CC BY
59
УДК: 616.155.392.2-036.11-053.2 : 616.155.34
особенности функциональном активности нейтрофильных гранулоцитов у детей с острым лимфобластным лейкозом
Т.Г. Кадричева
НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3г, e-mail: [email protected]
Проведено исследование функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов методом люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови детей с острым лимфобластным лейкозом. Выявлено, что при миелотоксических осложнениях повышена генерация активных форм кислорода при спонтанной хемилюминесцентной реакции, чего не наблюдалось при исследовании зимозан-индуцированной хемилюминесценции.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, дети, нейтрофильные гранулоциты, хемилюминесценция.
PECULIARITIES OF NEUTROPHYLE’S FUNCTIONAL ACTIVITY IN CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA T.G. Kadricheva
State Scientific Research Institute for Medical Northern Problems of Siberian Division of Russian Academy of Medical
Sciences, Krasnoyarsk 3-g, Partizan ZheleznyakStreet, 660022-Krasnoyarsk, e-mail: [email protected]
Studies of neutrophylic granulocytes functional activity in children with acute lymphoblastic leukemia have been carried out using luminol-induced chemiluminescence. We have revealed increased production of reactive oxygen species under basal conditions and low responds in zimozans-induced chemiluminescent reaction.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, children, neutrophilic granulocytes, chemiluminescence.
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является самой распространенной опухолью кроветворной ткани в детском возрасте и составляет 25-30 % всех злокачественных опухолей у детей и 80-90 % случаев острого лейкоза. Современные возможности терапии позволили существенно изменить прогноз у детей с ОЛЛ, 5-летняя без-рецидивная выживаемость составляет от 70 до 84 % [5, 11].
Несмотря на совершенствование цитостати-ческой и сопроводительной терапии, инфекционные осложнения на сегодняшний день являются ведущей причиной смертности, не обусловленной прогрессированием основного заболевания [9]. Факторами, определяющими высокий риск инфекционных заболеваний и связанной с ними смертности, являются и особенности патофизиологии заболевания, и повреждения эпителиальных барьеров, и необходимость проведения инвазивных диагностических и лечебных процедур, и побочные действия, и осложнения химиотерапии. Помимо индукции апоптоза в
клетках-мишенях, цитостатики вызывают выраженный миелотоксический эффект. Кроме количественных изменений, обусловленных как проявлениями заболевания, так и осложнениями проводимой терапии, нейтрофилы крови больных с гемобластозами имеют и функциональные дефекты уже на начальном этапе лечения. Цитостатики, глюкокортикоиды, лучевая терапия приводят к резкому усилению дисфункции фагоцитов [10].
Количественные и качественные дефекты всех звеньев иммунитета, в том числе нейтро-фильного звена, являются основой развития и тяжелого и нетипичного течения инфекционных процессов у больных с острым лимфобластным лейкозом. Нейтрофилы являются фактором поддержания гомеостаза и составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты организма. Одной из основных функций нейтрофилов является элиминация чужеродных агентов, которая реализуется с развитием так называемого респираторного взрыва [4]. Резуль-
особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у детей ... ---------------------------------------------------------------------------- 63
татом каскада биохимических реакций является продукция активных форм кислорода (АФК), обладающих бактерицидным действием. Именно на регистрации интенсивности респираторного взрыва основан хемилюминесцентный анализ [1]. Наибольший вклад в продукцию активных форм кислорода определяется, прежде всего, нейтрофилами. В качестве неспецифического индуктора в хемилюминесцентной реакции применяется зимозан - полисахарид, получаемый из культуры Saccharomyces cerevisiae. Учитывая зависимость между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, результаты, полученные при использовании данного метода, могут характеризовать способность гранулоцитов к завершенному фагоцитозу [2].
Таким образом, целью данного исследования явилась оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов детей с острым лимфобластным лейкозом методом люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови.
Материал и методы
Под наблюдением находились 47 больных острым лимфобластным лейкозом в возрасте от 1 года до 17 лет 11 мес 29 дней. Возрастная структура наблюдаемых пациентов: от 1 до 3 лет - 7 больных; от 3 до 7 лет - 20; от 7 до 11 лет - 7; от 11 до 15 лет - 7; от 15 до 17 - 6 пациентов. Диагноз острого лимфобластного лейкоза устанавливался на основании клинических проявлений, морфологического, цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток. Все дети получали интенсивную программную полихимиотерапию по протоколам ALL BFM95m и MB-2002 [6]. Группу контроля составили 30 детей в возрасте от 1 до 18 лет I-II группы здоровья, которые не имели острых заболеваний и проявлений аллергических реакций в момент исследования.
Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Учитывая, что хемилюминесцентный ответ крови определяется в основном фагоцитирующими клетками, способными продуцировать АФК, и присутствие неадгезирующих клеток не оказывает существенного влияния на характер развития хемилюминесцентного ответа, нейтрофильные
гранулоциты из крови не выделяли, исследование проводили в цельной гепаринизированной крови [7].
Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов методом хемилюминесцентного анализа исследовали при развитии инфекционных осложнений на фоне индуцированной химиотерапией гипоплазии кроветворения. Оценка спонтанной и индуцированной хемилю-минесценции производилась в течение 90 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «CL3604» (Россия). Регистрация результатов и управление анализатором осуществлялись через персональный компьютер. В качестве индуктора дыхательного «взрыва» использовался опсонизи-рованный зимозан. Определялись следующие характеристики: время выхода кривой на максимум (Tmax), максимальная интенсивность свечения (Imax), светоплощадь свечения (S) при спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, а также индексы активации, демонстрирующие усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, относительно спонтанной - соотношения Imax инд. /Imax спон., S инд./S спон.
Статистическая обработка проводилась с использованием методов непараметрического анализа пакета прикладных программ Statistica for Windows, Release 7.0 «StatSoft Inc». Проверку достоверности гипотез относительно изучаемых показателей проводили с помощью критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде значений медианы и 25-го и 75-го квартилей.
Результаты и обсуждение
В период миелотоксических осложнений у всех наблюдаемых больных количество гранулоцитов не превышало 0,5*109/л. Среди исследуемых пациентов наблюдались следующие инфекционные осложнения: мукозит ротовой полости - у 15 больных, фебрильная нейтропе-ния - у 9, энтероколит - у 8, фарингиты - у 7, бронхиты - у 6, пневмония - у 1, инфильтрат мягких тканей - у 1 больного. Все больные получали антибактериальную терапию и препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.
При анализе полученных данных выявлено,
б4
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции цельной крови детей с ОЛЛ на фоне нейтропенических
инфекционных осложнений Me (C„C 75))
Показатель Контроль (n=30) Больные ОЛЛ (п=4У) р
1 2
Tmax спон., сек 3340 (1б05; 429б) 2921 (Ш5; 41б8)
Imax спон., о.е. 99 (8б; 110) Ш (Ш; 22У) ри<0,01
S спон., о.е. х104 0,4У (0,44; 0,55) 1,3У (0,85; 2,38) р1,2<0,01
Tmax инд., сек 1б01 (14S3; П48) 1б84 (1248; 1983)
Imax инд., о.е. У48 (45У; 1090) 24б (1б2; 51б) р.2<0,01
S инд., о.е. х104 2JS (2,02; 3,5б) 2,48 (1,22; 4,80)
Imax инд./Imax спон. 8,28 (4,4; 11,32) 1,У4 (1,24; 2,б9) р.2<0,01
Sинд./S спон. б,31 (3,39; 8,33) 1,49 (1,1б; 2,22) р. 2<0,01
что время выхода хемилюминесцентнои кривои на максимум статистически значимо не различалось при сравнении с группоИ контроля (табл. 1). Следовательно, наличие инфекционных осложнении у больных ОЛЛ не способствует более быстрои активации неитрофилов.
При оценке уровня максимальной интенсивности свечения (Imax) у больных ОЛЛ отмечено статистически значимое повышение Imax при спонтаннои и индуцированнои хемилюминес-ценции. Можно предположить, что данный факт связан с тем, что леикоциты у детеи с ОЛЛ были активированы вследствие имеющихся инфекционных осложнении, что и нашло отражение при определении показателей их функции. Подобные результаты получены А.Е. Кратновым и Е.В. Борисовой (2007) при определении активности миелопероксидазы, играющей ключевую роль в образовании ряда АФК в нейтрофилах детей с ОЛЛ: у детей, получающих программную интенсивную химиотерапию, активность миелопероксидазы в нейтрофилах была выше, чем в группе контроля [3].
При анализе показателей светоплощади хе-милюминесценции отмечается статистически значимое повышение данного показателя при спонтанной хемилюминесценции ^спон.) у больных с ОЛЛ по сравнению с контролем. После воздействия зимозана уровень светопло-щади хемилюминесценции у больных с ОЛЛ значимо не отличался от уровня данного показателя, регистрируемого в группе контроля.
Соотношение Imax инд./Imax спон. демонстрирует усиление хемилюминесценции в от-
вет на воздействие индуктора «дыхательного взрыва» и отражает резерв функциональных возможностей лейкоцитов. Коэффициент 1тах инд./1тах спон. у больных ОЛЛ оказался статистически значимо более низким, чем в группе контроля.
При оценке индекса активации, описываемого соотношением S инд.^ спон., у больных ОЛЛ на фоне индуцированной цитопении данный коэффициент был статистически значимо меньше такового при сравнении с группой контроля. Таким образом, снижение индексов активации указывает на истощение резервных возможностей к генерации АФК в нейтрофильных гранулоцитах детей с ОЛЛ.
Учитывая, что некоторые исследователи при изучении смертности детей с ОЛЛ [8] указывают, что развитие лекарственного гепатита вследствие гепатотоксичного действия химиотерапии способствует изменению фармакокинетики цитостатиков и усилению их токсического действия на организм, мы попытались установить, как меняются в этих случаях показатели хемилюминесценции. Токсическое поражение печени у наблюдаемых больных диагностировалось по повышению уровня аминотрансфераз и/или прямой гипербилирубинемии при условии исключения гепатитов вирусной этиологии.
При сравнении изучаемых показателей в зависимости от наличия гепатотоксических осложнений (табл. 2) было выявлено, что у больных с указанными осложнениями были статистически значимо повышены показатели максимальной интенсивности свечения при
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У ДЕТЕЙ...
-------------------------------------------------------------------------------- 65
Таблица 2
Показатели хемилюминесценции цельной крови детей с олл в зависимости от наличия
токсического поражения печени (Ме (С25С 75))
Показатель Без гепатита (n=39) Токсический гепатит (n=8) P
1 2
Tmax спон., сек 2921 (1295; 4245) 2990 (25Т5; 3И2)
Imax спон., о.е. 131 (105; 218) 223 (189; 258) Pl,2<0,0l
S спон., о.е. х104 1,23 (0,82; 2,24) 1/М (1,32; 3,30)
Tmax инд., сек 1534 (1248; 22б4) 183б (1484; 1919)
Imax инд., о.е. 221 (1б2; 41б) У39 (538; 1001) Pl ,<0,01
Sинд., о.е. X 104 2,0б (1,15; 3,8б) 5,42 (3,80;10,99) Pl 7<0,01
Imax инд./Imax спон. 1,55 (1,1б; 2,40) 3,23 (2,58; 4,20) Pl 2<0,01
Sинд./S спон. 1,31 (1,12; 1,90) 2,8 (2,19; 3,б0) Pl,2<0,01
спонтанной (р<0,01) и индуцированной хемилюминесценции (р<0,01) и светоплощадь при индуцированной (р<0,01). Индексы активации Ітах инд./Ітах спон. и Sинд./S спон. также оказались более высокими у больных ОЛЛ при наличии токсического поражения печени (р<0,01).
Таким образом, продукция АФК в нейтро-филах была более высокой у больных с гепато-токсическими осложнениями химиотерапии. Данный факт может быть связан с тем, что цитостатики индуцируют апоптоз, используя те же пути, что и физиологические индукторы. Кроме цитотоксического действия, АФК способствуют и развитию апоптоза, стимулируя свободнорадикальные процессы в клетках и истощая ферменты антиоксидантной защиты. Возможно, что следствием более активного воздействия цитостатиков у больных ОЛЛ с явлениями гепатотоксичности, обусловленной химиотерапией, является уменьшение потенциала антиоксидантной защиты в нейтрофилах, что находит выражение в изменении их функциональной активности.
Заключение
В результате проведенного исследования выявлены особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов детей с ОЛЛ, получающих программную химиотерапию. Установлено, что скорость генерации АФК в период миелосупрессии у больных ОЛЛ значимо не отличается от группы контроля. В период миелотоксических осложнений имеет место по-
вышение функциональной активности нейтро-филов при оценке максимальной интенсивности свечения и светоплощади спонтанной хеми-люминесценции, что, возможно, обусловлено имеющимися инфекционными осложнениями. В то же время отмечается низкий, по сравнению со здоровыми детьми, ответ на стимуляцию зи-мозаном, отражая сниженные функциональные резервы фагоцитов. Наличие гепатотоксических осложнений сопровождается более активным образованием АФК и, возможно, приводит к дефициту антиоксидантной защиты нейтрофилов, способствуя их апоптозу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Грачева Т.А. Совершенствование хемилюминесцентного метода исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 2. С. 54-55.
2. Земсков ВМ., Барсуков АМ., Безносенко А.А. и др. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток): Методические рекомендации МЗ РФ. М., 1988. С. 12-15.
3. Кратнов А.Е., Борисова Е.В. Метаболическая активность нейтрофилов периферической крови в процессе лечения детей с острым лимфобластным лейкозом // Клиническая и лабораторная диагностика. 200! № 12. С. 43-45.
4. Пинегин Б.В., Маянский А.Н. Нейтрофилы: структура и функции // Иммунология. 200! № б. С. 3У4-381.
5. Румянцева Ю.В., Карачунский А.И., Румянцев А.Г. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей в России // Педиатрия. 2009. Т. 8! № 4. С. 19-2!
6. Стандарты оказания специализированной помощи детям и подросткам с гематологическими и онкологическими заболеваниями. М.: МЕДПРАКТИКА-М, 2009. С. 24У-25б.
1. ФедоровГ.Н., Леонов С.Д. Особенности хемилюминесценции цельной разведенной крови // Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический журнал. 2007 Т. б, вып. 4. Доступ: http:// www.smolensk.ru/MMORPH/N-^html/cont.html.
8. ChristersenM.S., HeymanM., ZellerB. et al. Treatment-related death in childhood acute lymphoblastic leukemia in Nordic countries: 1992-2001 // Br. J. Hematol. 2005. Vol. 19 (3). P. 467-469.
9. Kocak U., Rolston K.V, Mullen C.A. Fever and neutropenia in children with solid tumors is similar in severity and outcome to that in children with leukemia // Support Care Cancer. 2002. Vol. 10 (1). P. 58-64.
10. Pui C.H., Boyett J.M., Rivera G.K. et al. Long-term results of Total Therapy studies 11,12 and 13 A for childhood acute lymphoblastic leukemia at St. Jude Children’s Research Hospilal // Leukemia. 2000. Vol. 12 (14). P. 2286-2294.
11. Pui CH., Sandlund J.T., Pei D. et al. Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: results of Total Therapy Study XIII at St Jude Children’s Researche Hospital // Blood. 2004. Vol. 104 (9). P. 2690-2696.
Поступила 12.01.11
