CC BY
37
Влияние иммуномодулятора Лейаргунал на поддесневую микрофлору, уровень интерлейкина 1(3 в ротовой жидкости и глубину периодонтальных карманов у пациентов с хроническим периодонтитом
Волкова М.Н.
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Volkova M.N.
Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Belarus
Influence of the immunomodulator Leuargunal on subgingival microbiota, interleukin 1p level of oral fluid and periodontal pockets depth of the patients with
chronic periodontitis
Резюме. Рандомизированным двойным слепым плацебо-контролируемым проспективным методом изучено влияние иммуномодулятора лейаргунал на глубину периодонтальных карманов, микробный состав содержимого периодонтального кармана и уровень цитокина /¿-/р ротовой жидкости 5/ пациента с хроническим периодонтитом (ХП). Забор биоматериала проводили стерильными бумажными штифтами из наиболее глубокого периодонтального кармана в каждом секстанте. Концентрация /¿-/р в ротовой жидкости определена методом твердофазного иммуноферментного анализа. После окончания иммунотерапии лейаргуналом у пациентов с ХП выявлено статистически значимое уменьшение частоты выделения облигатно-анаэробных микроорганизмов поддесневого налета (P=0,0/), уровня /¿-/р в ротовой жидкости (P=0,0/2), а также глубины периодонтальных карманов через /2 месяцев наблюдений (Р=0,0003).
Ключевые слова: иммуномодулятор лейаргунал, хронический периодонтит, периодонтальный карман, анаэробные бактерии, поддесневой налет. Summary. Influence of immunomodulator ¿euargunal on periodontal pockets depth, microbial composition of the periodontal pockets and cytokines /L /p level in oral fluid of the 5/ patients wtth chronic periodontitis (CP) was studied by randomized double blind placebo-controlled prospective method. Bacterial samples were collected with sterile paper points from the deepest periodontal pockets of patients with CP. The concentration of /L- /p was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Significant reliable reduction of isolation frequency of anaerobic bacteria from subgingival plaques (P=0,0/), reduction of saliva levels /L- /p (P=0,0/2), reduction of periodontal pocket depth of the patients with CP in /2 months (Р=0,0003) after finishing of ¿euargunal immunotherapy was revealed.
Keywords: immunomodulator leuargunal, chronic periodontitis, periodontal pocket, anaerobic bacteria, subgingival plaque.
Роль микробного фактора в этиологии болезней периодонта подтверждена многими исследователями [11, 12, 16]. До 70% всей микрофлоры периодонтального кармана составляют грам-отрицательные бактерии, в основном анаэробные [10]. Большинство бактерий, определенных как патогенные, способные индуцировать механизмы деструкции периодонтальных тканей, -грамотрицательные анаэробы. Нормальная микрофлора ротовой полости имеет физиологическое значение: проявляет антагонизм в отношении широкого спектра микроорганизмов и является фактором неспецифической резистентности местного иммунитета [9].
Обнаружение в составе микрофлоры периодонтального кармана патогенных для тканей периодонта бактерий в высокой концентрации (104 и более) на фоне выраженной клинической картины свидетельствует об анаэробной периодонталь-ной инфекции. Выделение периодонтопа-тогенной микрофлоры в концентрациях 104
и более при сниженном количестве или отсутствии бактерий, характерных для нор-мобиоценоза (Veillonella spp., Actinomyces spp, ¿actobacillus spp., Streptococcus mitis), свидетельствует о развитии дисбиотиче-ских изменений и требует восстановления нормальной микрофлоры [4].
Многие исследователи определяют IL-ip десневой и ротовой жидкости как маркер воспалительных заболеваний пе-риодонта, так как находят зависимость уровня IL1 р от глубины периодонтального кармана и других клинических параметров [1, 13, 15].
В развитии заболеваний периодонта взаимодействие между микроорганизмами зубного налета и системой иммунитета (СИ) человека играет ведущую роль: в воспалительный процесс, возникающий в ответ на бактериальную инвазию, вовлекаются факторы как неспецифического, так и адаптивного иммунитета. Именно СИ определяет развитие местных тканевых реакций на воздействие бактериальных патогенов и соответственно - клинические
проявления хронического периодонтита [17, 19]. Таким образом, иммунокоррекция имеет патогенетическую направленность терапевтического воздействия.
В данном исследовании в качестве иммуномодулирующего препарата предлагается лейаргунал, разработанный в результате совместной научно-исследовательской работы кафедры фармакологии Белорусского государственного медицинского университета (БГМУ), Фармакологического центра ЦНИЛ БГМУ и Медицинского радиологического научного центра Российской академии медицинских наук. Лейаргунал представляет собой комбинацию аминокислот 1-лейцина, 1-аргинина и пуринового основания инозина.
На основании результатов доклинических исследований лейаргунал рекомендован для клинических испытаний (решение МЗ РБ, протокол №2 от 26.02.2009) в качестве адаптогенного и иммуностимулирующего лекарственного средства.
Цель исследования - изучить влияние иммуномодулирующего средства
№9^ 2012
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |29
лейаргунал на глубину периодонтального кармана, микробный состав содержимого периодонтального кармана и уровень интерлейкина 11=1 р ротовой жидкости пациентов с хроническим периодонтитом.
Материалы и методы
Исследование эффективности препарата проведено в рамках программы «II фаза клинических испытаний эффективности лекарственного средства лейаргунал (лейцин/инозин/аргинин) производства РУП «1родненский завод медицинских препаратов» в сравнении с плацебо» (№471 МЗ РБ от 23.08.2008) по протоколу двойного слепого рандомизированного контролируемого проспективного исследования в параллельных группах пациентов с плацебо-контролем [7].
В исследование включен 51 пациент (18 мужчин, 33 женщины) с хроническим периодонтитом (ХП) легкой, средней и тяжелой степени тяжести (диагноз выставлен в соответствии с классификацией Американской академии периодонто-логии, 1999) [8] из числа обратившихся в областную стоматологическую поликлинику г. Витебска и на кафедру терапевтической стоматологии ВГМУ. Критерии включения в исследование для пациентов с ХП: 1) возраст 23-65 лет, 2) отсутствие системных заболеваний, 3) отсутствие системной антибактериальной, иммуно-модулирующей и противовоспалительной терапии в течение 6 месяцев перед данным исследованием, 4) проведенная базовая терапия - периодонтальное лечение, 5) отсутствие беременности у женщин. Письменное информированное согласие на участие в исследование было получено от всех обследованных.
Всем включенным в исследование были определены индекс налета (Р1 Silness—Loe, 1964) [6], индекс кровоточивости десневой борозды ^В1, МиИ^тап, 1971) в модификации I.Cowell (1975) [2], периодонтальный индекс (Р1 Russel, 1956) [3], глубина периодонтальных карманов (ПК), потеря клинического прикрепления (измерены градуированным пуговчатым периодонтальным зондом), проведено рентгенологическое исследование (орто-пантомография, прицельные дентальные снимки). Все пациенты обучены индивидуальной гигиене ротовой полости.
В соответствии с протоколом исследования [7] была проведена процедура простой одномоментной рандомизации пациентов с ХП с присвоением каждому пациенту рандомизационного кода и выдачей маркированных (А или В) пакетов с препаратом (лейаргунал или плацебо). Форма приема препарата - порошок. 26
пациентов с ХП получали 1 г порошка из пакетиков с маркировкой «А», 25 пациентов - 1 г порошка из пакетиков с маркировкой «В» ежедневно однократно 2l день. Один грамм лейаргунала содержит L-лейцина 500 мг L-аргинина гидрохлорид 300 мг инозина 200 мг. Плацебо производства РУП «Гродненский завод медицинских препаратов» содержал лактозы моногидрат 500 мг натрия хлорид 200 мг вспомогательные средства 300 мг. Перед приемом порошок растворяли в 200 г теплой кипяченой воды.
В качестве материала для бактериологического исследования использовали содержимое периодонтального кармана. Забор биоматериала производили в отделении челюстно-лицевой хирургии Витебской областной клинической больницы (ВОКБ). Исследуемый материал в течение 5-7 минут доставляли в бактериологическую лабораторию ВОКБ и/или микробиологический отдел РНПЦ «Инфекция в хирургии». Забор биоматериала проводили 2 раза: за 5 дней до начала иммунотерапии и на 26-28-й день после начала иммунотерапии.
Для выделения аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посев осуществляли на среды: Эндо, желточно-солевой агар, кровяной агар. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили путем постановки биохимических тестов с использованием коммерческих тест-систем.
Для выделения анаэробов посев осуществляли на чашки со средой Шед-лера, которые помещали в анаэростат с газогенерирующей смесью. Анаэробные условия создавались с помощью газогенераторов «Genbox anaer» (BioMerieux, Франция). Биохимическую идентификацию всех выделенных анаэробных микроорганизмов осуществляли с помощью тест-систем rapid 32A (BioMerieux, Франция). Автоматизированный учет результатов проводили с использованием микробиологического анализатора ATB Expression (BioMerieux, Франция).
Количество выросших колоний оценивали полуколичественным методом: результат 103 КОЕ/мл трактовался нами как «критическое число» микроорганизмов [5].
Возможности бактериологической лаборатории, техники выделения, культивирования и идентификации анаэробов не позволили провести оценку количества каждого из выделенных родов и видов анаэробных микроорганизмов.
Уровень ILip в ротовой жидкости измерен у 40 пациентов с ХП. Забор нестимулированной слюны проводили
2 раза: за 5 дней до начала иммунотерапии и через 6 месяцев после окончания иммунотерапии. Ротовую жидкость собирали согласно модифицированной версии Navazesh [14]. Образцы слюны были собраны в 1,5 мл микропробирки «Эппендорф» и немедленно заморожены при температуре -20°С до исследования. Уровень IL1p измерялся через 7-120 дней после забора слюны. Количество IL 1 р в слюне было измерено с использованием иммуноферментной тест-системы ОАО «Цитокин» (Санкт-Петербург); имму-ноферментный анализатор - фотометр универсальный Ф ЗОО ТП. Концентрацию IL-1p определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью моноклональных антител и с применением пероксидазы хрена в соответствии с прилагаемой инструкцией. По результатам оптической плотности титрованных стандартных образцов строили калибровочный график, по которому определяли концентрацию IL1p в опытных образцах ротовой жидкости.
Измерение глубины периодонтально-го кармана проводили 2 раза: на момент включения в исследование (после перио-донтального лечения) и через 12 месяцев после окончания иммунотерапии.
Результаты и обсуждение
Группы пациентов с ХП, принимавших лейаргунал и плацебо, были сопоставимы по возрасту и клиническим периодонтальным параметрам (глубине периодонтального кармана, потере клинического прикрепления, индексам SBI, PI Silness-Loe, PI Russel), (P>0,05, t-test или U-тест Манна-Уитни).
Бактериологическое исследование микрофлоры периодонтального кармана 51 пациента с ХП позволило выделить и идентифицировать 195 штаммов микроорганизмов: 20 родов, 27 видов микроорганизмов (7 факультативно-анаэробных и 20 облигатно-анаэробных). Выделенные микроорганизмы высевали в концентрации от 105 до 108 КОЕ/мл.
Была определена статистически достоверно (Р<0,01) более высокая частота встречаемости облигатно-анаэробных микроорганизмов (78,4±5,7%) по сравнению с факультативно-анаэробными микроорганизмами (52±6,99%) периодонтальных карманов. В незначительном количестве случаев были обнаружены представители нормальной микрофлоры: A.odontolyticus у 2 пациентов (3,92±2,72%), S.Mitis - у
3 (5,88±3,29%), Veillonella spp. - у 1 (1,96±1,94%), Lactobacillus spp. - у 1 пациента (1,96±1,94%). Представители периодонтопатогенной микрофлоры были выделены в подавляющем чис-
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
№9^ 2012
30
ле случаев: Fnucleatum - в 10 случаях (19,6±5,56%), Prevotella spp. - в 19 (37,25±6,77%), Peptostreptococcus spp. -в 11 (21,56±5,76%), Eubacterium spp. - в 6 случаях (11,76±4,51%).
При повторном бактериологическом исследовании содержимого периодонтальных карманов пациентов с ХП, проведенном после применения лейаргунала и плацебо, было выделено и идентифицировано 153 штамма микроорганизмов: 17 родов, 20 видов микроорганизмов (5 факультативно-анаэробных и 15 облигатно-анаэробных). Выделенные микроорганизмы высевали в концентрации от 103 до 106 КОЕ/мл.
Было определено статистически значимое (P=0,034 по критерию Вил-коксона) снижение количества выделенных штаммов микроорганизмов в группе пациентов, получавших терапию лейаргуналом - с 2,5 [1-4] до 2 [1-3]. У пациентов, получавших плацебо, также отмечали уменьшение количества выделенных штаммов микроорганизмов, однако оно не было статистически значимым. Снижение числа выделенных штаммов микроорганизмов после фармакотерапии свидетельствует о сокращении количества ассоциантов микрофлоры в составе поддесневого налета пациентов с ХП. Поскольку патогенность бактерий поддесневого налета, организованных в ассоциации, резко возрастает [18, 20], справедливым будет предположить снижение агрессивности микроорганизмов поддесневого налета у пациентов с ХП после проведения фармакотерапии.
Снижение количества штаммов микроорганизмов у всех включенных в исследование мы связываем также с высоким уровнем мотивации к индивидуальной гигиене ротовой полости, использованием основных и дополнительных средств и методов гигиены рта.
При сравнении частоты выделения об-лигатно-анаэробных микроорганизмов до и после иммунотерапии было определено снижение доли данных микроорганизмов в составе поддесневого налета у пациентов обеих групп, однако у пациентов, получавших лейаргунал, снижение было статистически значимым: с 84,6±7,07 до 50±9,8% (P=0,01 по критерию Вилкоксо-на). Установлено, что из всех выделенных родов и видов облигатно-анаэробных микроорганизмов (Fnucleatum, Prevotella spp., Peptostreptococcus spp., Т. denticola, Eubacterium spp., Bacteroides spp., Peptococcus spp., Gemella morbillorum, Anaerococcus prevoti, Bifidobacterium adolescentis, Actinomyces odontolyticus, Lactobacillus spp., Propionibacterium
propionicus, Clostridium bifermentans), уменьшалась частота выделения за счет статистически достоверного (Р=0,01 по критерию Вилкоксона) снижения частоты встречаемости Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Prevotella spp.
У пациентов обеих групп после иммунотерапии в содержимом периодон-тальных карманов было обнаружено увеличение доли аэробов и факультативных анаэробов (с 46±9,77 до 53,84±9,77% в группе А и с 60±9,79 до 64±9,6% в группе В). Уменьшение доли облигатных анаэробов, увеличение доли аэробов и факультативных анаэробов у пациентов обеих групп указывает на выравнивание дисбиотического сдвига микрофлоры содержимого периодонтальных карманов.
При сравнении содержания провос-палительного цитокина IL1ß в ротовой жидкости пациентов с ХП определили статистически значимое (Р=0,012 по критерию Вилкоксона) снижение количества IL1ß у пациентов, получавших терапию лейаргу-налом, с 120,66 [97,37-127,3] пг/мл до 106,9 [58,57-121,73] пг/мл. Количество IL1ß в ротовой жидкости у пациентов, получавших плацебо, незначительно повышалось.
При зондировании периодонтальных карманов у пациентов с ХП, получавших лейаргунал, через 12 месяцев наблюдений определено статистически значимое (Р=0,0003 по критерию Вилкоксона) уменьшение глубины периодонтальных карманов (с 4,35 [3,4-4,7] мм до 4,1 [3,2-4,6] мм). У пациентов, получавших плацебо, также уменьшилась глубина периодонтальных карманов (с 4,0 [3,2-4,6] мм до 3,9 [3,3-4,6] мм), однако это уменьшение не было статистически значимым. Таким образом, результаты клинических наблюдений пациентов с ХП, получавших фармакотерапию лей-аргуналом и плацебо, свидетельствуют о том, что положительная клиническая динамика более выражена у пациентов, получавших лейаргунал.
Поскольку включение иммунотерапии лейаргуналом в комплексное лечение хронического периодонтита приводило к статистически значимому уменьшению глубины периодонтальных карманов, снижению количества провоспалитель-ного цитокина IL-1 ß в ротовой жидкости, снижению доли облигатно-анаэробных микроорганизмов в составе поддеснево-го налета при отсутствии статистически значимых изменений клинических и лабораторных показателей у пациентов с ХП, получавших плацебо, можно сделать заключение о доказанности эффективности лейаргунала как иммуномодулятора.
Выводы
1. У пациентов с ХП, получавших иммунотерапию лейаргуналом, установлено снижение количества выделенных штаммов микроорганизмов поддеснево-го налета (Р=0,034), снижение частоты встречаемости облигатно-анаэробных микроорганизмов в составе поддесне-вого налета (Р=0,01), а также снижение уровня провоспалительного цитокина 11= 1 р в ротовой жидкости (Р=0,012).
2. У пациентов с ХП, получавших иммунотерапию лейаргуналом, через 12 месяцев наблюдений определено уменьшение глубины периодонтальных карманов (Р=0,0003).
3. Учитывая положительную клиническую динамику пациентов с ХП, модулирующее влияние лейаргунала на показатели местного иммунитета, рекомендуется его включение в состав комплексной терапии воспалительных заболеваний периодонта.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Волкова М.Н., Янченко В.В. // Цитокины и воспаление. - 2011. - Т.10, №4 - С.16-21.
2. Грудянов А.И. Заболевания периодонта. - М., 2009. - 328 с.
3. Дмитриева A.A.. Пародонтит. - М., 2007. - 504 с.
4. Инструкция по применению метода микробиологической диагностики болезней периодонта: утв. МЗ РБ, рег. № 016-0210 от 26.03.2010. - Минск, 2010. - 6 с.
5. Красильников А.П. Основы клинической микробиологии и иммунологии: учеб.-метод. пособие: в 2 ч. - Минск, 1989. - 61 с.
6. Попруженко Т.В., Терехова Т.Н. Профилактика основных стоматологических заболеваний. - М., 2009. - 481 с.
7. Программа и методика II фазы клинических испытаний эффективности лекарственного средства лейаргунал (лейцин/инозин/аргинин) производства РУП «Гродненский завод медицинских препаратов» в сравнении с плацебо. №471 23 июля 2008. - Гродно, 2008. - 38 с.
8. American Academy of Periodontology. International workshop for a classification of periodontal diseases and conditions // Ann. Periodontol. - 1999. - N4. -P.1-112.
9. Drizhal I. // Новое в стоматологии. - 2001. - N8 (98). - C. 19-24.
10. Flemming Th.F, Karch H. // Квитэссенция. - 1998. спец. вып. Пародонтология. - С.11-15.
11. Haffajee A.D., Socransky S.S. // Periodontol 2000. -1994. - N5. - P. 78-111.
12. Moore W.E., Moore L.V. // Peridontol 2000. -1994. - N5. - P.66-77.
13. MillerC.S. // J. Am. Dent. Assoc. - 2006. - N137. -P.322-329.
14. Navazesh M.A., Christensen C.M. // J. Dent. Researchers. - 1982. - Vol.61. - N10. - P.1158-1162.
15. Okada H. // Oral Diseases. - 1996. - N2. - P.87-95.
16. Socransky S.S., Haffajee A.D // Periodontol 2000. -1994. - Vol.5. - P.7-25.
17. Socransky S.S. // Periodontol 2000. - 2005. -Vol.38. - Р.135-187.
18. Slots J. // Tandlaegebladet. - 2000. - N90. -P.794-798.
19. Van Dyke TE. // Periodontol 2000. - 2007. -Vol.45. - Р.158-166.
20. Zambon J.J. // Ann. Periodontol. - 1996. - N1. -P.879-925.
Поступила 14.06.2012 г.
№9« 2012
МЕДИЦИНСКИЕ новости |э1
