CC BY
9© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-06-08
ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЛИКОПРОТЕИДОВ
КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ НА ИХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ
Т.В. Рябцева1, Д.А. Макаревич2, Е.М. Ермола2
'Учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет», Республика Беларусь, 220116, Минск, пр-т Дзержинского, д. 83, корп. 3; 2ГНУ«Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» лаборатории прикладной биохимии, Республика Беларусь, 22014', Минск, ул. академика В.Ф. Купревича, д. 5, корп. 2
Е-mail: ta-yana@mail.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Рябцева Татьяна Васильевна — научный сотрудник Учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет». Тел.: +375(44) 793-11-87. E-mail: ta-yana@mail.ru. ORCID: 0000-0003-0191-5811
Макаревич Денис Александрович — ведущий научный сотрудник Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» лаборатории прикладной биохимии. Тел.: +375 (44) 793-09-91. E-mail: demkarevich@yandex.ru. ORCID: 0000-0003-3937-2592
Ермола Евгений Михайлович — научный сотрудник Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» лаборатории прикладной биохимии. Тел.: +375 (29) 376-55-13. E-mail: ermola.e@ tut.by ORCID: 000-0003-1240-0100
Цель исследования — изучить влияние химической иммобилизации гликопротеидов клеточной стенки дрожжей на их способность активировать продукцию цитокинов клетками периферической крови человека.
Методы. Проведен сравнительный анализ иммуномодулирующей активности гликопротеидов клеточной стенки дрожжей в свободном и иммобилизированном состоянии. Исследована динамика процесса накопления провоспалительных цитокинов (IL6, IL8 и TNFa) во внеклеточной среде после контакта клеток крови человека с гликопротеидами. Источником гликопротеидов являлся клеточный лизат Saccharomyces cerevisiae. Иммобилизацию гликопротеидов проводили на полиа-криламидном геле в реакции сополимеризации. Исследование эффективности иммобилизованных и свободных гликопротеидов проводили в экспериментах in vitro на цельной крови практически здоровых доноров. Эффективность оценивали по нарастанию концентрации цитокинов в плазме крови после контакта с гликопротеидами по сравнению с исходным уровнем, а также при сравнении с влиянием полиакриламидного геля без лиганда и просто инкубации клеток крови с физиологическим раствором.
Результаты. Установлено, что иммобилизованные гликопротеиды, так же, как и свободные, при контакте с периферической кровью человека приводят к активации синтеза провоспалительных цитокинов (IL6, IL8 и TNFa) клетками крови. В исследовании выявлены особенности синтеза цитокинов в зависимости от формы контакта клеток крови с гликопротеидом. Показано, что скорость синтеза IL8 и TNFa выше после контакта крови с иммобилизованными гликопротеидами, чем с глико-протеидами в свободной форме.
Ключевые слова: цитокины, гликопротеиды, дрожжи, интерлейкин-6, иммуномодуляторы
EFFECT OF IMMOBILIZATION OF GLYCOPROTEINS OF THE BAKER'S YEAST CELL WALL ON THEIR IMMUNOMODULATORY ACTIVITY T.V. Ryabtseva1, D.A. Makarevich2, E.M. Ermola2
Educational institutions «Belarusian State Medical University», prosp. Dzerzhinskiy, 83, bldg. 3, Minsk, 220116, Republic of Belarus;
2State Scientific Institution «Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus» Laboratory of Applied Biochemistry, str. akademika V.F. Kuprevicha, 5, bld. 2, Minsk, 220141, Republic of Belarus
Е-mail: ta-yana@mail.ru
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Ryabtseva Tatyana Vasilyevna — Researcher of the Educational Institution «Belarusian State Medical University». Tel.: +375 (44) 793-11-87. E-mail: ta-yana@mail.ru. ORCID: 0000-0003-0191-5811
Makarevich Denis Alexandrovich — Leading Researcher State Scientific Institution «Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus» Laboratory of Applied Biochemistry. Tel.: +375 (44) 793-09-91. E-mail: demkarevich@yandex.ru ORCID: 0000-0003-3937-2592
Yermola Evgeny Mikhailovich — Researcher State Scientific Institution «Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus» Laboratory of Applied Biochemistry. Tel.: +375 (29) 376-55-13. E-mail: ermola.e@tut.by. ORCID: 000-0003-12400100
The aim of the study was to study the effect of chemical immobilization of yeast cell wall glycoproteins on their ability to activate cytokine production by human peripheral blood cells.
Methods. A comparative analysis of the immunomodulatory activity of yeast cell wall glycoproteins in a free and immobilized state was carried out. The dynamics of the process of accumulation of proinflammatory cytokines (IL6, IL8, and TNFa) in the extracellular medium after contact of human blood cells with glycoproteins was studied. The source of glycoproteins was the cell lysate of Saccharomyces cerevisiae. The glycoproteins were immobilized on a polyacrylamide gel in a copolymerization reaction. The study of the effectiveness of immobilized and free glycoproteins was carried out in in vitro experiments on the whole blood of practically healthy donors. The effectiveness was evaluated by the increase in the concentration of cytokines in the blood plasma after contact with glycoproteins compared to the baseline level, as well as by comparing the effect of polyacrylamide gel without a ligand and simply incubating blood cells with saline solution.
Results. It was found that immobilized glycoproteins, as well as free ones, in contact with human peripheral blood lead to the activation of the synthesis of pro-inflammatory cytokines (IL6, IL8, and TNFa) by blood cells. The study revealed the peculiarities of cytokine synthesis depending on the form of contact of blood cells with the glycoprotein. It is shown that the rate of IL8 and TNFa synthesis is higher after blood contact with immobilized glycoproteins than with free-form glycoproteins.
Key words: cytokines, glycoproteins, yeast, interleukin-6, immunomodulatory
ВВЕДЕНИЕ
Сущностью иммобилизации биологически активных молекул является их прикрепление в активной форме к нерастворимой основе. Прикрепление молекул к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения молекул в органический или неорганический гель. Иммобилизация молекул позволяет:
♦ контролировать концентрацию активных молекул и положение активных группировок, необходимых для контакта;
♦ увеличить вероятность контакта молекулы с эффектором (в частности клетками крови человека);
♦ устранить возможность попадания активной молекулы во внешнюю вреду в свободном виде, обеспечивая возможность отделить биологически активную молекулу от раствора;
♦ повысить стабильность биомолекулы по отношению к разрушающим факторам среды.
В ряде случаев иммобилизация приводит к снижению активности. Причиной такого явления могут быть стерические ограничения, возникающие в том случае, когда иммобилизация препятствует непосредственному контакту между отдельными молекулами и таким-то образом мешает доступу эффектора. На активность иммобилизованных молекул могут оказывать влияние низко- и высокомолекулярные вещества, субстраты и продукты проводимой химической реакции. Для уменьшения этих недостатков используют водорастворимые носители с небольшой молекулярной массой, а также выбирают наиболее щадящие методы химического синтеза, которые не будут приводить к изменению первичной структуры и пространственной организации иммобилизованных молекул.
В данной работе изучали влияние иммобилизации на проявление иммуномодулирующих свойств
гликопротеидами клеточной стенки дрожжей. Это полисахарид с короткой белковой частью, чья биологическая активность в организме человека и животных заключается в:
♦ активации синтеза иммуноглобулинов (^М и IgG);
♦ активации продукции IL1 и IL2, IFNy, TNFa;
♦ увеличение концентрации белков острой фазы;
♦ ингибировании простагландинов;
♦ усиление фагоцитоза;
♦ активация NK, Т-киллеров, Т-хелперов;
♦ увеличение числа антителообразующих клеток;
♦ стимуляция кроветворения в костном мозге [1].
Аналитический обзор литературы показал, что полисахариды дрожжей относятся к одним из самых активных полисахаридов [2]. Распознавание р-глюканов нейтрофилами может осуществляться как с опсониза-цией, так и без нее [3]. Распознавание грибковых антигенов ассоциировано с TLR-2, TLR-6 дектином-1. Показано, что воздействие зимозана приводит к ассоциации TLR-2 с TLR-6 и активирует синтез цитоки-нов и хемокинов. При этом активируется фагоцитоз, эндоцитоз, окислительный взрыв и стимулируется синтез провоспалительных цитокинов [4].
Все перечисленное позволяет считать гликопро-теиды клеточной стенки дрожжевых клеток подходящим кандидатом в качестве лиганда для экстракорпоральной стимуляции продукции цитокинов клетками периферической крови человека. Ex vivo стимуляция с помощью иммобилизованного активного лиганда позволит добиться иммуномодулирующей активно -сти (активация клеток и увеличение синтеза цитоки-нов) без попадания молекулы в организм человека.
Целью исследования являлось изучение влияние химической иммобилизации на способность активировать продукцию цитокинов клетками периферической крови человека гликопротеидами клеточной стенки дрожжей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для получения биологически активного лиган-да из пекарских дрожжей их суспензировали в NaCl (0,9%). Затем проводили механическую обработку суспензии дрожжевых клеток в физиологическом растворе на аппарате РЦД 160 (диспергатор) в течение 2 ч в режиме тонкого измельчения (три зоны диспергирования) с использованием дополнительной зоны пульсационного сжатия до 200 Гц, при температуре до 35°С. Диспергированную суспензию обрабатывали жидким азотом, измельчали в ступке керамическим пестиком в течение 10 мин. Полученную массу центрифугировали 10 мин (1000 g), осадок удаляли. Надосадок центрифугировали 15 мин (3000 g) для осаждения крупных клеток и фрагментов клеточных стенок, осадок удаляли. Полученную фракцию фильтровали дважды: через капроновый фильтр и через мембранный фильтр с порами 0,45мкм.
Иммобилизация гликопротеидов лизата Saccha-romyces cerevisiae проводилась методом ацилирования лиганда и введение его в качестве мономера в процессе синтеза полиакриламидного геля.
Для исследования иммуномодулирующей активности использовали цельную периферическую кровь практически здоровых доноров. Статические стендовые эксперименты проводили сериями в триплетах. Гель с лигандом-эффектором помещали в емкость с двумя отверстиями и мембраной перед нижним отверстием, которое закрывалось на время эксперимента. По истечении времени инкубации отверстие открывалось. Таким образом, забор проб крови осуществлялся только в одном направлении, исключая пипетирование, для минимизации повреждения и контактной активации клеток. При разработке методики изучали необходимое время контакта лиганда-эффектора с клетками крови, поэтому пробы отбирались каждые 30 мин в течение 2 ч. Эксперимент проводился при комнатной температуре. В работе использовали кровь практически здоровых доноров (n=20). Исходная концентрация цитокинов в плазме крови доноров: IL6 — 0,00 (0,11; 0,67) пг/мл, IL8 - 2,25 (0,21; 3,27) пг/мл, TNFa -0,00 (1,10; 3,70) пг/мл.
Определение цитокинов проводили иммуно-ферментным методом. Статистический анализ и визуализацию полученных результатов осуществляли методами непараметрической статистки с использованием пакетов программ Statistica 10.0 и GraphPad Prism 6.0. Результаты представляли в виде медианы и 25 и 75 процентилей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В экспериментах со свободными ГП нарастание концентрации цитокинов во внеклеточной среде наблюдается на 30 мин раньше, чем в статических экспериментах с иммобилизированными ГП (рис. 1).
Увеличение концентрации IL6 отмечается на 90-й минуте (до 56,89 (56,76; 63,43) пг/мл). Ско-
рость синтеза в последние 30 мин составляет 7,50 (5,83; 8,54) пг/мин. Увеличение концентрации IL8 отмечается уже на 60-й минуте (до 126,34 [112,76; 152,43] пг/мл). Скорость синтеза в последние 30 мин составляет 8,39 (8,25; 8,95) пг/мин. Кон-
Рис. 1. Сравнительный анализ динамики синтеза провоспалительных цитокинов клетками крови человека после контакта с иммобилизированным и свободным гликопротеидами клеточной стенки дрожжей Fig. 1. Comparative analysis of the dynamics of the synthesis of proinflammatory cytokines by human blood cells after contact with immobilized and free glycoproteins of the yeast cell wall
центрация TNFa на 60-й минуте составила 182,34 (181,29; 254,34) пг/мл. Скорость синтеза в последние 30 мин составляет 8,69 (4,60; 9,53) пг/мин.
Сравнительный анализ скорости синтеза цитоки-нов клетками крови после контакта с иммобилизиро-ванными и свободными ГП дрожжей представлен на рис. 2.
Из полученных результатов следует, что в свободной форме ГП стимулируют синтез цитокинов, который происходит в среднем со скоростью 8,39 (7,50; 8,69) пг/мин. При иммобилизации ГП происходит изменение их активирующей способности. При контакте крови с иммобилизированными ГП скорость синтеза IL8 и TNFa увеличивается.
Статические эксперименты показали, что в процессе контакта иммобилизованных гликопротеидов клеточной стенки дрожжей с кровью человека происходит значительное увеличение концентрации IL6 в плазме крови (рис. 3). Через 90 мин контакта происходит повышение концентрации IL6 с 0,00 (0,01; 0,05) до 3,02 (1,72; 3,35) пг/мл, а через 120 мин статического эксперимента концентрация IL6 достигает 61,04 (40,30; 67,12) пг/мл. Значительный синтез IL8 и TNFa под действием иммобилизованных ГП дрожжей наблюдается с 60-й минуты эксперимента. Через 90 мин контакта происходит достоверное повышение концентрации IL8 с 3,95 (3,46; 4,30) пг/мл до 161,92 (129,23; 192,35) пг/мл. Через 120 мин эксперимента концентрация IL8 достигает 620,48 (545,96; 730,98) пг/мл. Концентрация TNFa через 90 мин эксперимента составила 277,10 (273,69; 332,25) пг/мл, через 120 мин - 682,38 (531,22; 696,36) пг/мл. Дисперсионный анализ с помощью критерия
Фридмана показал статистически значимые различия между группами (р<0,003).
Свободный ГП Иммобилизированный ГП
я
й
t
О
Я н о
60 п
40
20 ■
IL6
800
600
я 400 &
н
о
а н
2
200 "
800
600
& 400
t
о
а он 200
30 60 90
Время, мин
IL8
120
30 60 90
Время, мин
TNFa
120
30
60
Время, мин
90
120
Гель с ГП Гель без ГП
0
0
0
0
Рис. 2. Скорость синтеза провоспалительных цитокинов клетками крови человека после контакта с иммобилизированными и свободными гликопротеидами клеточной стенки дрожжей
Fig. 2. The rate of synthesis ofproinflammatory cytokines by human blood cells after contact with immobilized and free glycoproteins of the yeast cell wall
Рис. 3. Динамика синтеза провоспалительных цитокинов клетками крови человека после контакта с иммобилизированными гликопротеидами клеточной стенки дрожжей на полиакриламидном геле Fig. 3. Dynamics of proinflammatory cytokine synthesis by human blood cells after contact with immobilized yeast cell wall glycoproteins on polyacrylamide gel
Корреляционный анализ подтвердил наличие достоверной зависимости между синтезом провоспалительных цитокинов. Наиболее ранним цитокинов является TNFa, который, очевидно, стимулирует и поддерживает с помощью аутокринных и паракрин-ных механизмов активации синтез IL8 и IL6.
Предположительно клетками -продуцентами провоспалительных цитокинов, образующихся при контакте крови человека с гликопротеидами клеточной стенки дрожжей можно считать сегментоядерные лейкоциты, так как это наиболее многочисленный пул иммунокомпетентных клеток, представленных в периферической крови человека. Известно, что синтез цитокинов нейтрофилами может быть конститутивным и индуцибельным (активация осуществляется посредством Toll-подобных рецепторов). Существуют определенные научные противоречия, является ли синтез цитокинов нейтрофилами полностью de novo или же существует определенный внутриклеточный «запас» цитокинов. И тот и другой способ продукции цитокинов во внеклеточную среду возможен. Показано, что нейтрофилы содержат мРНК для продукции провоспалительных и некоторых других цитокинов. Хотя количество данной мРНК в 10—20 раз меньше, чем в других иммунокомпетентных клетках. Известно также, что гранулы нейтрофилов содержат какое-то количество уже синтезированных цитокинов (их количество значительно меньше, чем определяется во неклеточной среде во время экспериментов in vitro) [6, 7].
Анализ интенсивности синтеза различных про-воспалительных цитокинов проводили путем сравнения площади под динамической кривой и расчета скорости синтеза цитокинов за последние 30 мин эксперимента. Площадь под динамической кривой S
Л И Т Е РАТУ РА / R E F E R E N C E S
1. Беседнова Н.Н. Иммунотропные свой- 3. ства I-3; I-ô-betci-D-глюканов. Антибиотики и химиотерапия. 2000; 2: 37-44. [Besednova N.N. Immunotropic properties I-3; I-6-beta-D-glucans. Antibiotiki i himi-otercpiyc. 2000; 2: 37-44 (in Russian)] 4.
2. Noss I. Comparison of potency of variety of ß-glucans to induce cytokine production in human whole blood. Innate immun. 2013; 19: 10-9. https://doi.org/ 5. 10.1177/1753425912447129.
Для цитирования: Рябцева Т.В., Макаревич Д.А., Ермола Е.М. Влияние иммобилизации гликопротеидов клеточной стенки пекарских дрожжей на их иммуномодулирующую активность. Молекулярная медицина. 2021; 19 (6): 49-53. https://Coi.org/10.29296/24999490-2021-06-08
(TNFa)=19368, S (IL8)=15069, S (IL6)=1038. Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее интенсивно в статическом эксперименте синтезируется TNFa и IL8. Что подтверждается подсчетом скорости синтеза цитокинов за последние 30 минут статического эксперимента. Скорость синтеза TNFa и IL8 равны соответственно 13,51 (8,58; 12,14) пг/мл/мин и 15,28 (13,89; 17,95) пг/мл/мин. В то время как скорость синтеза IL6 в десятки раз меньше и составила 1,93 (1,29; 2,13) пг/мл/мин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработанные способы получения и иммобилизации гликопротеидов клеточной стенки дрожжей позволяют сохранить все иммуномодулирующие свойства. Иммобилизованные гликопротеиды клеточной стенки пекарских дрожжей, как и свободные, при контакте с периферической кровью человека приводят к активации синтеза провоспалительных цитокинов (IL6, IL8 и TNFa) клетками крови. Скорость синтеза IL8 и TNFa выше после контакта крови с иммобилизированными ГП, чем с ГП в свободной форме. Сравнительный анализ динамики синтеза провоспалительных цитокинов клетками крови человека после контакта с иммобилизированными и свободными гликопротеидами клеточной стенки дрожжей показал, что при иммобилизации ГП происходит
снижение их активности.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
munology. 2014; 5: 1-7. https://doi.org/ 10.3389/fimmu.2014.00508.
6. Cassatella M.A. Biological roles of neutrophil-derived granule proteins and cytokines. Trends in immunology. 2019; 40: 648-64. https://doi.org/ 10.1016/j. it.2019.05.003.
7. Tamassia N. Cytokine production by human neutrophils: revisiting the «dark side of the moon». Eur. J. Clin. Invest. 2018; 48: 1-10. https://doi.org/10.1111/eci.12952.
Поступила 2 апреля 2021 г.
For citation: Ryabtseva T.V., Makarevich D.A., Ermola E.M. Effect of immobilization of glycoproteins of the baker's yeast cell wall on their immunomodulatory activity. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (6): 49-53 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-06-08
Futosi K. Neutrophil cell surface and their intracellular signal transduction pathways. Int. Immunopharmacology. 2013; 17: 638-50. https://doi.org/ 10.1016/j. intimp.2013.06.034.
Brown G. Immune recognition of fungal p-glucans. Cellular Microbiology. 2005; 7: 471-9. https://doi.org/ 10.1111/j.1462-5822.2005.00505.x.
Tecchio C. Neutrophil-derived cytokines: facts beyond expression. Frontiers in im-
