CC BY
13ЯНВАРЬ - ФЕВРАЛЬ 2013
УДК 547.1 : 615.917
Влияние хронической интоксикации фосфорорганическими инсектицидами на фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов, показатели системы иммунитета и содержание провоспалительных цитокинов в крови
П.Ф. Забродский, М.С. Громов, М.С. Шехтер
Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ», г. Самара
В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что хроническая интоксикация фосфорорганическими соединениями карбофосом и метафосом (по 0,01 DL50 ежедневно, в течение 30 суток) существенно снижает фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов, активность естественных клеток-киллеров, антите-лозависимую клеточную цитотоксичность и продук-
цию провоспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-ф и ИЛ-6.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов, холинергический антивоспалительный путь, иммунотоксичность, цитокины.
Введение. В сельском хозяйстве, в различных отраслях промышленности, в медицине и быту используется большое число антихолинэстеразных веществ. В основном это вещества, относящиеся к фосфорор-ганическим соединениям (ФОС). Широкое использование данных токсикантов в качестве инсектицидов, а также уничтожение боевых фосфорорганических веществ может приводить к загрязнению окружающей среды, вызывать интоксикации людей и животных [4, 15]. Не вызывает сомнения необходимость исследования механизмов формирования постинтоксикационного иммунодефицитного состояния при отравлениях ФОС, в частности функции фагоцитарно-моноцитар-ной системы (ФМС) с целью профилактики и лечения, возникающих при этом различных инфекционных осложнений и заболеваний [4].
При хроническом воздействии ФОС возможна реализация холинергического антивоспалительного пути (механизма) - «cholinergic anti-inflammatory pathway» [2, 9, 12, 13, 14], который включает активацию м-холинорецепторов (mAChR) головного мозга, модулирующие иммунорегуляторную функцию блуж-даюшего нерва; возбуждение эфферентных волокн n. vagus; действие ацетилхолина на рецепторы; активацию н-холинорецепторов (в частности, a7nAChR) клеток ФМС. В клетках ФМС возникновение антивоспалительного эффекта обеспечивается киназой JAK2, фактором транскрипции STAT3, транскрипционным фактором NF-kB. Под влиянием холинергиче-ской стимуляции «включение» данных биохимических механизмов клетки ингибирует продукцию ими a-фактора некроза опухоли (ФНОх), протеина B1 - HMGB1, макрофагально-воспалительного проте-ина-2 - MIP-2, интерлейкинов ИЛ-ф, ИЛ-6 [8].
Таким образом, холинергическая стимуляция вызывает активацию ацетилхолином a7nAChR клеток ФМС-системы (макрофагов, моноцитов и нейтро-
филов), что приводит к снижению продукции этими клетками (а также лимфоидными дендритными клетками) провоспалительных цитокинов [3, 7, 11, 12].
Целью исследования явилось определение влияния хронической интоксикации ФОС на фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов (ФМАН) и продуцируемых ими и другими клетками системы иммунитета провоспалительных цитокинов ФНОх и ИЛ-lß, ИЛ-6.
Материал и методы исследования. Опыты проводили на нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-240 г в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708 н) ФОС (карбофос и метафос) - вводили подкожно ежедневно в течение 30 суток в дозе 0,01 DL50 (DL50 данных инсектицидов составляли при подкожном введении соответственно 815,4+28,0 и 25,3+2,6 мг/кг). Оценку функции ФМС проводили по показателям ФМАН через 30 суток после введения первой дозы ФОС путем определения фагоцитарного показателя (ФП), фагоцитарного числа (ФЧ), индекса активности нейтрофилов (ИАН) в спонтанном и индуцированном НСТ-тестах (НСТ сп., НСТ инд.) общепринятыми методами. Для оценки ФП и ФЧ использовали стрептококк (штамм 2432) [4].
Показатели клеточных иммунных реакций оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [4, 5] после хронической интоксикации ФОВ через 30 суток после первой инъекции антихолинэстеразных веществ. Активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) определяли по показателю естественной цитотоксичности спектрофотометрически. Функцию К-клеток изучали по показателю антителозависимой клеточной цитоток-сичности (АЗКЦ), который определяли через четверо суток после иммунизации крыс 108 эритроцитами барана (ЭБ), используя их спленоциты, спектрофотометри-
Токсикологический вестник (i 18)
ческим методом. Иммунизацию проводили на 26-е сутки после первого введения ФОС. При оценке ФМАН и иммунных реакций животные получали суммарную дозу ФОС (карбофоса и метафоса), составляющую 0,3
DL50*
Концентрацию провоспалительных цитокинов (ФНОх, ИЛ-lß и ИЛ-6) определяли в плазме крови крыс после хронической интоксикации ФОС через 30 суток методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) [4, 5], используя реактивы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int.
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием ¿-критерия достоверности Стьюден-
Результаты и обсуждение. Под влиянием хро-
нической интоксикации ФОС отмечалась существенная редукция ФМАН (табл. 1). Через 30 суток после действия карбофоса ФП, ФЧ индексы активности нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тестах уменьшались соответственно в 1,77; 1,49; 1,94 и 1,24 раза (р < 0,05), а после интоксикации метафосом - в 1,48; 1,66; 1,55 и 1,33 раза (р < 0,05) соответственно.
Таблица 1
Изменение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов крыс и показателей клеточных иммунных реакций под влиянием хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,3 0Ц0, 30 сут) (М ± т, п = 8 - 10)
Параметры Контроль Карбофос Метафос
Фагоцитарный показатель, % 33,4+2,9 18,9+2,3* 22,5+1,9*
Фагоцитарное число, у.е. 2,54+0,22 1,70+0,15* 1,53+0,17*
НСТ-тест спонтанный, ИАН 0,31+0,03 0,16+0,02* 0,20+0,02*
НСТ-тест ндуцированный, ИАН 0,52+0,05 0,42+0,04* 0,39+0,04*
Активность ЕКК, % 34,1+3,0 26,3+2,3* 22,0+2,5*
АЗКЦ, % 13,3+1,4 9,2+1,0* 10,1+1,1*
Примечания. ИАН - индекс активности нейтрофилов; у.е. - условные единицы (среднее число микробных клеток, поглощенных одним нейтрофилом); * р < 0,05 по сравнению с контролем.
Активность ЕКК и АЗКЦ под влиянием карбофоса снижались соответственно в 1,30 и 1,46 раза (р < 0,05), а после отравления метафосом - в 1,55 и 1,32 раза (р < 0,05). По степени редукции ФМАН, естественной цитотоксичности и АЗКЦ эффекты ФОС в эквилетальных дозах существенно не отличались.
Действие ФОС на ФМАН, вероятно, реализуется вследствие взаимодействия токсикантов и их метаболитов с НАДФН и НАДФ+. Действие ФОС может быть также связано с ингибирова-нием ядами и продуктами их биотрансформации ФАД+, ФАДН, восстановленного и окисленного убихинона, цитохрома Ь245 лейкоцитов или иными механизмами нарушения функционирования НАДФН-оксидазного комплекса нейтрофилов. Кроме кислородзависимых антиинфекционных систем фагоцитоза ФОС поражают и кислороднеза-висимые микробицидные системы фагоцитов (ней-трофилов) [1].
Не исключено, что редукция ФМАН может быть связана с ингибированием ФОС эстераз цитозоля клеток ФМС (а-нафтила-цетатэстеразы, а-нафтилбутиратэстеразы,
a-нафтил-AS-D-ацетатэстеразы, a-нафтил-AS-D-хлорацетатэстеразы) [4, 6], а также с инициацией
ФОС перекисного окисления липидов [4].
Супрессия активности ЕКК и АЗКЦ, вероятно, обусловлена инактивацией ФОС ацетилхолинэстеразы естественных клеток-киллеров и К-клеток [4].
Иммуносупрессивный эффект ФОС сопровождался снижением в крови концентрации провоспалительных цитокинов. Так, после хронической интоксикации карбофосом в крови крыс ФНОа, ИЛ-1|3 и ИЛ-6 уменьшались соответственно в 1,45; 1,91 и 1,55 раза (р < 0,05), а после отр авления метафосом - в 1,67; 1,63 и 1,40 раза (р < 0,05) соответственно (табл. 2).
Как уже упоминалось, уменьшение продукции провоспалительных цитокинов нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и, в меньшей степени, другими клетками иммунной системы происходит вследствие реализации под влиянием холинерги-ческой стимуляции холинергического антивоспалительного пути (механизма) - «cholinergic antiinflammatory pathway» (активация ацетилхолином a7nAChR клеток ФМС, приводящая к редукции синтеза провоспалительных цитокинов) [3, 9, 12, 13]. Вероятно, снижение продукции этих цитоки-нов при интоксикации ФОС происходит не только в результате механизмов, связанных с «cholinergic anti-inflammatory pathway». Возбуждение ацетил-
ЯНВАРЬ - ФЕВРАЛЬ 2013
Таблица 2
Влияние хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,3 DL50, 30 сут) на концентрацию провоспалительных цитокинов в крови крыс, пг/мл (М ± m, n = 7)
Серии опытов ФНОа ИЛф ИЛ-6
Контроль 87±9 65±8 115±10
Карбофос 60±7* 34±4* 74±9*
Метафос 52±6* 40±5* 82±8*
Примечание. *p < 0,05 по сравнению с контролем.
холином mAChR нейтрофилов приводит к увеличению их фагоцитарно-метаболической активности [4]. Однако, как показали наши эксперименты, при хроническом действии ФОС наблюдался обратный эффект, вероятно, обусловленный действием ацетилхолина на a7nAChR нейтрофилов [8, 12]. Не исключено, что данный эффект существенно выше активирующего действия ацетилхолина на mAChR клеток ФМС.
Существуют основания полагать, что при интоксикации ФОС состояние ФМАН определяют многочисленные эффекты, ряд которых разнонаправленны (например, активация mAChR и a7nAChR нейтрофилов) [4].
Интересно отметить, что снижение синтеза про-воспалительных цитокинов при холинергической стимуляции, в частности под влиянием ФОС, может приводить к снижению летальности животных в ран-
ней стадии сепсиса [2, 3, 4].
При поражении ядами, в частности ФОС, фагоци-тарно-моноцитарная система играет очень важную роль в проявлении как воспалительных, так и антивоспалительных эффектов. Снижение ФМАН и синтеза провоспалительных цитокинов можно рассматривать как негативную реакцию при хроническом действии ФОС. При этом возможны нарушения, связанные с деструкцией и удалением тканей, пораженных токсикантом и сопряженными с их действием процессами [10]. То есть реализация воспаления, как реакции, носящей защитно-приспособительный характер, а не только патологический, при хронической интоксикации ФОС нарушается.
Выводы. 1. При хронической интоксикации ФОС (карбофос, метафос) в течение 30 суток в суммарной дозе, составляющей 0,3 DL50, уменьшается фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов, активность естественных клеток-киллеров и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность.
2. При хроническом отравлении ФОС снижается функция фагоцитарно-моноцитарной системы, что проявляется уменьшением концентрации в крови провоспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-ф и ИЛ-6.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гребенюк А.Н., Антушевич А.Е., Беженаръ В. Ф., Бовтюшко В.Г. Нейтрофшт и экстремальные воздействия / Под ред. А.Н. Гребенюка и В.Г. Бовтюшко. СПб., 1998.-215 с.
2. Забродский П.Ф. II Фармакол. и токсикол. - 1987. - Т. 49. - №2. - С. 57-60. Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммуногоксикологая ксенобиотиков: Монография. Саратов, СВИБХБ. - 2007. -420 с.
3. Забродский П.Ф. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2010. - Т. 150. -№ 9. -С. 309-311.
4 .Роит А., Бростофф Дж, Мейя Д. Иммунология. Пер. с англ. М, 2000. -582 с. Хейхсл' Ф.Г., Дж. Кваглино Д. Иммунологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983. 319 с.
5. Anderson J. // J. Intern. Med. -2005. - Vol. 257. - №2. - P. 122-125.
6. Gallowitsch-PuertaM., Pm'lm' V A. II Life Sci. -2007.. - Vol. 80. -№ 24-25. -P. 2325-2329.
T.KesslerW., TraeqerT., WesterholtA. et al //Langenbecks Arch. Surg. - 2006. - Vol. 391. -№ 2. - P. 83-87.
8. Laskin D. L., Sunil V.R., Gardner C.R. et al //Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. -2011. -Vol. 51. -P. 267-288.
9. Liu C., Shen FM„ Le Г.Г. II Crit. Care Ned. - 2009. - Vol. 37. - № 2. P. 778-779.
10. Oke S.L., Tracey? K.J. // J. Leukoc. Biol. -2008. Vol. 83. -№ 3. P. 512-517. 11 .Rosas-BallinaM, TraceyKJ. //J. Intern. Med. - 2009. - Vol. 265. -№ 6. P. 663-679.
P.F. Zabrodskiy, M.S. Gromov, M.S. Shekhter
Effects of chronic intoxication by organophosphorus insecticides on the phagocytic and metabolic activity of neutrophils, immune system parameters and concentration of pro-inflammatory cytokines in blood
Saratov Branch of the Samara Medical Institute «REAVIZ», Samara
It was established in experiments on non-inbred rats that chronic intoxication by organophosphorus compounds karbophos and metaphos (at 0.01 LD50 daily, over 30 days) significantly reduces the phagocytic and metabolic activity of neutrophils, activity of killer cells, antibody-dependent cellular cytotoxicity and production of proinflammatory cytokines TNFa, IL-1B and IL-6.
Материал поступил в редакцию 05.04.2012 г
