CC BY
12УДК 615.214.099.036.11
С.М.Горбунов, В.С.Резник
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ У МЫШЕЙ НА ОСТРУЮ ТОКСИЧНОСТЬ НЕКОТОРЫХ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ ВЕЩЕСТВ
Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова Казанского научного центра РАН, Казань
Обнаружен синергизм в отношении острой токсичности 1,3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пен-тил]-6-метилурацилдибромида (соединение 547), оксазила и прозерина при предварительном введении изопро-пилпирофосфорамида и диизопропилфторфосфата. Делается вывод о функциональной значимости бутирилхо-линэстеразы и паттернов ацетилхолинэстеразы, недоступных действию четвертичных ониевых соединений, в реализации острой токсичности изученных антихолинэстеразных веществ.
Ключевые слова: ингибиторы ацетилхолинэстеразы, алкиламмониевые производные 6-метилурацила, острая токсичность, ингибирование бутирилхолинэстеразы.
Введение. В последние годы широко изучаются различные аспекты механизма действия нового класса ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХЭ; К.Ф.3.1.1.7) — алкиламмониевых производных 6-метилурацила [1, 2]. Биохимические особенности (аномалий) отмечены в ряду производных 6-метилурацила, содержащих тет-раалкиламмониевые группы при N1 и N3 атомах пиримидинового цикла, а именно: избирательная, прогрессирующая во времени, инги-бирующая активность в отношении АХЭ (k0 = 7,6-108—3,5-109М-1мин-1) в 10000-100000 раз более высокая, чем в отношении бутирилхолин-эстеразы (БХЭ; К.Ф. 3.1.1.8.2) необратимый тип ингибирования на препаратах АХЭ теплокровных и обратимый — на препаратах АХЭ холоднокровных. При этом наличие или отсутствие аномалий существенно зависит от структуры аммониевых и N-гетероциклических фрагментов молекул, а также от того, с каким из двух атомов азота урацилового цикла (N1 или N3) связан бензилдиэтилпентиламмониевый фрагмент [3]. В результате изучения эффектов соединения 547 на амплитудно-временные параметры миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) в m. extensor digitorum longus, m. soleus и m. diaphragma крысы установлено, что указанное соединение уже в наномолярных концентрациях вызывает признаки необратимого инги-бирования синаптической АХЭ, увеличивая амплитуду и длительность МПКП [4]. Подобное действие обнаружено и в опытах на синапсах лягушки [5]. Кроме того, для некоторых соединений, например оксазила, характерно специфическое взаимодействие с «периферическим ани-
онным пунктом» (ПАП) ацетилхолинэстеразы, что представляет возможность дополнительного прироста в избирательности связывания с АХЭ [8], подобный эффект характерен и для соединения 547. Уникальной особенностью исследованных нами алкиламмониевых производных 6- ме-тилурацила является то, что они оказывают мио-релаксантный эффект в дозах, далеко отстоящих от летальных DE50/DL50, составляет более 100 в опытах на крысах и мышах. При этом, установлено, что синапсы локомоторных мышц имеют более высокую чувствительность к ингибирова-нию АХЭ соединения 547 по сравнению с диафрагмой [6]. Это позволяет лучше понять природу «избирательной миорелаксации», феномена выявленного нами ранее. Мы предположили, что в феномене избирательной миорелакса-ции важную роль играют фармакодинамические особенности ингибирования как ацтилхолин-эстеразы, так и бутирилхолинэстеразы (БХЭ) в участках действия локомоторных и дыхательных мышц. В связи с этим, представляется интересным изучить как влияет ингибирование БХЭ на острую токсичность соединения 547 в сравнении с карбаматами, ониевыми и ФОС ингибиторами АХЭ.
Материалы и методы исследования. Исследовали острую токсичность комбинаций антиаце-тилхолиэстеразных соединений с избирательным (изо-ОМПА — изопропил-пирофосфора-мид) и неизбирательным (ДФФ — диизопропил-фторфосфат) ингибиторами холинэстераз (ХЭ).
Использованы коммерческие препараты ди-изопропилфторфосфат (ДФФ, Sigma) как неселективный модельный ингибитор холинэс-
Таблица 1
Зависимость острой токсичности комбинации изо-ОМПА с соединением 547 от дозы на мышах
Доза изо-ОМПА (мг/кг)* DL50, мкг/кг КИТ**
0 1000 (870 + 1100) -
0,5 72 (44 + 97) 13,9
1,0 30 (24 + 37) 33,3
2,0 21 (18+24) 47,6
5,0 17 (13+22) 58,8
10,0 5,3 (3,8 + 7,3) 189
50,0 13 (10,4 + 16,5) 77
Примечание. Здесь и в табл. 2—5: * — раствор изо-ОМПА вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл/10 г массы за 2 ч до титрования токсичности соединения 547
** — КИТ — отношение DL50 базового препарата, в частности, в данных опытах — соединения 547 к DL50 комбинации (изо-ОМПА + соединение 547)
тераз, тетра-изопропилпирофосфорамид (изо-ОМПА, Sigma) — как селективный ингибитор БХЭ, антиАХЭ препараты — прозерин метил-сульфат [N-мета-диметилкарбомоилоксифенил) триметиламмоний метилсульфат], эзерин, ГД-42 [О-этил^(этилтиоэтил)метилфосфоната метилсульфат], оксазил [^№-бис-(2-диэтилами-ноэтил)-оксамида-бис-(орто-хлорбензилхло-рид)] и соединение 547 — 1,3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пентил]-6-метилурацил-дибромид. Препарат вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл/10 г массы экспериментального животного.
Каждая доза (комбинация) исследована на 10 мелких лабораторных животных. Для определения острой токсичности — DL50 брали не менее 5 доз (комбинаций).
Смертность регистрировали в течение 24 ч. В опыты брали половозрелых беспородных мышей, крыс, морских свинок, которых до и во время эксперимента содержали на стандартном рационе вивария в стандартных условиях. Эксперименты проводили с 930 до 1100 утра. В экспериментальные группы животных отбирали по методу случайных выборок. Обработку результатов исследования проводили методом вариационной статистики с использованием t-крите-рия Стьюдента, а также с помощью программы ToxCalc™ v. 5.0.23F (Tidepool Scientific Software; U.S. Environmental Protection Agency).
Результаты и обсуждение. В серии опытов на мышах изучали зависимость острой токсичности соединения 547 в зависимости от дозы изо-ОМПА (табл. 1). Показано, что избирательный ингибитор бутирилхолинэстеразы потенцирует токсичность соединения 547, при этом до-
за изо-ОМПА, дающая наибольшую потенциа-цию составляет 10 мг/кг, что составляет 1/12 от БЬ50, и в дальнейших экспериментах будет использована эта доза. При увеличении дозы изо-ОМПА до 50 мг коэффициент изменения токсичности (КИТ) снижался — по видимому за счет вовлечения собственного токсичного действия в механизм острой токсичности комбинации.
Потенцирование токсичности соединения 547 наблюдается во всех исследованных временных интервалах, максимальные значения — в интервале от 1 до 6 ч (табл. 2). При одновременном введении и при суточном интервале КИТ в два раза меньше, что обусловлено, на наш взгляд, не полным ингибированием БХЭ.
Таблица 2
Влияние интервала между инъекцией изо-ОМПА и титрованием токсичности соединения 547 на острую токсичность комбинации у мышей
Время от введения раствора изо-ОМПА до аппликации соединения 547 (час)* DL50, мкг/кг КИТ
0 (в одном шприце) 10,8 (7,8- 13,5) 93
1 5,2 (3,1 + 8,9) 192
2 5,3 (3,8 + 7,3) 189
3 5,3 (3,3+ 8,6) 189
6 5,9 (3,9 + 9,3) 169
24 12,0 (8,7 + 15,9) 83
Избирательное ингибирование БХЭ не приводило к существенному изменению КИТ комбинаций с карбаматными и фосфорорганиче-скими ингибиторами ХЭ, но давало эффект синергизма как с соединением 547, так и с оксази-
лом, являющимся также ониевым антихолинэс-теразным препаратом (табл. 3). Таким образом, можно предполагать наличие общих механизмов реализации острых токсических эффектов оксазила и аликиламмониевых производных 6-ме-тилурацила, связанных с особенностями ингибирования холинэстераз в критичных участках действия. Аддитивный эффект комбинации изо-ОМПА с прозерином и ГД-42 на острую токсичность связан, по нашему мнению, с избирательным действием этих соединений в отношении АХЭ, и незначительным влиянием на БХЭ. Эзе-рин и ДФФ — являются неизбирательными ингибиторами ХЭ в организме экспериментальных животных, в связи с чем, не показали изменения острой токсичности. Примечательно, что все четвертичные аммониевые соли (прозерин, оксазил и соединение 547) повышали свою токсичность при предварительном ингибировании БХЭ.
Таблица 3
Острая токсичность различных антихолинэстеразных агентов у мышей при предварительном введении изо-ОМПА
Соединение dl50, мг/кг DL50 на фоне изо-ОМПА, мг/кг* КИТ Достоверность различий (Р)
Прозерин 0,51 0,12 4,3 < 0,01
Эзерин 0,52 0,39 1,3 > 0,05
ГД-42 0,086 0,0163 5,3 < 0,01
ДФФ 3,6 3,6 1,0 > 0,5
Оксазил 6,0 0,042 143 < 0,001
Соединение 547 1,0 0,0052 192 < 0,001
Следующие эксперименты были проведены с неизбирательным ингибитором холинэстераз — ДФФ, фосфорилирующим как АХЭ, так и БХЭ.
Проведено титрование токсичности комбинации с соединением 547 в широком ранге концентраций (табл. 4).
Таблица 4
Влияние дозы ДФФ на потенцирование острой токсичности его комбинации с соединением 547 у мышей
Доза ДФФ, мг/кг* DL50, мкг/кг КИТ
0 1000 (870+1100) -
0,45 290 (200+420) 5,6
0,6 44 (34 + 59) 37,1
1,2 13 (9,1 + 19) 125,5
1,8 9,6 (5,8 + 16) 170
2,5 38 (25 + 57) 43
* — ДФФ вводили мышам внутрибрюшинно за 30 мин до титрования токсичности соединения 547
Таблица 5
Влияние интервала времени между инъекцией ДФФ и титрованием токсичности соединения 547 на летальность комбинации у мышей
Время от введения ДФФ до аппликации соединения 547, час* DL50, мкг/кг КИТ
0 (в одном шприце) 6,4 (4,4 + 9,5) 255
0,25 5,5 (3,4 + 9,0) 297
0,5 9,6 (5,8 + 16) 170
1,0 7,4 (4,5 + 12) 221
2,0 5,8 (3,7 + 9,2) 280
4,0 8,8 (7,2 + 10,6) 186
24 12,4 (9,9 + 15,5) 132
72 21,3 (15,9+28,5) 77
168 1420 (1030 + 1950) 1,15
* — ДФФ вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 1,8 мг/кг
Во всех исследованных дозах ДФФ потенцировал токсичность соединения 547, максимальное потенцирование наблюдалось в дозе 1,8 мг/кг, что составляет примерно 1/3 DL50 (эта доза ДФФ — не вызывает смертности у мышей, при наблюдении в течение 24 ч), меньший эффект, наблюдаемый при дозе ДФФ 2,5 мг/кг, объясняется большим вкладом в летальность этого ингибитора.
Максимальное потенцирование острой токсичности соединения 547 наблюдалось в интервале до 4 часов, с последующим ослаблением действия к 3-м суткам и отсутствием эффекта — при интервале 7 суток (табл. 5). Потенцирование токсичности соединения 547 в данном случае на 45—55% большее, чем при использовании избирательного ингибитора.
Роль АХЭ в синаптической передаче хорошо изучена и четко установлена, в то же время мало известно о физиологической роли БХЭ. Известно, что аддитивный эффект наблюдается при действии соединений на общие участки действия однонаправлено, разнонаправленное действие при этом даст антагонизм и как следствие снижение суммарного эффекта. Синергизм предполагает наличие дополнительных мишеней, на которые не действует одно из соединений комбинации. Допуская, что как изо-ОМ-ПА, так и ДФФ одинаково проникают в синапсы как локомоторных, так и дыхательных мышц и ингибируют БХЭ и ХЭ соответственно, и дают синергизм с соединением 547 (и оксазилом) можно предполагать участие дополнительных
мишеней действия, на которые не действует соединение 547.
Заключение. Данные, полученные нами, продемонстрировавшие синергизм в отношении острой токсичности как при действии избирательного (изо-ОМПА), так и неизбирательного ингибитора БХЭ (ДФФ) проливают свет на участие БХЭ как важного защитного механизма в функционировании нервно-мышечного синапса, который включается при ингибировании си-наптической АХЭ. И этими мишенями являются холинэстеразы, которые резистентны к действию соединения 547. В то же время более выраженный синергизм, проявляемый комбинацией соединения 547 и ДФФ, позволяет предполагать наряду с важностью БХЭ, также и наличие паттернов АХЭ, недоступных действию соединения 547. Поскольку соединение 547 проявляет избирательность в отношении ингибиро-вания АХЭ локомоторных мышц по сравнению с диафрагмой, то возможно ХЭ диафрагмы могут являться этими дополнительными мишенями, обеспечивающими синергизм токсического действия. Результаты подтверждаются исследованиями [7], показавшими, что на генетической линии мышей, лишенных АХЭ, спонтанная квантовая секреция медиатора мало изменяется при ингибировании БХЭ селективным ингибитором изо-ОМПА как у нормальных, так и у лишенных АХЭ мышей, а вызванная квантовая секреция значительно снижается. В то же время нельзя исключить и возможное дополнительное участие ингибирования ХЭ центральных синапсов в механизме реализации токсичности комбинаций оксазила и соединения 547 (оба соединения являются четвертичными солями и априори плохо проникают через ГЭБ) с изо-ОМПА.
Список литературы
1. Резник В.С., Аникиенко К.А., Курочкин В.К. и др. Новый класс ингибиторов холинэстераз: тет-
раалкиламмониевые производные 6-метилурацила и аллоксазина // Доклады РАН, 1998. — Т. 362. — № 1. — С. 68-70.
2. Аникиенко К.А., Бычихин Е.А., Курочкин В.К. и др. Новый класс ингибиторов холинэстераз — тетраалкиламмониевые производные 6-метилура-цила: особенности взаимодействия с холинэстера-зами разных групп животных // Там же, 2001. — Т. 376. — № 6. — С. 818-822.
3. Аникиенко К.А., Бычихин Е.А., Курочкин В.К. и др. Новый класс ингибиторов холинэстераз — тетраалкиламмониевые производные 6-метилура-цила: особенности взаимодействия с холинэстера-зами разных групп животных // Там же, 2001. — Т. 376. — № 6. — С. 818-822
4. Ковязина И.В. и др. Особенности действия тетраалкиламмониевого производного 6-метил-урацила на потенциалы концевой пластинки мышц разного функционального типа // Там же, 2004. — Т. 399. — № 5. — С. 712-714
5. Горшкова О.В. и др. Влияние тетраалкиламмониевого производного 6-метилурацила на амплитудно-временные параметры миниатюрных потенциалов концевой пластинки в нервно-мышечном синапсе лягушки // Бюлл. экспер биол. и медицины, 2001. — Т. 131. — № 5. — С. 527-531.
6. Петров К.А. Исследование механизма действия тетраалкиламмониевого прозводного 6-ме-тилурацила в синапсах дыхательной и локомоторных мышц крысы. Дисс. канд. биол. наук. — Казань,
2006. -116 с.
7. Girard E., Bernard V., Krejci E. et al. Butyryl-cholinestrase and the control of synaptic responses in acetylcholinesterase knockout mice // Life Sciences,
2007. — V. 80. — P. 2380-2385
8. Моралев С.М., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных (обзор) //Ж. эволюционной биохимии и физиологии, 1999. — Т. 35. — № 1. — С. 3-14.
Материал поступил в редакцию 19.06.08.
S.M.Gorbunov, V.S.Reznik
IMPACT OF INHIBITION OF BUTYRYLCHOLINESTERASE (BCHE) ON ACUTE TOXICITY OF CERTAIN
ANTICHOLINESTERASE SUBSTANCES IN MICE
A.Ye. Arbuzov Institute for Organic and Physical Chemistry, Russian Academy of Sciences, Kazan
Synergism was found out in relation to acute toxicity of 1,3-bis[5(diethyl-o-nitrobenzyl-ammonio)pentyl]-6-metyluracyldi-bromid (compound 547), okazil, prozerin at a preliminary administration of isopropylpyrophosphoroamide and diisopropylfluoro-phosphate. A conclusion was jumped to about functional significance of BChE and acetylcholinesterase patterns not subject to the exposure to quaternary onium compounds in the manifestation of acute toxicity of anticholinesterase substances under investigation.
