: СибГМУ, 2010. - С.192-194.
11. Медведков А.Е., Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н., Аксенова Л.Н., Бунеева О.А., Капица И.Г. Влияние длительного введения мышам изатина и гимантана на чувствительность моноаминоксидазы Б мозга к ингибированию депренилом in vivo и in vitro // Биомед. химия. - 2004. - Т.50, №5. - С.509-513.
12. Медведков А.Е., Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Бунеева О.А., Медведкова М.В., Гловер В. Взаимодействие пируваткиназы с изатином и депренилом // Биомед. хим. - Т.52, 2006. - №4. - С.413-418.
13. Панова Н.Г., Медведев А.Е., Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Бунеева О.А., Медведева М.В. Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа - изатинсвязывающий белок цитозоля // Биомед. химия. - 2003. - Т.49, №6. -С.627-631.
14. Самусь Н.М., Шляхов Э.Н., Бурденко Т.А., Симонова Л.Л., Цапков В.Н. Координационные соединения меди (2+) и никеля (2+) с а-семикарбазонами изатина и 5-бромизатина и их противомикробная активность // Хим.-фарм. журнал. - 1985. - №6. - C. 705-709.
15. Narahashi T. Neuroreceptors and ion channels as the basis for drug action: past, present, and future // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2000. - V.294, N1. - P. 1-26.
16. Ragsdale D.S., McPhee J.C., Scheuer T., Catterall W.A. Common molecular determinants of local anesthetic, antiarrhythmic and anticonvulsant block of voltage-gated Na channels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. -V.93. - P. 9270-9275.
