CC BY
1914. Schroder J.-M., Harder J. Human beta-defensin-2. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1999, 31: 645651.
15. Vasilchenko A.S., Nikiyan H.N., Deryabin D.G. Atomic force microscopy study of magainin 2 versus human platelet extract action on Escherichia coli and Bacillus cereus. J. Biol. Res. 2013, 19: 3-9.
16. Yeaman M.R. Platelets in defense against bacterial pathogens. Cell. Mol. Life Sci. 2010, 67: 525544.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Иванов Юрий Борисович, к.м.н., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11. р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Б.В.Каральник*, Т.С.Пономарева, П.Н.Дерябин, Т.Г.Денисова*, Н.Н.Мельникова, Т.И.Тугамбаев, Б.Б.Атшабар, С.Б.Закарян
ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ НА ИММУНОГЕННУЮ И ПРОТЕКТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЖИВОЙ ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ
Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций, *Научный центр гигиены и эпидемиологии, Алматы, Казахстан
Цель. Сравнительная оценка влияния полиоксидония и беталейкина на иммуноген-ную и протективную активность живой чумной вакцины в модельных опытах на животных. Материалы и методы. Использованы чумная вакцина EV, полиоксидоний, беталейкин, эритроцитарный антигенный диагностикум для определения F1 антител и разработанные авторами иммунореагенты для выявления в адгезивном тесте лимфоцитов с рецепторами к F1 (ЛфР). Опыты выполнены на 12 кроликах и 169 морских свинках. Результаты. Иммуномодуляция ускорила появление и исчезновение ЛфР (ранняя фаза) и обеспечила более быстрое и интенсивное образование антител (эффекторная фаза). Активация беталейкином выражена больше, чем полиоксидонием. Чем быстрее и интенсивнее развивалась ранняя фаза, тем эффективнее был антительный ответ на вакцину. Иммуномодуляция в опыте на морских свинках существенно повысила протективную активность вакцины. Заключение. Применение иммуномодуляторов повысило иммуно-генную (как в ранней, так и в эффекторной фазе антигенспецифического ответа) и про-тективную активность вакцины EV. Выявлена связь между ускорением первой фазы анти-генспецифического ответа и общей интенсивностью эффекторной фазы иммунного ответа на вакцину EV.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 108-112
Ключевые слова: чума, вакцинация, иммуномодуляция, рекомбинантный интерлейкин-ф, полиоксидоний
B.V.Karalnik*, T.S.Ponomareva, P.N.Deryabin, T.G.Denisova*, N.N.Melnikova, T.I.Tugambaev, B.B.Atshabar, S.B.Zakaryan
EFFECT OF IMMUNE MODULATION ON IMMUNOGENIC AND PROTECTIVE ACTIVITY OF A LIVE PLAGUE VACCINE
Kazakh Scientific Centre of Quarantine and Zoonosis Infections, *Scientific Centre of Hygiene and Epidemiology, Almaty, Kazakhstan
Aim. Comparative evaluation of the effect of polyoxidonium and betaleukin on immunogenic and protective activity of a live plague vaccine in model animal experiments. Materials and methods. Plague vaccine EV, polyoxidonium, betaleukin, erythrocytic antigenic diagnosticum for determination of F1 antibodies and immune reagents for detection of lymphocytes with F1 recep-
tors (LFR) in adhesive test developed by the authors were used. The experiments were carried out in 12 rabbits and 169 guinea pigs. Results. Immune modulation accelerated the appearance and disappearance of LFR (early phase) and ensured a more rapid and intensive antibody formation (effector phase). Activation by betaleukin is more pronounced than by polyoxidonium. The more rapid and intensive was the development of early phase, the more effective was antibody response to the vaccine. Immune modulation in the experiment with guinea pigs significantly increased protective activity of the vaccine. Conclusion. The use of immune modulators increased immunogenic (in both early and effector phases of antigen-specific response) and protective activity of the EV vaccine. A connection between the acceleration of the first phase of antigen-specific response and general intensity of effector phase of immune response to the EV vaccine was detected.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 108-112
Key words: plague, vaccination, immune modulation, recombinant interleukin-1p, polyoxido-
nium
Вакцинация является важным звеном в системе эпидемиологического надзора и профилактики чумы и в системе мер, направленных на ликвидацию последствий возможных биотеррористических актов с применением возбудителя этой инфекции [12]. В СНГ для вакцинации против чумы используют живую вакцину на основе штамма Yersinia pestis EV Однако живая вакцина, будучи достаточно активной при первичной вакцинации, мало пригодна для повторных ревакцинаций.
Активация иммунного ответа на вакцины может быть обеспечена применением различных иммуномодулирующих препаратов, в том числе полиоксидония и беталейкина [1, 4 — 8, 11, 14]. Однако влияние иммуномодуляции на раннюю фазу антигенспецифи-ческого ответа (определение лимфоцитов с рецепторами к иммуногену) [2] до исследований [Karalnik B.V., Denisova T.G., 2011] практически не изучено.
Цель настоящей работы — сравнительная оценка влияния полиоксидония и рекомби-нантного интерлейкина-1р (беталейкина) на иммуногенную (раннюю и эффекторную фазы ответа) и протективную активность живой чумной вакцины в модельных опытах на животных. В работе использована живая чумная вакцина EV (КНЦКЗИ, Алматы, Казахстан), полиоксидоний (НПО «ПетроваксФарм», Россия) и беталейкин (ООО «Цитокин», Россия). В качестве антигена, к которому изучали антигенспецифический ответ, выбран капсульный антиген Yersinia pestis-F1, полученный по [10].
Иммунологические реагенты оптимальной и субоптимальной чувствительности для определения лимфоцитов с рецепторами к F1 (ЛфР) разработаны предварительно. Как сорбент, связывающий F1, применили фиксированные ацетальдегидом эритроциты быка, спонтанно не связывающиеся лимфоцитами человека, кролика и морских свинок [3], сенсибилизированные при помощи риванола [9]. Для определения антител к F1использовали диагностикум чумной антигенный эритроцитарный (КНЦКЗИ). Выделение лимфоцитов проводили в градиенте плотности фиколл-верографина 1.077. ЛфР определяли методом адгезии иммунореагента оптимальной или субоптимальной чувствительности на выделенных лимфоцитах при соотношении 1,2х108 корпускул реагента на 2х106 лимфоцитов. В контроле вместо иммунореагентов специфичности F1 использовали те же эритроциты, не сенсибилизированные F1. После экспозиции с каждой индивидуальной пробой лимфоцитов выполняли по 7 определений ЛфР специфичности F1 и лимфоцитов, связавших контрольный реагент. Как ЛфР учитывали лимфоциты, связавшие не менее 3 корпускул иммунореагента, определяли среднее содержание ЛфР (%) в индивидуальных фракциях лимфоцитов и у 4 кроликов одной группы. Активность антител выражали lg титра РНГА. В индивидуальных сыворотках выполняли по 4 определения и рассчитывали средний lg у 4 кроликов одной группы. На протяжении всего опыта использовали одну серию каждого иммунореагента. В работе применяли статистические методы частных сравнений серий. Результат считали значимым при Р<0,05. Протоколы проведения опытов (№№ 3 — 8) одобрены биоэтической комиссией КНЦКЗИ. Антигенспецифический ответ оценивали по выявлению ЛфР и антител.
Первая серия опытов по оценке влияния иммуномодуляторов на иммуногенную активность вакцины выполнена в длительном (231 день) эксперименте на кроликах (3 группы по 4 кролика в каждой). Всем животным вводили внутривенно вакцину ЕУ (3х108 клеток) в 0,5 мл 0,85% раствора №С1. Одновременно животным опытной группы № 1 вводили полиоксидоний в дозе 0,3 мг/кг массы тела внутривенно (в/в) в 0,5 мл 0,85% раствора №С1; животным опытной группы №2 — беталейкин в дозе 0,5 мкг в/в в 0,5 мл 0,85% раствора №С1; животным контрольной группы вместо иммуномодулятора вводили в/в 0,5 мл 0,85% раствора №С1.
У каждого кролика из краевой вены уха до и через 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 дня после иммунизации брали кровь в пробирку с гепарином(~4 мл) для выделения лимфоцитов и в обычную пробирку (~1 мл) для получения сыворотки. После 42 дней кровь брали только в обычную пробирку 1 раз в неделю до 231 дня включительно. После окончания опыта животных умерщвляли путем тотального обескровливания. При всех схемах иммунизации содержание ЛФР, выявляемых при помощи оптимального реагента, было больше выявляемого при помощи субоптимального реагента. Ранее было показано [Кага1шк В.У., Denisova Т^., 2011], что развитие и окончание ранней фазы антиген-специфического ответа определяется сроками достижения максимума содержания ЛфР (1), количеством ЛфР при достижении максимума их содержания (2), длительностью выявления ЛфР (3) и суммарным количеством ЛфР, выявляемых за этот период (4), а также сроками исчезновения ЛфР из периферической крови (5). Чем быстрее достигается максимум содержания, чем меньше значение такого максимума и суммарного за период выявления содержания ЛфР, чем раньше исчезают из крови эти лимфоциты, тем быстрее развивается и прекращается ранняя фаза антигенспецифического ответа.
Иммуномодуляция и особенности иммуномодулятора влияли на эти показатели у иммунизированных вакциной ЕУ кроликов. Ранжирование трех схем иммунизации по каждому показателю (при самом быстром развитии этой фазы ответа — ранг 1, при самом медленном — ранг 3) позволило рассчитать интегральный ранг эффективности каждой схемы иммунизации на этом этапе антигенспецифического ответа. Показано, что наибольшее ускоряющее влияние на раннюю стадию антигенспецифического ответа (ЛфР) оказал беталейкин (Р<0,01): интегральный ранг 1,06+0,06 в сравнении с контрольной группой (3,0). Полиоксидоний также ускорил эту стадию ответа (Р<0,01), но слабее: интегральный ранг 1,94+0,06.
Оценка динамики активности антител за время опыта (231 день) показала, что быстрее всего антитела в титре >1/1000 появляются при применении полиоксидония — на 14 день после иммунизации, позже всего — при иммунизации без иммуномодуляции — на 28 день, а при применении беталейкина — на 21 день. Средний ^ титра РНГА в эти дни наиболее высок при применении беталейкина и наименьший — при применении полиоксидония. Максимум активности антител достигнут быстрее всего при применении любого иммуномодулятора — через 56 дней, без иммуномодуляции — только через 119 дней. Период максимальной активности антител при иммунизации без иммуномодуляции минимален
— один день, он существенно больше при применении полиоксидония и беталейкина
— 49 и 63 дня. К концу опыта средний ^ титра РНГА при применении беталейкина был наибольшим, а при других схемах иммунизации был практически одинаково меньшим. Суммарный показатель активности антител за весь период их выявления более высок при применении беталейкина и практически одинаково меньший при других схемах иммунизации. Ранжирование схем иммунизации по каждому показателю антительного ответа (чем эффективнее ответ по данному показателю, тем меньше ранг) позволило рассчитать интегральный ранг эффективности схем иммунизации. Наилучшим он был при применении беталейкина (1,25), самым плохим — при иммунизации без иммуномодуляции (2,67).
Сопоставление влияния иммуномодуляции на эффективность ранней и эффекторной фаз ответа на иммунизацию кроликов живой чумной вакциной выявило взаимосвязь этих стадий иммунного ответа: чем быстрей появляются и исчезают ЛфР, тем в целом быстрее и интенсивнее развивается антительный ответ. Эти результаты аналогичны по-
лученным ранее на модели иммунизации герпетической инактивированной вакциной в эксперименте и при иммунотерапии больных герпесом с обострением [Кага1шк В.У., Denisova Т^., 2011]. Поэтому можно предполагать, что и на модели иммунного ответа на вакцину ЕУ ЛфР, вероятно, выполняют иммунорегуляторную функцию для антительного ответа. Не исключено, что в активации иммуномодуляторами этапов адаптивного иммунного ответа имеет значение активация систем врожденного иммунитета [6, 13]. Полученные результаты подтверждают, что иммуномодуляция может быть использована при изучении связи между различными фазами антигенспецифического ответа, а также при анализе возможной регуляторной функции ЛфР при чуме и вакцинации против нее.
Во второй серии опытов влияние иммуномодуляторов на иммуногенную и протектив-ную активность вакцины изучали в опытах на морских свинках. Животных (64) опытной группы № 1 иммунизировали в/в вакциной У pestis ЕУ (106 м.к.) с одновременным в/в введением полиоксидония (0,2 мг/кг в 0,5 мл 0,85% раствора №С1); 23 животных опытной группы № 2 — с одновременным в/в введением беталейкина (0,5 мкг). Животным (82) контрольной группы вводили только вакцину. На 21 сутки после иммунизации все животные были заражены вирулентным штаммом У ревйв 231 в дозе 200 DCL. Иммуногенную активность оценивали по титру антител к F1 на 14 день после иммунизации. Кровь для исследования брали из сердца, сыворотку отделяли стандартным методом. Протективную активность вакцины оценивали, учитывая число животных, погибших на 14 день после заражения. Оставшихся в живых животных умерщвляли путем тотального обескровливания, предварительно усыпив их эфиром.
Антитела определяли у 5, 3 и 8 животных групп №№ 1, 2 и 3 соответственно. Со дня забора крови (14 день после иммунизации) и до момента заражения животных на 21 день гибель животных не отмечена. Титр антител в сыворотке крови животных опытных групп был практически одинаковым и выше — 1:1430 и 1:1400 (Р<0,05), чем в контрольной группе 1:800.
В контрольной группе после заражения пало 52 животных. Выжившие животные были забиты на 14 сутки после заражения, из селезенки всех павших и 10 из 30 выживших животных выделена культура У. ревйв 231. В опытных группах №№ 1 и 2 в течение 14 дней после заражения пало 6 и 4 животных соответственно, что меньше (Р<0,01), чем в контрольной группе. У павших и оставшихся в живых животных групп 1 и 2, забитых на 14 сутки после заражения, культура У. ревйв 231 выделена не была. Различия количества павших животных в группах 1 и 2 не выявлено (Р>0,05). Следовательно, применение иммуномодуляторов предотвратило не только гибель зараженных морских свинок, но и обсеменение их селезенок вирулентным штаммом У. ревйв и повысило как иммуногенную, так и протективную активность живой чумной вакцины.
Применение иммуномодуляторов при вакцинации является перспективным путем повышения ее эффективности. Впервые в эксперименте удалось показать, что иммуномо-дуляторы не только могут усилить эффекторную фазу иммунного ответа, но и ускоряют раннюю фазу антигенспецифического иммунного ответа на вакцину ЕУ
ЛИТЕРАТУРА
1. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А.и др. Влияние цитокинов на иммуногенные свойства вакцины против клещевого энцефалита. Цитокины и воспаление. 2009, 8 (2): 1621.
2. Каральник Б.В., Дерябин П.Н., Денисова Т.Г. и др. Антигенсвязывающие лимфоциты в динамике иммунного ответа на бактериальные, вирусные и аутоантигены. Известия МОН РК, НАН РК, серия биол. и мед. 2001, 5: 37-43.
3. Каральник Б.В., Лещинская Л.Ц. Способ получения иммунореагента. АС СССР, 862919. Бюл. изобр. 1981, № 34, с.30.
4. Караулов А.В., Евсегнееев И.В. Современные подходы к вакцинопрофилактике гриппа. Вакцинация. 2011, 1 (1): 43-52.
5. Некрасов А.В., Пучкова Н.Г. Стратегия совершенствования и методы оценки гриппозных вакцин. Гриппол® плюс — современная защита от гриппа. Русский медицинский журнал. 2008,16 (23): 1-4.
6. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Иммуногены и вакцины нового поколения. М., 2011.
7. Симбирцев А.С., Петров А.В., Пигарева Н.В. и др. Новые возможности применения реком-бинантных цитокинов в качестве адъювантов при вакцинации. Биопрепараты. 2011, 1 (41): 16-20.
8. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Полиоксидоний: новые аспекты применения. Новые лекарства. 2003, 3: 21.
9. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Сенсибилизация эритроцитов иммуноглобулинами. Методические рекомендации. Алма-Ата, 1981.
10. Baker E.E., Sommer Н., Foster L. et al. Studies on immunization against plague. 1. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis. J. Immunol. 1952, 68 (2): 131145.
11. Explanatory note on immunomodulators for the guideline on adjuvants in vaccines for human use// EMEA. Evaluation of Medicines for Human Use. Doc. Ref. EMEA/CHMP/VWP/244894/2006.
12. Inglesby T.V., Dennis D. T., Henderson D.A. et al. Plague as a biological weapon: medical and public health management. Working Group on Civilian Biodefense. JAMA. 2000, 283: 22812290.
13. Kindrachuk J., Jensen H., Elliot M. et al. Manipulation of innate immunity by a bacterial secreted peptide: Lantibiotic nisin Z is selectively immunomodulatory. Innate Immunity. 2013, 19: 315327.
14. Nicholls E.F., Madera L., Hancock R.E.W Immunomodulators as adjuvants for vaccines and antimicrobial therapy. Ann. N.Y. Academy Sci, 2010, 1213: 46-61.
Поступила 27.02.14 С доработки 15.05.14
Контактная информация: Каральник Б.В., д.м.н., проф.,
Алматы, Казахстан, ул. Макатаева, 34
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
М.Н.Репецкая1, Ю.Н.Маслов1, Е.В.Шайдуллина2, О.М.Бурдина1
МИКРОБИОЦЕНОЗ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ У ДЕТЕЙ
1Пермская государственная медицинская академия; 2Городская детская клиническая поликлиника № 5, Пермь
Цель. Изучить микробный пейзаж и определить взаимосвязь между структурами биоценозов кожи, слизистой ротоглотки и кишечника при атопическом дерматите у детей. Материалы и методы. Обследованы 60 детей с атопическим дерматитом, проведено бактериологическое исследование кожи, ротоглотки, кишечника. Результаты. Выявлены значимые изменения как в количественном, так и в качественном составе микробиоценоза кожи, слизистых ротоглотки и кишечника. Кожа пациентов чаще колонизирована Staphylococcus aureus. В микрофлоре ротоглотки доминировали грамположительные бактерии. Сравнительная характеристика микрофлоры кожи и слизистой ротоглотки выявила прямую корреляцию. При микробиологическом исследовании микрофлоры кишечника выяснили, что у всех обследованных имелись нарушения микробного пейзажа той или иной степени выраженности. Заключение. Учитывая наличие прямой корреляции микрофлоры кожи и слизистой ротоглотки при атопическом дерматите в комплекс обследования пациентов рекомендуется включать посевы смывов из ротоглотки с последующей коррекцией микробиоценоза. Целесообразно обследовать всех детей с атопиче-ским дерматитом на наличие дисбиоза кишечника.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 112—116
Ключевые слова: дети, атопический дерматит, микробиоценоз кожи, слизистой ротоглотки, кишечника
