CC BY
11ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
С.А.Афанасьев, И.Н.Свиридов, В.П.Шахов, Л.П.Фалалеева, Д.С.Кондратьева, С.В.Попов
ВЛИЯНИЕ ИНТРАМИОКАРДИАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА ЭЛЕКТРОМЕХАНИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫС ПОСЛЕ КРИОДЕСТРУКЦИИ МИОКАРДА
ГУ НИИ кардиологии, Томского научного центра СО РАМН, Россия
C целью исследования влияния интрамиокардиальной трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга на экстрасистолическое и постэкстрасистолическое сокращение миокарда крыгс перенесших деструктивное воздействие на сердечную мышцу выполнены опыты на 34 крысах линии Wistar.
Ключевые слова: клеточная трансплантация, костный мозг, мононуклеары, кардиомиоциты, электромеханическое сопряжение, криодеструкция
To study the effect of intramyocardial transplantation of mononuclear cells of bone marrow on extrasystolic (premature) and post-extrasystolic contractions of myocardium of rats after destruction, the experiments were carried out on 34 Wistar rats.
Key words: cell transplantation, bone marrow, mononuclear cells, cardiomyocytes, electro-mechanical coupling, cryodestruction.
В последние годы ведутся активные исследования по изучению возможности использования клеточных технологий в лечении сердечно-сосудистых заболеваний [1, 2, 14]. Особенно перспективным представляется трансплантация клеток костного мозга при лечении ише-мической болезни сердца (ИБС) и её острой формы -инфаркта миокарда (ИМ) [1, 7, 8]. Однако наряду с позитивными данными, опубликован целый ряд работ, авторы которых отмечают негативное влияние клеточной трансплантации. В частности показано, что трансплантация мононуклеаров при лечении ИМ оказывает про-аритмогенный эффект, провоцируя желудочковые аритмии [9, 10].
Хорошо известно, что большинство заболеваний сердечной мышцы сопровождается нарушением процесса электромеханического сопряжения в кардиомиоци-тах. При этом нарушение внутриклеточного гомеостаза ионов Са, в том числе на уровне саркоплазматического ретикулума рассматривается как один из важных механизмов аритмогенеза [13, 15]. С учетом этого, целью данной работы было исследовать влияние интрамиокар-диальной трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга на экстрасистолическое и постэкстрасисто-лическое сокращение миокарда крыс перенесших деструктивное воздействие на сердечную мышцу.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на папиллярных мышцах, выделенных из левого желудочка восьми интакт-ных крыс-самцов линии Wistar массой 200-250 г. Перед началом эксперимента животных, находящихся под легким эфирным наркозом, обездвиживали смещением шейного отдела позвоночника. После вскрытия грудной клетки, сердце иссекали и помещали в охлажденный физиологический раствор Кребса-Хейзелянта следующего состава (в мМ): NaCl - 120; KCl - 4,8; CaCl2 - 2,0; MgSO4 - 1,2; KH2PO4 - 1,2; NaHCO3 - 20,0; глюкоза -© С.А.Афанасьев, И.Н.Свиридов, В.П.Шахов, Л.П.Фалалеева, Д.С.Кондратьева, С.В.Попов
10,0. После отсечения предсердий, вскрывали полость левого желудочка и выделяли папиллярную мышцу. К концам мышцы привязывали капроновые петли, с помощью которых ее закрепляли в термостабилизируемой проточной камере. Один конец мышцы фиксировали неподвижно на крючке в стенке камеры, а второй - закрепляли на штоке изометрического датчика, в качестве которого использовали механотрон 6МХ1С [3]. Перфузию осуществляли физиологическим раствором, окси-генированным карбогеном (О2 - 95%, СО2 - 5%) при 36±0,5 оС. Стимуляцию мышцы проводили электрическими импульсами прямоугольной формы длительностью 5 мс, подаваемыми на два массивных серебряных электрода. Базовая частота стимулирующих импульсов составляла 0,5 Гц.
Состояние электромеханического сопряжения в клетках миокарда оценивали по реакции мышц на тестирующее воздействие осуществляемое внеочередным электрическим импульсом (экстрасистолическое воздействие), имеющим те же характеристики, что и импульсы базовой стимуляции. Эти воздействия производили в интервале 0,2-0,5 секунды от начала регулярного стимулирующего импульса. Возбудимость сарколеммы оценивали по изменению цикла сокращение-расслабление в ответ на экстрасистолическое воздействие, а способность саркоплазматического ретикулума аккумулировать ионы Са+2, дополнительно поступающие при этом в миоплазму, оценивалась по изменению параметров по-стэкстрасистолического сокращения [14].
В эксперименты были включены папиллярные мышцы 24 животных. Восемь животных были интакт-ными, а остальным была выполнена криодеструкция стенки левого желудочка. Животным под лёгким эфирным наркозом вскрывали грудную полость и перикард, металлическим стержнем диаметром 6 мм охлажденным до температуры жидкого азота промораживали стенку левого желудочка [4]. Рану, обработав антибио-
Рис. 1. Типичный вид сердец исследуемых групп животных, где А - сердце интактной крысы; Б -сердце животного через 39 дней после криодеструк-ции (стрелкой указан рубец сформировавшийся на месте криодеструкции стенки левого желудочка).
тиком и удалив воздух из грудной полости, послойно ушивали [3]. Через 9 суток им повторно вскрывали грудную полость и интрамиокардиально вводили 100 мкл культуральной среды. При этом, 8-ми животным вводили среду содержащую 1-2х106 кл/мл минонуклеаров костного мозга [4]. Введение проводили в 5-6 точек при-некротической зоны по периметру поражения. После повторной операции, животные, в течение 30 дней, содержались в условиях вивария. К этому сроку (рис.1) у оперированных животных формировался рубец в зоне криоповреждения и развивалась гипертрофия левого желудочка.
Мононуклеарные клетки используемые для трансплантации выделяли из костного мозга бедренных костей 3-х дополнительных животных. Костный мозг гомогенизировали, продавливая через капроновую сеточку с диаметром ячеек 100 мкм. Полученную массу центрифугировали 20 минут при 2000 об/мин. Суспензию клеток разделяли на градиенте плотности 1,077 г/см3. Сформировавшийся слой клеток, снимали и отмывали от градиента средой RPMI-1640 содержащей бычий сывороточный альбумин. Оценивали жизнеспособность мононуклеаров и общую клеточность полученного материала [5, 11].
Результаты экспериментов обрабатывали с помощью компьютерной программы 6.0», достоверность полученных результатов оценивали по критерию Вилкоксона.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Типичный вид кривых изометрического сокращения, регистрируемых в ходе эксперимента представлен на рис. 2. Из рисунка видно, что экстрасистолическое воздействие сопровождалось расширением цикла сокращение-расслабление за счет появлением на его заднем фронте дополнительной волны (экстрасистолическое сокращение). При экстрасистолах отстоящих от начала регулярного стимула, на 0,25 с, у интактных животных
эта волна имела выраженный максимум. Результаты статистической обработки параметров изометрических сокращений, полученных при экстрасистолическом воздействии, представлены в табл. 1.
По нашим данным, максимум амплитуды экстрасистолического сокращения на воздействие оказанное через 0,25 с, составлял 31,0±0,8% от амплитуды регулярного цикла. У животных с контрольным криопов-реждением выраженные экстрасистолические сокращения появлялись уже при 0,225 с интервале между импульсами. При этом, амплитуда экстрасистолического сокращения даже превышает значения полученные для интактных животных при воздействии с интервалом в 0,25 с. В группе животных которым были трансплантированы мононуклеарные клетки наблюдался практически тот же эффект. Выраженный максимум экстрасистолического сокращения регистрировался при 0,225 с интервале между импульсами.
В соответствии с современными представлениями об электромеханическом сопряжении [14], наблюдаемые при экстрасистолических воздействиях изменения заднего фронта кривой изометрического сокращения, связаны с поступлением в миоплазму дополнительного Са+2 из экстрацеллюлярного пространства. Считается, что сократительный ответ сердечной мышцы будет отсутствовать, если стимулирующий импульс попадает в 3-ю фазу потенциала действия [6]. Однако такой электрический импульс инициирует поступление из экстрацел-люлярного пространства в миоплазму кардиомиоцитов дополнительных ионов Са+2. Эти ионы депонируются в саркоплазматическом ретикулуме и участвуют в следу-
Рис. 2. Реакция папллярных мышц на экстрасистолическое воздействие: а - регулярное сокращение; б - изменения формы кривой под действием экстрасистолического импульса через 0,25 с от начала регулярного стимула; в - постэкстрасисто-лическое сокращение.
Таблица 1.
Влияние экстрасистолического воздействия на выраженность экстрасистолического сокращения папиллярных мышц крыс (М±т)
ЭС Группы животных
Интактные Криодеструкция Мононуклеары
0,2 с
0,225 с 38±1,7%* 39±7,6%*
0,25 с 31±0,8% 45±2,7%* 46±6,3%*
0,5 с 50±0,9% 62±2,7%* 59±4,5%*
где ЭС - задержка экстрастимула, данные приведены в процентном отношении к величине амплитуды регулярного сокращения; * - значимые различия (р<0,05) по сравнению с группой интактных животных
щт
Рис. 3. Характеристики постэкстрасистолическо-го сокращенияпри задержке экстрастимула 0,2 с, где Т - амплитуда сокращения, (+dT/dt) и (^ТМ^ -скорости сокращения и расслабления, соответственно; 1 - интактные животные; 2 - животные с контрольным криоповреждеием; 3 - криоповреж-дение с последующей трансплантацией мононук-леаров. Данные приведены в процентном отношении к величине соответствующих попазателей регулярного сокращения принятых за 100%; * -отличие относительно контроля (р<0,05); # -отличие относительно криоповреждения (р<0,05).
ющем цикле сокращение-расслабление. Функциональным проявлением этого явления служит эффект постэк-страсистолической (ПЭС) потенциации инотропного ответа сердечной мышцы (рис. 2). В нашем исследовании, максимальные увеличения амплитуды ПЭС циклов наблюдались при использовании 0,2 с интервала между импульсами. У интактных животных (рис. 3) увеличение составляло в среднем 39±2,2% по сравнению с амплитудой регулярного цикла сокращение-расслабление.
У животных перенесших криодеструкцию миокарда, реакция ПЭС цикла была иной, его амплитуда увеличилась только на 15±3,8%. В группе животных, которым после криодеструкции проводили трансплантацию мононуклеаров, максимум потенциации амплитуды ПЭС практически полностью совпал с таковым в группе интактных животных и составил в среднем 37±4,2%. Скоростные характеристики ПЭС цикла, у этих животных,
так же соответствовали значениям полученным у ин-тактных животных, а величина (^Т/Ш), да же несколько превышала их.
Поскольку при трансплантации мононуклеарной фракции костного мозга в ней содержится незначительное число стволовых клеток полученный результат не определяется пролиферативной и дифференцировочной способностью трансплантируемых клеток. Скорее всего, он обусловлен действием биологически активных веществ синтезируемых и выделяемых трансплантируемыми клетками [14]. В связи с этим, видимо, следует согласиться с тем, что трансплантация клеток мононук-леарной фракции костного мозга представляется более предпочтительным, как по их способности продуцировать биологически активные вещества, так и по относительной простоте получения [1].
Случаи возникновения аритмий отмеченные после трансплантации клеток, требуют самого тщательного анализа. Так, в работе Lunde К. с соавт. было использовано интракоронарное введение клеток [10]. Известно, что ишемическое поражение сердца и в том числе ИМ снижает электрическую стабильность клеток сердечной мышцы и провоцирует нарушения сердечного ритма. Вполне вероятно, что причиной аритмий в этом исследовании могло быть несовершенство техники введения клеток и индивидуальная реакция на саму процедуру. Можно предположить, что аритмии являются результатом реакции миокарда на ускоренное развития воспалительного процесса под влиянием цитокинов вырабатываемых трансплантируемыми клетками [16].
Таким образом, можно заключить, что интрамио-кардиальная трансплантация мононуклеаров костного мозга после деструктивного поражения миокарда, способна позитивно влиять на процесс электромеханического сопряжения в клетках миокарда. Трансплантация мононуклеаров обеспечивает сохранность внутриклеточных Са+2-транспортирующих систем связанных с сар-коплазматическим ретикулумом. Наблюдаемые эффекты, скорее всего, обусловлены действием биологически активных веществ, вырабатываемых трансплантируемыми клетками.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили С.Т., Алекян Б.Г., и др.. Острый коронарный синдром и клеточные технологии. // Вестник Российской АМН. 2005, №4, С.65-69.
2. Вермель А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике. // Клиническая медицина. 2004, №1, С.5-11.
3. Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П., Шахов В.П. Инотропная реакция миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом на экстрасистолическое воздействие. // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 2005, Т.139, №6, С.613-616.
4. Онищенко Н.А., Потапов И.В., Башкина Л.В., и др. Восстановление сократительной функции криоповреж-денного миокарда крысы после трансплантации феталь-ных кардиомиоцитов и преддифиренцированных стро-мальных клеток костного мозга. // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 2004,Т.138, №10, С.403-407.
5. Руководство к практическим занятиям по гематологии: учебное пособие / Новицкий В.В., Уразова О.И., Хлусова М.Ю // Томск: изд-во Том. Ун-та, 2005.-150с.
6. Соловьева О.Э., Мархасин В.С., Цывьян П.Б., Келлер Б.Б. Экспериментально-теоретическое исследование связи интервал-сила в развивающемся миокарде цыпленка. // Биофизика. 1999, Т.44, В.2, С.337-349.
7. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А. и др. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда. // Российский кардиологический журнал. 2003, Т.43, №5, С.42-50.
8. Hamano K., Nishida M., Hirata K., et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapentic an-giogenesis in patients with ishemic heart disease: clinical trial and preliminary results. // Jpn. Circ. J. 2001, V.65,
P.845-847.
9. Kolettis T.M. Arrhythmogenesis after cell transplantation post-myocardial infarction. Four burning questions-and some answers. // Cardiovasc Res. 2006, V.69, №2, P.299-301.
10. Lunde K., Solheim S., Aakhus S., et al. Autologous stem cell transplantation in acute myocardial infarction: The ASTAMI randomized controlled trial. Intracoronary transplantation of autologous mononuclear bone marrow cells, stady design and safety aspects. // Scand Cardiovasc J. 2005, V.39, №3, P.150-158.
11. Makino S, Fukuda K, Miyoshi S et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. // J. Clin Invest. 1999, V.103, P.697-705.
12. Marengo F.D., Márquez M.T., Bonazzola P., Ponce-Hornos J.E. The heart extrasystole: an energetic approach. // Amer. J. Physiol. 1999, V.276, H.309-316.
13. Nuss H.B., Kaab S., Kass D.A. et al. Cellular basis of ventricular arrhythmias and abnormal automaticity in heart failure.// Amer.J.Physiol. 1999, V.277, H.80-91.
14. Pountos I, Giannoudis P.V. Biology of mesenchymal stem cells. // Injury. 2005, V.36, Suppl 3, P.8-12.
15. Priori S.G., Barhanin J., Hauer R.N.W. et al. Genetic and molecular basis of cardiac arrhythmias (Impact on clinical management).// European Heart Journal. 1999, V.20, C. 174-195.
16. Young H.E., Duplaa C., Romero-Ramos M., et.al. Adult reserve stem cells and their potential for tissue engineering. // Cell Biochem Biophys. 2004, V.40, №1, P.1-80.
ВЛИЯНИЕ ИНТРАМИОКАРДИАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА ЭЛЕКТРОМЕХАНИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫС ПОСЛЕ
КРИОДЕСТРУКЦИИ МИОКАРДА
С.А.Афанасьев, И.Н.Свиридов, В.П.Шахов, Л.П.Фалалеева, Д.С.Кондратьева, С.В.Попов
Исследовано влияние интрамиокардиальной трансплантации мононуклеаров костного мозга на экстрасистолическое и постэкстрасистолическое сокращение изолированных папиллярных мышц крыс после криодеструкции миокарда. Мышцы сокращались в изометрическом режиме при частоте электрической стимуляции 0,5 Гц и 36±0,5 0С. Экстрасистолическое сокращений папиллярных мышц вызывали дополнительным электрическим импульсом, через 0,2 - 0,5 с после начала регулярного стимула. Установлено, что через 30 суток после криодеструкции, кардио-миоциты функционально активного миокарда характеризуются повышенной возбудимостью сарколеммальной мембраны и нарушенной Са2+-аккумулирующей способностью саркоплазматического ретикулума (СПР). Интра-миокардиальное введение мононуклеаров (1-2х106кл/мЛ) через 9 суток после повреждения миокарда не влияло на изменение возбудимости сарколеммальной мембраны, но предупреждала дисфункцию СПР как основного депо Са2+ в клетке. Сделан вывод, что интрамиокардиальное введение мононуклеаров не ухудшает электрической стабильности миокарда после деструктивного поражения, и может обеспечить более быструю нормализацию электромеханического сопряжения в за счет полноценного функционирования Са2+-транспортирующих систем СПР.
EFFECT OF INTRAMYOCARDIAL TRANSPLANTATION OF BONE-MARROW MONONUCLEAR CELLS ON ELECTRO-MECHANICAL COUPLING OF RAT CARDIOMYOCYTES AFTER MYOCARDIAL
CRYODESTRUCTION
S.A. Afanas'ev, I.N. Sviridov, V.P. Shakhov, L.P. Falaleeva, D.S. Kondrat'eva, S.V. Popov
The effect was studied of intramyocardial transplantation of mononuclear cells of bone marrow on extrasystolic (premature) and post-extrasystolic contractions of isolated papillary muscles of rats after myocardial cryodestruction. Muscles contracted isometrically under electric stimulation (0.5 Hz, 36±0.5 °C). Premature contractions of papillary muscles were produced by an additional electric stimulus (0.2-0.5 s after the onset of regular stimulus). It was shown that, 30 days after cryodestruction, cardiomyocytes of functionally active myocardium are characterized by an increased excitability of sarcolemma membrane and an altered Ca2+-accumulating ability of the sarcoplasmic reticulum (SPR). The intra-myocardial administration of mononuclear cells (1-2Ч106 cells/mL) 9 days later the myocardial injury did not affect the sarcolemma membrane excitability but prevented the dysfunction of SPR as a main depot of Ca2+ in cell. It was concluded that intramyocardial administration of mononuclear cells does not alter the electric stability of myocardium after its damage and could provide a faster recovery of electro-mechanical coupling at the expense of full-value functioning of Ca2+-transporting systems of SPR.
