CC BY
62
ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТ
© Коллектив авторов, 2015
П.В. Шумилов1, О.О. Хандамирова1, А.Е. Щиголева1, С.А. Румянцев1, Н.Е. Щиголева2,
М.И. Дубровская1, Ю.Г. Мухина1
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КРИТЕРИЕВ АКТИВНОСТИ
БОЛЕЗНИ КРОНА У ДЕТЕЙ
1ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, 2ФГБУ Российская детская клиническая больница МЗ РФ, Москва, РФ
P.V. Shumilov1, O.O. Khandamirova1, A.E. Shchigoleva1, S.A. Roumiantsev1, N.E. Shchigoleva2, M.I. Dubrovskaya1, Yu.G. Mukhina1
IMMUNOLOGY ASSESSMENT OF CROHN'S DISEASE ACTIVITY
CRITERIA IN CHILDREN
1N.I. Pirogov Russian National Research Medical University; 2Russian children's Clinical Hospital, Moscow, Russia
Целью работы было изучить характер спонтанной и индуцированной продукции цитокинов клетками крови у детей с разными вариантами течения и различной степенью активности болезни Крона (БК). У 22 пациентов с БК исследовали ILip, IL2, IL6, IL8, IFNy, TNFa, TNFp, IL4, IL10, IL12 в нативной сыворотке крови и их продукцию культурой клеток цельной крови (спонтанная и стимулированная LPS, MDP и LPS+MDP). Было показано, что максимальная продукция про-воспалительных цитокинов (ILip, IL6, IL8, TNFa) отмечалась при низкой продукции противовоспалительных цитокинов (IL4 и IL10) у пациентов с высокой и умеренной активностью по PCDAI, с изолированным поражением верхних отделов желудочно-кишечного тракта, стенози-рующим и/или пенетрирующем течением и при наличии внекишечных проявлений. Показатели SES-CD не отражают уровень иммунологической активности БК. Ключевые слова: болезнь Крона, дети, индекс активности, воспаление, цитокины.
The objective of the study — to examine the nature of spontaneous and induced cytokine production by blood cells in children with different types of Crohn's disease (CD). In 22 patients with CD were examined ILip, IL2, IL6, IL8, IFNy, TNFa, TNFp, IL4, IL10, IL12 in native serum and their production by cell culture of whole blood (spontaneous and stimulated LPS, MDP and LPS+MDP). The study revealed, that production of proinflammatory cytokines (IL1p, IL6, IL8, TNFa) with low production of anti-inflammatory cytokines (IL4 and IL10) in patients with high and moderate PCDAI activity, with isolated damage of upper gastrointestinal tract stenotic and/or penetrating flow and the presence of extraintestinal manifestations. Indicators of SES-CD does not reflect the level of immunological activity of CD.
Keywords: Crohn's disease, children, activity index, inflammation, cytokines.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем
в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений и летальности болезнь Крона (БК) занимает одно из ведущих
Контактная информация:
Шумилов Петр Валентинович - д.м.н., проф.,
зав. каф. госпитальной педиатрии № 1 ГБОУ ВПО
РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ
Адрес: Россия, 117997, г. Москва,
ул. Островитянова, 1
Тел.: (495) 936-93-74,
E-mail: peter_shumilov@mail.ru
Статья поступила 15.09.15,
принята к печати 19.10.15.
Contact Information:
Shumilov Petr Valentinovich - Ph.D., Prof. of
Hospital Pediatrics Department, Pirogov Russian
National Research Medical University
Address: Russia, 117997, Moscow,
Ostrovityanova str., 1
Tel.: (495) 936-93-74,
E-mail: peter_shumilov@mail.ru
Received on Sep. 15, 2015,
submitted for publication on Oct. 19, 2015.
57
мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1].
В последние годы отмечается стремительный рост ВЗК и особенно БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока [2]. При этом отмечается существенное «омоложение» этой болезни [3, 4]. Распространенность ВЗК в мире в настоящее время составляет от 2,2 до 6,8 на 100 000 населения, а БК - 3,5-4 на 100 000 населения. Примерно 25% случаев манифестации БК приходится на возраст до 18 лет [5, 6].
Этиология ВЗК до сих пор остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как генетически детерминированную дисрегуляцию иммунной системы хозяина на различные антигены, в т.ч. и резидентную микрофлору кишечника [7]. И в первую очередь эта иммунная дисфункция проявляется на уровне слизистой оболочки кишечника, где происходит максимальное взаимодействие микрофлоры с различными компонентами иммунной системы. Изменения числа или функций любого типа клеток с последующим высвобождением ими растворимых медиаторов воспаления могут привести к так называемому «неконтролируемому воспалению», а, следовательно, к развитию патологии, в т.ч. ВЗК [8]. Иммунопатогенез БК и язвенного колита отличаются уровнем дифференцировки и активации Т-клеточного звена иммунитета, хотя точные механизмы этого процесса до конца не известны. При обоих заболеваниях происходит активация Т-клеток, но при БК в силу преобладания в слизистой оболочке ОБ4-клеток с фенотипом Т-хелперов 1-го типа (Th1) имеет место продукция преимущественно IFNy, TNFa и IL23. Продукция цитокинов TM-клетками вызывает активацию макрофагов, которые, в свою очередь, продуцируют IL12, IL18 и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, что приводит к дальнейшей стимуляции Th1-клеток и замыкает порочный круг. Активированные макрофаги продуцируют спектр различных воспалительных цитокинов - TNF, IL1, IL6 [9-12]. Эти медиаторы усиливают процессы воспаления и повреждения тканей, что в результате приводит к клинической манифестации заболевания. Итогом чрезмерной Т-клеточной активности при ВЗК является возникновение чрезмерного и продолжительного синтеза цитокинов в очаге воспаления. Эта иммунологическая дисфункция, возможно, связана с подавлением контролирующих механизмов, в частности регуляторных клеток (CD4+CD25+FOXP3+, Th3, Tr1), в результате чего снижается экспрессия противовоспалительных цитокинов TGFß и IL10 [12].
БК до сих пор остается неизлечимым заболеванием. Терапия БК предусматривает многоступенчатые программы, включающие в себя противовоспалительную, цитостатическую, имму-номодулирующую терапию, для оптимального подбора которой важно оценить степень активно-
сти заболевания. С этой целью были разработаны различные схемы и индексы оценки активности воспалительного процесса. Попытки детального сравнения отдельных индексов между собой и оценки их информативности немногочисленны [13, 14], но сопоставления с иммунными механизмами воспаления не проводилось.
Целью данной работы было изучить характер спонтанной и индуцированной продукции цитокинов клетками крови у детей с разными вариантами течения и различной степенью активности БК.
Материалы и методы исследования
Группу исследования составили 22 ребенка с БК, находящихся в отделении гастроэнтерологии ФГБУ Российская детская клиническая больница МЗ РФ. У всех больных диагноз был установлен на основании стандартных методов исследования, включающих в себя клинические, рентгенологические, эндоскопические и гистологические критерии. Клиническую активность БК определяли с помощью Педиатрического индекса активности болезни Крона (РСБА1) [15]. Для определения эндоскопической активности БК применяли простой эндоскопический индекс активности болезни Крона (ЯЕЯ-СБ) [16].
Средний возраст обследованных детей составил 11,7±3,42 лет. В данной группе 75% приходилось на мальчиков и 25% - на девочек. Длительность заболевания составила 4,8±4,32 лет. По локализации патологического процесса все пациенты делились следующим образом: илеоколит - 44%, илеит - 29%, колит - 18%, изолированное поражение верхних отделов ЖКТ (ВОЖКТ) - 9%. Воспалительное (нестенозирую-щее непенетрирующее) течение отмечалось у 81,8%, стенозирующее и/или пенетрирующее течение - у 18,2%. Внекишечные проявления БК отмечались у 54,5% больных, среди них поражение суставов выявлялось у 31,8%, поражение печени - у 13,6%, поражение кожи и слизистых оболочек - у 9%. По РСБА1 все пациенты были разделены на больных с высокой (27%), умеренной (32%) и низкой (32%) клинической активностью, 9% детей находились в клинической ремиссии. По данным ЯЕЯ-СБ, высокая эндоскопическая активность БК отмечалась у 29%, умеренная - у 47%, низкая - у 18%, у 6% больных констатировалась эндоскопическая ремиссия.
Контрольную группу составили 20 соматически здоровых детей без признаков воспаления, госпитализированных для проведения планового хирургического лечения по поводу неослож-ненных форм паховой и пупочной грыжи. По возрастному и половому составу контрольная группа не отличалась от основной группы.
У детей исследуемой группы забор крови производили в утренние часы натощак. Забор крови у детей контрольной группы проводили в предоперационном периоде.
58
Нативную сыворотку получали путем центрифугирования крови в течение 15 мин при 2500 оборотах в минуту и хранили при температуре -80 0С до исследования. Для определения способности клеток цельной крови продуцировать цитокины их разводили 1:5 полной посадочной средой RPMI 1640 (ООО НПП «ПанЭко» Россия) с добавлением 10% феталь-ной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина. Для исследования культуры клеток было сформировано 4 группы проб: первая представляла собой клетки цельной крови без добавления стимуляторов; вторую группу составили клетки цельной крови, активированные только липополисахаридом (LPS); в третью группу включены клетки цельной крови, активированные только мурамилдипептидом (MDP); четвертая группа представляла собой сочетанную стимуляцию LPS+MDP цельной крови. Клетки были распределены в четырехлуночную планшету с плотностью 2,5 • 105 клеток в лунке и простимулированы MDP в концентрации 20 нМ и LPS в концентрации 20 нМ 100 пкг/ мл в соответствии с составленными группами исследования. Затем клетки инкубировали при температуре 37 0С, 5% СО2 в течение 24 ч. Бесклеточная составляющая была получена посредством центрифугирования на 2000 оборотах в течение 15 мин и хранилась при температуре -80 0С до исследования.
Уровни цитокинов TNFa, TNFß, IFNy, IL2, IL10, IL8, IL6, IL4, IL5, IL1ß, IL12p70 исследовали в натив-ной сыворотке и в четырех образцах, прошедших стимуляцию LPS и MDP с использованием цитоме-трического метода с помощью цитометра BD Fax Canto Flow Cytomix (США) и набора антител к цитокинам BMS810FF (Bender Med Sistem GmbH Viena Austria).
Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0. с расчетом критериев непараметрической статистики (медианы, 25-й и 75-й перцентилей, критерия Манна-Уитни, парного критерия Уилкоксона и критерия углового преобразования Фишера).
Результаты
При исследовании уровня цитокинов в нативной сыворотке крови у детей исследуемых групп (см. таблицу) выявлено, что у детей с БК отмечается существенное повышение IL1ß, IL4 (p<0,05), IL8, IL10 (p<0,05), IFNy (p<0,01), TNFa, TNFß, при этом у большинства детей контрольной группы уровень IL2, IL4, IL10, IFNy, TNFa, TNFß, IL12, IL5 был ниже порога чувствительности метода определения.
При оценке сывороточного уровня цитоки-нов в зависимости от локализации патологического процесса у детей с БК (рис. 1 и 2) обращает на себя внимание, что максимальные значения большинства исследуемых цитокинов (IL1ß, IL2, IL6, IL8, FNy, TNFa, TNFß) отмечаются у детей с изолированным илеитом и изолированным поражением ВОЖКТ, а в случае вовлечения в патологический процесс толстой кишки (изолированный колит, илеоколит) уровень провос-палительных цитокинов был значительно ниже.
Таблица
Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей исследуемых групп
Цитокины, пг/мл БК Контроль
IL1ß 39,4 [22,7-93,1] 17,5 [0-618]
IL2 0 [0-2,44] 0 [0-0]
IL4 1,28 * [0-44,5] 0 [0-0]
IL6 42 [0-183,7] 48,6 [38,3-133]
IL8 555,5 [78,9-2561,3] 135 [15,9-1146,7]
IL10 21,2 * [0-36,4] 0 [0-0,08]
IFNy 30,7 ** [0-1156] 0 [0-0]
TNFa 55,7 [9,74-117,9] 0 [0-139,7]
TNFß 21,7 [0,32-64] 0 [0-77,4]
IL12p70 0 [0-22,5] 0 [0-236,5]
IL5 0 [0-0,52] 0 [0-0]
*p<0,05 - по сравнению с контрольной группой; **p<0,01 - по сравнению с контрольной группой.
140
120
л
^/100
г пг
ов, 80
н и к
g 60
и И
нь 40 е в о
£ 20
1234'1234 1234 1234'1234'1234 1234 1234 1234' 1234 1Ь1р 1Ь2 1Ь4 1Ь6 1Ь10 №N7 ТОТаТОТр Ш2 1Ь5
Рис. 1. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с БК с различной локализацией.
Здесь и на рис. 2: 1 - илеит, 2 - колит, 3 - илеоколит, 4 - ВОЖКТ.
59
100
80
я
0
1
И
0
55!
И -с
1
^
я о а
60
40
20
1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1Ь1р 1Ь2 1Ь4 1Ь6 1Ь10 IFNY TNFaTNFp 1Ь12 1Ь5
Рис. 3. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с БК с различной степенью клинической активности.
Здесь и на рис. 4: 1 - клиническая ремиссия, 2 - низкая активность, 3 - умеренная активность, 4 - высокая активность.
Наиболее низкие значения 1Ь6 и 1Ь8 отмечались у детей с БК с поражением толстой кишки в виде проктита. Уровень 1Ь4, 1Ь10, 1Ь12, 1Ь5 был примерно одинаков у детей при всех формах БК. Статистически значимых различий уровня цитокинов в зависимости от локализации патологического процесса при БК у детей выявлено не было.
При анализе уровня цитокинов в нативной сыворотке крови в зависимости от клинической активности (рис. 3 и 4) было установлено, что у детей с БК в период обострения отмечается существенное повышение уровня 1Ь1р, №N7, TNFa, 1Ь12, и их уровень практически одинаков и не зависит от индекса клинической активности. Уровень TNFp был несколько выше при умеренной и высокой клинической активности, уровень 1Ь4 и 1Ь8 - выше в 2 раза, 1Ь6 - в 6 раз, а 1Ь2 -более чем в 15 раз выше, чем при низкой активности. При низкой клинической активности выявлено более высокое значение 1Ь10. Период клинической ремиссии у детей с БК характеризуется более низким уровнем 1Ь1р, 1Ь8 и TNFa, значения других провоспалительных цитокинов (1Ь2, 1Ь6, №N7, 1Ь12) были ниже порога чувствительности метода определения.
При исследовании особенностей цитоки-нового спектра в зависимости от эндоскопической активности обращают на себя внимание существенные отличия основных показателей
по сравнению с продукцией цитокинов в зависимости от индекса клинической активности. Максимальные значения как про-, так и противовоспалительных цитокинов (1Ь1р, 1Ь2, 1Ь6, 1Ь8, №N7, TNFa, TNFP, 1Ь4, 1Ь10, 1Ь12) отмечаются у детей с эндоскопической ремиссией, а минимальные значения этих цитокинов выявлены у детей с низкой эндоскопической активностью БК (рис. 5 и 6).
При анализе сывороточного уровня цито-кинов у детей с БК в зависимости от характера течения (рис. 7 и 8) было отмечено, что у детей с воспалительной (нестенозирующей, непенетри-рующей) формой течения характерно повышение островоспалительных цитокинов (1Ыр, 1Ь6, 1Ь8, TNFa, TNFP), особенно 1Ь6, 1Ь8, в то время как уровень 1Ыр и TNFa был несколько ниже по сравнению с их уровнем у детей, имевших стенозы или свищи. При стенозирующем и/или пене-трирующем течении более характерны высокие уровни №N7, 1Ь4, 1Ь10, 1Ь12, TNFa. Среди всех больных БК следует особо выделить пациентов с изолированными стенозами, так как эти пациенты имели статистически значимо более высокие значения TNFp, чем пациенты без стенозов (р=0,035).
При анализе сывороточного уровня цитоки-нов у детей с БК также было установлено, что при течении с наличием внекишечных проявлений иммунный ответ характеризуется более высоким уровнем 1Ыр, 1Ь2, 1Ь6, 1Ь8, 1Ь10, 1Ь12 (рис. 9 и 10), а повышение №N7 у этих детей ста-
250
150
50
пги ■
тп
1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 ПЛр 1Ь2 1Ь4 1Ь6 И0 IFNy TNFa TNFp ПЛ2 1Ь5
Рис. 5. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с БК с различной степенью эндоскопической активности.
Здесь и на рис. 6: 1 - эндоскопическая ремиссия, 2 - низкая активность, 3 - умеренная активность, 4 - высокая активность.
200
100
60
100
J/ 90
t 80 Я 70
S 50
I40
И 30
Ф
Я 20 £ 10
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 ILlß IL2 IL4 IL6 IL10 IFNy TNFa TNFß IL12 IL5
Рис. 7. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с БК с различным течением.
Здесь и на рис. 8: 1 - нестенозирующее, непенетрирую-щее, 2 - стенозирующее и/или пенетрирующее течение.
900 800
700 600
оо 500 —
400
g 300 ft
К» 200
100
Рис. 8. Уровень ^8 в нативной сыворотке крови у детей с БК с различным течением.
80
Ч 70
И 60 я
S 50
s
§ 40
г
S
и 30 я
I
S 20
О
а
к» 10
12 12 12 12 12 12 12 12 12 IL1ß IL2 IL4 IL6 IL10 TNFa TNFß IL12 IL5
Рис. 9. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с БК в зависимости от наличия внекишечных проявлений.
Здесь и на рис. 10: 1 - без внекишечных проявлений, 2 - с внекишечными проявлениями.
£
00
J
м Fh
Я H н е в о
£
S 800
IL8
IFNy
Рис. 10. Уровень IL8 и IFNy в нативной сыворотке крови у детей с БК в зависимости от наличия внекишечных проявлений.
тистически значимо (p<0,05). При отсутствии внекишечных проявлений БК характеризуется более высоким уровнем TNFa, TNFß и IL4, однако данные различия не были статистически значимыми.
Учитывая, что уровень цитокинов в нативной сыворотке крови зависит от многих факторов и не всегда может отражать действительные воспалительные процессы в организме больного ребенка, мы исследовали продукцию цитокинов в культуре цельной крови. Оценивали как спонтанную продукцию цитокинов клетками периферической крови, так и при стимуляции наиболее важными лигандами Толл-подобного рецептора 4 - липополисахаридом (LPS) и цито-плазматического рецептора NOD2 - мурамил-пептидом (MDP) и их комплексом (LPS+MDP). Эти стимуляторы выбраны не случайно, так как они входят в состав клеточной стенки большинства бактерий кишечного микробиома.
При сравнении уровня спонтанной продукции цитокинов клетками периферической крови с их уровнем в нативной сыворотке крови обращают внимание существенные различия. При спонтанной продукции у детей с БК отмечается более высокая продукция IL6 - в 25 раз выше, чем в контрольной группе (p<0,01). При БК также отмечается высокий уровень IL1ß и TNFa. У здоровых детей уровень этих цитокинов был равен нулю. Для здоровых детей характерна крайне высокая продукция IFNy (p<0,01), IL12 (p<0,01), IL4 (p<0,01), а уровень IL10 более чем в 25 раз выше (p<0,01), чем у детей с БК.
При анализе продукции отдельных цито-кинов в зависимости от вида стимуляции прослеживаются закономерности, выявленные при спонтанной продукции. При анализе динамики IL1ß, IL6, TNFa у детей с БК минимальные значения отмечаются в нестимулированной пробе, с более высокими значениями при стимуляции LPS, MDP, а максимальные значения выявлены в пробах с комплексной стимуляцией (LPS+MDP), эти различия для всех трех цитоки-нов статистически значимы (p<0,01).
Анализ продукции цитокинов культурой цельной крови на фоне стимуляции компонентами бактериальной стенки у детей с БК показал, что локализация патологического процесса у детей имеет существенное значение (рис. 11). У детей с изолированным поражением ВОЖКТ отмечались максимальные значения как спонтанной, так и стимулированной продукции IL1ß, IL2, IL6, TNFa, IL4 и IL5, по сравнению с другой локализацией БК. Минимальные значения продукции цитокинов отмечены в нестимули-рованных пробах при высокой продукции при стимуляции MDP и особенно при комплексной стимуляцией MDP и LPS, однако статистически значимых различий получено не было.
Илеит характеризовался минимальными значениями IL1ß и IL6. Продукция TNFa у детей с илеитом была несколько ниже, чем у детей
60
1200
1000
400
200
61
(О
%
f
да
S о Н
\ Ю
О
(N «
S №
н
<
S <
щ С
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
4658,6
IL1 LPS+MDP IL1 MDP IL1 LPS
IL1 спонтанно
1000 2000 3000 4000 5000 IL1, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
2144,6 2126
12261,2 2144,6 2126
30&
12043,7 2144,6 2126
| 1! ¡09,8 668
87,4
,
I TNFa LPS+ MDP
I TNFa MDP
TNFa LPS
TNFa спонтанно
2000 3000 4000
TNFa, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
5000 10000 15000 20000 IL6, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 IL8, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
IL4 LPS+MDP IL4 MDP IL4 LPS IL4 спонтанно
15 20 25 30 IL4, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Го
Илеит о
200 400 600 800 1000 1200 1400 IL10, пг/мл
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
I 591,8
,
IL2 LPS+MDP IL2 MDP IL2 LPS 1L2 спонтанно
Изолированное поражение ВОЖКТ
Илеоколит
Колит
Илеит
IL5 LPS+MDP IL5 MDP IL5 LPS IL5 спонтанно
200 400 600 800 2 4
^2, пг/мл ^5, пг/мл
Рис. 11. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с БК с различной локализацией.
с другой локализацией БК, но она имела свои особенности. Максимальные значения TNFa у этих детей отмечались в спонтанной продукции и особенно в пробе с LPS, в то время как у детей с поражением толстой кишки и ВОЖКТ более
62
высокая продукция выявлялась при комплексной стимуляции. Для детей с илеитом также были характерны максимальные значения ^10, особенно при комплексной стимуляции, что превышало его продукцию при другой локализации
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
1580,8
2163,1
?34,8 1123,7
I ПЛ LPS+MDP I ПЛ MDP ПЛ LPS
ПЛ спонтанно
т
2000 3000
IL1, пг/мл
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая I37
500 1000 1500 2000 TNFa, пг/мл
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
Высокая активность
Умеренная
активность О о
Низкая активность
Клиническая ремиссия
10000 15000 IL6, пг/мл
■ IL4 LPS+MDP
■ TL4 MDP
IL4 LPS
■ IL4 спонтанно
20 30
IL4, пг/мл
О О
о
29,4
I IL2 LPS+MDP I IL 2 MDP TL2 LPS TL 2 спонтанно
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
Высокая активность
Умеренная активность
Низкая активность
Клиническая ремиссия
2000 4000 6000 8000 10000 12000 IL8, пг/мл
1000 1500 2000 2500 IL10*, пг/мл
,68 1,58
Hi 00 00
9,34
9,71 9,78
IIL5 LPS+MDP IIL5 MDP IL5 LPS IL5 спонтанно
1000 1500 2000 IL2, пг/мл
6 8 IL5, пг/мл
ремиссия
Рис. 12. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с БК с различной клинической активностью.
Здесь и на рис. 13: *р<0,05.
н О
из
<
л
£ ¡3 ас ас о
5
ai
<
н л
Щ
и и
5 <
S
<
< <
s
Щ
H
<
s
О
ас
БК в 1,9 раза, но было в 2,2 раза ниже, чем у детей контрольной группы (p<0,01). Продукция IL10, независимо от локализации патологического процесса БК, была выявлена преимущественно только в пробах с MDP и комплексом
LPS+MDP. Также дети с илеитом характеризовались максимальными значениями IL8 по сравнению с детьми с другой локализацией БК (p>0,05). Самая высокая продукция IL8 отмечена в пробах LPS и особенно с комплексом
63
и
ПЛ LPS+MDP IL1 MDP IL1 LPS
11,1 спонтанно
^ о
a &
о о
33 и
2000 3000 4000 IL1, пг/мл
5000 6000
6202,97
10000 15000
IL6, пг/мл
£8,9 8,5
■ IL4 LPS+MDP
■ IL4 MDP
IL4 LPS
■ IL4 спонтанно
В 42,2 39,94
0
20 30 40
IL4, пг/мл
IL2 LPS+MDP IL2MDP IL2LPS IL2 спонтанно
29,38
400 600
IL2, пг/мл
>4,3
1000 2000 3000
TNFa, пг/мл
2000 4000 6000 8000
IL8, пг/мл
2 „2
aRa ккк
О К Тч
■ ILIO
LPS+MDP
■ ILIO MDP
- ILIO LPS
ILIO
спонтанно
500 1000 1500
IL10, пг/мл
2
&
aRa ккк
OSH
Я % 2 2 ^ о
а а
о о
33 и
*
IIL5 LPS+MDP IIL5 MDP IL5 LPS IL5 спонтанно
5 10 15
IL5, пг/мл
Рис. 13. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с БК с различным течением.
LPS+MDP, хотя у детей с поражением толстой кишки и ВОЖКТ уровень этого интерлейкина был выше при изолированной стимуляции LPS, чем при комплексном воздействии LPS+MDP. Медиана продукции IL2, IL4 и IL5 во всех исследуемых пробах культуры цельной крови у детей с илеитом была равна нулю.
Дети с поражением толстой кишки в виде изолированного колита и илеоколита не имели существенных различий в продукции исследуемых цитокинов, за исключением ^5.
При изучении особенностей продукции цитокинов клетками цельной периферической крови детей с БК в зависимости от клинической актив-
64
2000 3000 4 IL1, пг/мл
LI LPS+MDP LI MDP LI LPS LI спонтанно
I
5000 6000
10000 15000 IL6, пг/мл
20 30 40
IL4, пг/мл
IL2 LPS+MDP IL2MDP IL2 LPS IL2 спонтанно
1000 1500 2000 TNFa, пг/мл
IL8
LPS+MDP
1000 2000 3000 4000 5000 6000 IL8, пг/мл
■ ILIO
LPS+MDP
■ ILIO MDP
- ILIO LPS
ILIO
спонтанно
500 1000 1500
IL10, пг/мл
IL5 LPS+MDP IL5 MDP IL5 LPS IL5 спонтанно
10 15 20 25 IL2, пг/мл
15 20 25
IL5, пг/мл
Рис. 14. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с БК в зависимости от наличия внекишечных проявлений.
Н
О
из
<
л
£ ¡3 ас ас о
5
Я
<
н
№
щ
¡J
и
5 <
S
<i <
<
S
№
щ
н
<i S
О
ас
ности (рис. 12) было выявлено, что для активной стадии заболевания характерно преобладание продукции основных провоспалительных цитокинов: TNFa, IL6, ^8, уровень которых был выше, чем в период клинической ремиссией, при этом уровень и спонтанной и стимулированной продукции этих цитокинов не зависел от
степени клинической активности. Уровень IL10, IL6 и IL8 у детей с активной стадией БК был минимальным в нестимулированных пробах, постепенно возрастал на фоне стимуляции LPS, MDP и был максимальным в пробах с LPS+MDP. Уровень IL8 был максимальным при стимуляции LPS, превышая концентрацию в пробах с
65
MDP и LPS+MDP в 1,4-1,7 раза (p<0,01). У детей в стадии клинической ремиссии уровень IL8 был максимальным при комплексной стимуляции LPS+MDP. Уровни других провоспалительных цитокинов (ILip, TNFa, IL6) в клиническую ремиссию были максимальными в спонтанных пробах, на фоне стимуляции продукция этих цитокинов снижалась. Период ремиссии характеризовался высокой спонтанной продукцией IL4 и IL10, на фоне стимуляции их уровень повышался в 1,9 и 4,1 (p<0,05) раза соответственно. Для детей в активной стадии продукция этих цитокинов отмечалась только при стимуляции, в спонтанных пробах IL4 и IL10 не определялись.
При изучении особенностей продукции цито-кинов клетками цельной крови детей с БК в зависимости от индекса эндоскопической активности не было выявлено значимых различий между пациентами, имеющими эндоскопические признаки активности, и пациентами с эндоскопической ремиссией.
При анализе особенностей продукции цито-кинов клетками цельной периферической крови детей с БК в зависимости от типа клинического течения (рис. 13) было выявлено, что для детей, у которых БК приводит к развитию стенозов, свищей или пенетраций, отмечается более активная продукция основных провоспалительных цитокинов (IL1p, IL6, IL8, TNFa) по сравнению с детьми с воспалительным (нестенозирующим непенетрирующим) течением. При этом следует отметить, что дети с воспалительным течением БК имели в 2 раза более высокую спонтанную продукцию IL6. У детей со стенозирующим и/ или пенетрирующим течением минимальные значения IL1p, IL6, IL8 и TNFa отмечаются в спонтанной пробе, на фоне стимуляции LPS и MDP имеет место усиление их продукции, и максимальное их значение выявляется в пробе с комплексной стимуляцией LPS+MDP. По уровню спонтанной продукции IL1P различия между группами с разным течением БК были статистически значимы (p<0,05). У детей со стенозами и/или свищами также отмечены более высокие значения IL2 и IL5. Продукция IL2 отмечена только у детей со стенозирующим и/или пене-трирующим течением и только при стимуляции MDP или комплексом LPS+MDP.
Для детей с нестенозирующим непенетриру-ющим течением были характерны более высокие значения как спонтанной, так и стимулированной продукции противовоспалительных интерлейкинов (IL4, IL10). Высокая спонтанная продукция IL10 является маркером неосложнен-ного течения БК у детей.
Анализ особенностей продукции цитокинов клетками периферической крови детей с БК в зависимости от наличия внекишечных проявлений (рис. 14) показал, что пациенты с внеки-шечными проявлениями имеют более высокие показатели продукции IL1p, TNFa, IL6, IL8, IL2 и IL5, чем дети без внекишечных прояв-
лений. Продукция IL2 и IFNy была выявлена только у детей с внекишечными проявлениями. Особенностью детей с внекишечными проявлениями также являются более высокие значения спонтанной продукции IL1p, TNFa, IL6, IL8, которые выше в 4,9, в 2,3, в 2,8 и в 1,6 раза соответственно, чем у детей без внекишечных проявлений. Спонтанная продукция IL1p, TNFa, IL6 у этой группы детей была выше, чем при стимуляции LPS и MDP, максимальные значения IL1P и TNFa были отмечены при комплексной стимуляции LPS+MDP. Уровень IL8 у детей с внеки-шечными проявлениями независимо от наличия и характера стимуляции оставался неизменным, его колебания не превышали 7,5%.
Дети без внекишечных проявлений характеризовались более высокой продукцией IL8 при стимуляции LPS+MDP и высокими значениями IL4 иIL10.
Заключение
Подводя итог, следует отметить, что при исследовании системы продукции цитокинов у детей с БК наиболее показательными являются изменения показателей спонтанной и стимулированной продукции в культуре цельной крови, которые отражают основные иммунологические нарушения, происходящие в организме детей с БК с различной локализацией, течением и клинической активностью. При оценке уровня и спектра цитокинов в сыворотке крови также прослеживаются основные закономерности, но степень их выраженности нивелируются воздействием других факторов внешней и внутренней среды. При исследовании спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре цельной крови дети с БК имели более высокие значения провоспалительных цитокинов (IL1P, IL6, IL8, TNFa). Уровень противовоспалительных IL4 и IL10 при БК был существенно ниже (в 20 и 2 раза соответственно, p<0,05), чем в контрольной группе.
При сопоставлении оценки клинической активности с использованием педиатрического индекса активности БК (PCDAI) с уровнем продукции исследуемых цитокинов показана высокая информативность этого индекса. Дети с высокой и умеренной клинической активностью имели максимальную продукцию основных про-воспалительных цитокинов (TNFa, IL6, IL8), в то время как клиническая ремиссия характеризовалась максимальной продукцией основного противовоспалительного цитокина - IL10.
В нашем исследовании еще раз было подтверждено, что эндоскопические методы оценки активности БК являются крайне субъективными и не всегда отражают истинную тяжесть состояния патологического процесса. Нами не было выявлено совпадения оценки активности БК с применением простого эндоскопического индекса активности БК (SES-CD), как с уровнем основных про- и противовоспалительных
66
цитокинов в нативной сыворотке крови, так и со спонтанной и стимулированной их продукцией в культуре клеток.
В качестве дополнительных показателей высокой активности БК могут быть использованы наличие изолированного поражения подвздошной кишки и особенно ВОЖКТ, которое характеризовалось максимальной продукцией провос-палительных цитокинов, а также наличие вне-кишечных проявлений болезни. На агрессивный характер течения также указывает стенозирую-щее и/или пенетрирующее течение БК, которое характеризовалось высокой продукцией таких провоспалительных цитокинов, как TNFa, 1Ьб, 1Ь8, и низкой продукцией 1Ь10. Статистически значимое повышение продукции №N7 при стено-
зирующем течении может указывать на высокую активность фибробластов и ускорение процессов склерозирования стенки кишки.
Таким образом, нами показано, что наиболее информативным показателем активности БК является педиатрический индекс активности БК (РСБА1), который может быть использован для оценки тяжести состояния пациентов и мониторирования эффективности лечения. Показателями агрессивного течения БК являются изолированное поражение ВОЖКТ, наличие внекишечных проявлений и стенози-рующее и/или пенетрирующее течение, наличие которых может служить показанием для более интенсивных режимов индукционной терапии.
Литература
1. Григорьева ГА., Мешалкина Н.Ю. Болезнь Крона. М: ОАО «Издательство «Медицина», 2007: 37-38.
2. Ng SC, Bernstein CN, Vant MH, et al. Epidemiology and natural history task force of the International Organization of Inflammatory Bowel Disease (IOIBD). Geographical variability and environmental risk factors in inflammatory bowel disease. Gut. 2013; 62 (4): 630-649.
3. GaspsrettoM, Guariso G. Highlights in IBD epidemiology and its natural history in paediatric age. Gastroenterol. Res. Pract. 2013; 2013: 829040.
4. Gower-Rousseau C, Vasseur F, Fumery M, et al. Epidemiology of inflammatory bowel disease: new insights from a French population-based registry (EPIMAD). Dig. Liver Dis. 2013; 45 (2): 89-94.
5. Benchimol EI, Fortinsky KJ, Gozdyra P, et al. Epidemiology of pediatric inflammatory bowel disease: a systematic review of international trends. Inflamm. Bowel Dis. 2011; 17 (1): 423-439.
6. Cosnes J, Gower-Rousseau C, Seksik P, Cortot A. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2011; 140 (6): 1785-1794.
7. Goyette P, Labbе C, Trinh TT, et al. Molecular pathogenesis of inflammatory bowel disease: genotypes, phenotypes and personalized medicine. Ann. Med. 2007; 39 (3): 177-199.
8. Pallone F, Monteleone G, Monteleone I, et al. The immune system in inflammatory bowel disease. In: Inflammatory bowel diseases. J. Satsangi, L. Sutherland, eds. Churchill Livingstone, Philadelphia, 2003: 85-93.
9. Krajina T, Leithauser F, Moller P, et al. Colonic lamina propria dendritic cells in mice with CD4+T cell-induced colitis. Eur. J. Immunol. 2003; 33: 1073-1083.
10. Vainer B, Nielsen OH, Hendel J, et al. Colonic expression and synthesis of interleukin 13 and interleukin 15 in inflammatory bowel disease. Cytokine. 2000; 12: 1531-1536.
11. Brand S, Stauolinger T, Schnitzler F, et al. The role of Toll-lake receptor 4 Asp 299gly and Th399 ile polymorphisms and Card15/Nod2 mutation in the susceptibility and phenotype of Crohns disease. Inflamm. Bowel Disease. 2005; 11 (7): 645-652.
12. Toms C, Powrie F. Control of intestinal inflammation by regulatory T cells. Microbes. Infect. 2001; 3: 929-935.
13. Цимбалова Е.Г. Клинико-лабораторные проявления и критерии активности воспалительных заболеваний кишечника у детей: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М., 2005: 28 с.
14. Венедиктова М.М. Взаимосвязь клинических, лабораторных и эндоскопических критериев активности болезни Крона у детей: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. М., 2014: 25 с.
15. Loonen HJ, Griffiths AM, Merrus MP, et al. A critical assessment of items on Pediatric Crohn's Disease Activity Index. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2003; 36 (1): 90-95.
16. Daperno M, D'Haens G, Van Assche G. Development and validation of a new, simplified endoscopic activity score for Crohn's Disease: the SES-CD. Gastrointest. Endosc. 2004; 60: 505-512.
67
