CC BY
66
© КАДРИЧЕВА Т.Г., МАНЧУК В.Т.
УДК 616.155.392.053.2
ВЛИЯНИЕ IN VITRO ПРЕПАРАТА ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ
ЛЕЙКОЗОМ Т.Г. Кадричева, В. Т. Манчук НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск, директор -член-корр. РАМН, заслуж. деятель науки РФ В. Т. Манчук.
Резюме. Проведено исследование функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов методом люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Выявлено, что при миелотоксических осложнениях повышена генерация активных форм кислорода (АФК) при спонтанной хемилюминесцентной реакции, чего не наблюдалось при исследовании зимозан-индуцированной хемилюминесценции. Препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в терапевтической концентрации in vitro статистически значимо не меняет продукции активных форм кислорода у детей с ОЛЛ.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, нейтрофилы,
хемилюминесценция, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
Кадричева Татьяна Геннадьевна - зав. II педиатрическим отделением НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск; e-mail: kts_1@mail.ru.
Манчук Валерий Тимофеевич - член-корр. РАМН, директор НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск; тел.: 8(391)2280681.
Современные возможности терапии позволили существенно изменить прогноз у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ): 5-летняя безрецидивная выживаемость составляет от 70 до 84% [4, 13]. Успехи в лечении этого заболевания связаны как с возможностями современной высокодозной химиотерапии, так и сопроводительной терапии.
Однако инфекционные осложнения на сегодняшний день являются ведущей причиной смертности, не обусловленной прогрессированием основного заболевания [10]. Дефекты всех звеньев иммунитета, наиболее значимыми из которых являются тяжелая продолжительная нейтропения и качественные дефекты иммунокомпетентных клеток, предрасполагают к развитию инфекционных осложнений у пациентов с гемобластозами.
Нейтрофилы являются фактором поддержания гомеостаза и составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты организма. Одной из основных функций нейтрофилов является элиминация чужеродных агентов, которая реализуется с развитием так называемого «респираторного взрыва» [3]. Результатом каскада биохимических реакций является
продукция активных форм кислорода (АФК), обладающих бактерицидным действием. Именно на регистрации интенсивности «респираторного взрыва » основан хемилюминесцентный анализ [1]. Наибольший вклад в продукцию АФК определяется, прежде всего, нейтрофилами. В качестве неспецифического индуктора в хемилюминесцентной реакции применяется зимозан - полисахарид, получаемый из культуры Saccharomyces cerevisiae. Учитывая зависимость между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, результаты, полученные при использовании данного метода, могут характеризовать способность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу [2].
В лечении миелотоксических инфекционных осложнений при гемобластозах применяются антибиотики, противогрибковые препараты, трансфузии компонентов крови. С начала 90-х гг. в клинической практике стали использоваться гемопоэтические ростовые факторы - человеческий
рекомбинантный гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы. Несмотря на то, что в ряде исследований показано сокращение продолжительности нейтропении [6] и повышение функциональной активности нейтрофилов [8,12], пока не продемонстрировано снижения смертности от инфекционных осложнений при назначении больным препаратов Г-КСФ [6, 9].
Таким образом, целью данного исследования явилась оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов крови у детей с ОЛЛ на фоне миелотоксических инфекционных осложнений и влияния in vitro на хемилюминесценцию нейтрофилов Г-КСФ.
Материалы и методы
Под наблюдением находились 47 больных ОЛЛ в возрасте от 1 года до 17 лет 11 мес 29 дней. Диагноз острого лимфобластного лейкоза устанавливался на основании клинических проявлений, морфологического, цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток. Среди наблюдаемых больных преобладали пациенты с В-линейными вариантами иммунофенотипа: 36 детей (76,6%), Т-линейная
дифференцировка наблюдалась в 8 случаях (17,0%). В 3 случаях иммунофенотип не был определен. Все дети получали интенсивную программную полихимиотерапию по протоколам ALL BFM95m и MB-2002 [5]. Группу контроля составили 30 детей I-II группы здоровья, которые не имели острых заболеваний и проявлений аллергических реакций в момент исследования.
Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали методом люминол-зависимой зимозан-индуцированной хемилюминесценции по P. De Sole et al. [7]. Учитывая, что хемилюминесцентный ответ крови определяется, в основном, фагоцитирующими клетками, способными продуцировать АФК, нейтрофильные гранулоциты из крови не выделяли, исследование проводили в цельной гепаринизированной крови.
Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов методом хемилюминесцентного анализа исследовали при развитии инфекционных осложнений на фоне индуцированной химиотерапией гипоплазии кроветворения.
Оценка спонтанной и индуцированной хемилюминесценции производилась в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «GL3604» (Россия). Регистрация результатов и управление анализатором осуществлялись через персональный компьютер. В качестве индуктора «дыхательного взрыва» использовался опсонизированный зимозан.
Определялись следующие характеристики: время выхода кривой на максимум (Tmax), максимальная интенсивность свечения (Imax), светоплощадь свечения (S) при спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, а также индексы активации, демонстрирующие усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, относительно спонтанной - соотношения Imax инд. /Imax спон., S инд./S спон.
Эффект препарата Г-КСФ оценивался при исследовании спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии препарата Г-КСФ в дозе 0,07 мкг в реакционной среде.
Статистическая обработка проводилась с использованием методов непараметрического анализа пакета прикладных программ Statistica for Windows, Release V.V.0 «StatSoft Inc». Проверку достоверности гипотез относительно изучаемых показателей проводили с помощью критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок, критерия Вилкоксона - для зависимых. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде значений медианы.
Результаты и обсуждение
В период миелотоксических осложнений у всех наблюдаемых больных количество гранулоцитов периферической крови не превышало 0,5*109/л. Среди исследуемых пациентов наблюдались следующие инфекционные
осложнения: мукозит ротовой полости - у 15 больных, фебрильная нейтропения - у 9, энтероколит - у 8, фарингиты - у V, бронхиты - у 6, пневмония - у 1, инфильтрат мягких тканей - у 1 больного.
При оценке времени выхода кривой на максимум спонтанной и индуцированной хемилюминесценции различий между показателями в группе больных ОЛЛ и контроля не выявлено (рис. 1). Таким образом, несмотря на наличие инфекционных осложнений у больных ОЛЛ, скорость максимального образования АФК не увеличивается. Присутствие в реакционной среде Г-КСФ не изменяет кинетику хемилюминесцентного ответа.
Анализ результатов исследования показал, что максимальная интенсивность свечения при спонтанной хемилюминисценции у больных ОЛЛ была более высокой, чем в контрольной группе (р<0,01). Можно предположить, что более активная генерация АФК связана с тем, что нейтррофилы крови у детей с ОЛЛ были активированы вследствие имевшихся инфекционных осложнений, это и нашло отражение при определении показателей их хемилюминесцентного ответа. Следует отметить, что Г-КСФ не вызывал статистически значимых изменений уровня спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов крови. При зимозан-индуцированной хемилюминесценции происходит усиление образования АФК, которое в нашем исследовании оказалось более выраженным в группе контроля, что привело к значимому повышению уровня Imax инд. в группе контроля при сравнении с больными ОЛЛ (р<0,01). Добавление в реакционную среду Г-КСФ значимо не изменяло показателей зимозан-индуцированной хемилюминесценции в сравниваемых группах (рис. 2).
При анализе показателей светоплощади хемилюминесценции нейтрофилов крови отмечается статистически значимое повышение данного показателя при спонтанной хемилюминесценции (S спон.) у больных с ОЛЛ на фоне миелосупрессии по сравнению с контролем (р<0,01) как без добавления в реакционную среду Г-КСФ, так и в присутствии Г-КСФ (рис. 3). При
зимозан-индуцированной хемилюминесценции показатель светоплощади у больных ОЛЛ статистически значимо не отличается от параметров группы контроля, независимо от присутствия в реакционной среде Г-КСФ.
Соотношение Imax инд ./Imax спон. при исследовании на фоне миелосупрессии у больных ОЛЛ, в том числе при добавлении в реакционную среду Г-КСФ, оказалось статистически значимо более низким, чем в группе контроля (р<0,01). Оценке индекса активации, описываемого соотношением S инд./S спон. у больных ОЛЛ на фоне индуцированной цитопении показала, что данный коэффициент был статистически значимо меньше такового при сравнении с группой контроля, независимо от присутствия в реакционной среде Г-КСФ (рис.4). Таким образом, дополнительная стимуляция зимозаном «респираторного взрыва» нейтрофилов крови не приводит к увеличению продукции АФК, что свидетельствует о снижении резервных метаболических возможностей нейтрофильных гранулоцитов. Отсутствие эффекта Г-КСФ в виде повышения хемилюминесцентного ответа нейтрофилов крови, вероятно, можно связать с низким количеством лейкоцитов крови у наблюдаемых больных, а также с данными C.F. Nathan [11] о стимулирующем влиянии Г-КСФ на адгезированные, а не находящиеся в суспензии нейтрофилы.
Таким образом, в результате проведенного исследования выявлены особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у детей с ОЛЛ, получающих программную химиотерапию. Установлено, что скорость генерации АФК в период миелосупрессии у больных ОЛЛ значимо не отличается от группы контроля. В период миелотоксических осложнений имеет место повышение функциональной активности нейтрофилов при оценке максимальной интенсивности свечения и светоплощади спонтанной хемилюминесценции, что, возможно, обусловлено имеющимися
инфекционными осложнениями. В то же время отмечается низкий, по сравнению со здоровыми детьми, ответ на стимуляцию зимозаном, отражая сниженные функциональные резервы нейтрофильных гранулоцитов. Присутствие в реакционной среде препарата рекомбинантного человеческого
Г-КСФ не вызывает изменений функциональной активности нейтрофилов крови детей с ОЛЛ при исследовании методом люминол-зависимой зимозан-индуцированной хемилюминесценции.
GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR IN VITRO INFLUENCE ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHIL GRANULOCYTES IN CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLAST
LEUCOSIS
T.G. Kadricheva, V.T. Manchuk
State Scientific Research Institute for Medical Northern Problems of Siberian Division of Russian Academy of Medical Sciences, Krasnoyarsk, Russia.
Abstract. We examined functional activity of neutrophil granulocytes by luminol-dependent chemiluminescence of whole blood in children with acute lymphoblast leucosis (ALL). We revealed that myelotoxic complications there is increased generation of active oxygen forms in spontaneous chemiluminescence reaction, that was never observed in zymosan-induced chemiluminescence. Granulocyte colony stimulating factor in the therapeutic concentration in vitro does not change significantly production of active oxygen forms in children with ALL.
Key words: acute lymphoblast leucosis, neutrophils, chemiluminescence, Granulocyte colony stimulating factor
Литература
1. Грачева Т. А. Совершенствование хемилюминесцентного метода исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток. // Клинич. лабораторная диагностика. - 2008. - № 2. - С. 54-55.
2. Земсков В.М., Барсуков А.М., Безносенко А.А. и др. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток). Методические рекомендации МЗ РФ. - М., 1988. -С.12-15.
3. Пинегин Б.В., Маянский А.Н. Нейтрофилы: структура и функции // Иммунология. - 2007. - №6. - С.374-381.
4. Румянцева Ю.В., Карачунский А.И., Румянцев А.Г. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей в России // Педиатрия. -2009. - Т.87, №4. - С.19-27.
5. Стандарты оказания специализированной помощи детям и подросткам
с гематологическими и онкологическими заболеваниями. - М.:
МЕДПРАКТИКА-М, 2009. - С.247-256.
6. Clark O.A. Lyman G.H. Gastro A.A. et al. Colony-stimulating factors for chemotherapy-induced febrile neutropenia: A metaanalysis of randomized controlled trials // J. Clin. Oncol. - 2005. - Vol.23. - P.4198-4214.
7. De Sole P., Lippa S., Litarru G. P. Whole blood chemiluminescence: a new technical approach to assess oxygen-dependent microbial activity of granulocytes // J. of Clin. Laboratory Automation. -1983. - Vol.3. - P. 391-400.
8. Droemann D., Hansen F., Aries S.P. et al. Neutrophil apoptosis, activation and anti-inflammatory cytokine response in granulocyte colony-stimulating factor-treated patients with community-acquired pneumonia // Respiration. - 2006. -Vol.73, №.3. - P.340-346.
9. Khoury H.J., Loberiza F.R., Ringdén O. et al. Impact of posttransplantation G-CSF on outcomes of allogenic hematopoietic stem cell transplantation // Blood. - 2006. - Vol.107, №.4. - P.1712-1716.
10. Kocak U., Rolston K.V., Mullen C.A. Fever and neutropenia in children with solid tumors is similar in severity and outcome to that in children with leukemia // Support Care Cancer. - 2002. - Vol.10, №1. - P. 58-64.
11. Nathan C.F. Respiratory burst in abherent human neutrophils: Triggerihg by colony-stimulating factrs CSF-GM and CSF-G // Blood. - 1989. - Vol.73. -P.301-306.
12. Ribeiro D., Veldwijk M.R., Benner A. et al. Differences in functional activity and antigen expression of granulocytes primed in vivo with filgrastim, lenograstim, or pegfilgrastim // Transfusion. - 2007. - Vol.47, №.6. - P.969-980.
13. Pui C.H., Sandlund J.T., Pei D. et al. Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: results of Total Therapy Study XIII at St Jude Children’s Researche Hospital // Blood. - 2004. - Vol.104, №9. - P.2690-2696.
