CC BY
10УДК 547-3 : 615.917
АКТИВАЦИЯ
а7^АЦЕТИЛХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ КАК ФАКТОР СНИЖЕНИЯ ЛЕТАЛЬНОСТИ В РАННЕЙ ФАЗЕ СЕПСИСА ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
П.Ф. Забродский, М.С. Громов, В.В. Масляков
Филиал НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ», 410004, г. Саратов
В экспериментах на неинбредных мышах установлено, что фосфорорганическое соединение диметилдихлорвинилфосфат за 2 ч до моделирования сепсиса (внутрибрюшинное введение взвеси микробных тел E. coli) существенно уменьшает летальность мышей в результате активации a7n-ацетилхолинорецепторов (a7nAChR) ацетилхолином и снижения в крови провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-lß и ИЛ-6.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, анабазин, сепсис, а7п-ацетилхолинорецепторы, провоспалитель-ные цитокины.
Введение. В 1987 г. было установлено, что острое отравление необратимым ингибитором холинэстеразы ар-мином, вызывающим выраженную холинергическую стимуляцию, существенно снижает летальность белых мышей от сепсиса [1], а в последующем доказана целесообразность применения холиномиметиков для экстренной активации неспецифической антимикробной резистентности организма при различных инфекционных процессах [2, 3, 4]. Выявленный феномен обеспечивается реализацией холинергического антивоспалительного пути - «cholinergic anti-inflammatory pathway» [2, 4, 5, 6], который включает: активацию м-холинорецепторов (mAChR) головного мозга, модулирующих иммунорегуляторную функцию блуждаюшего нерва; возбуждение эфферентных волокон n. vagus; действие ацетилхолина (АЦХ) на а7п-ацетилхолинорецепторы (a7nAChR) макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и лимфоидных дендритных клеток. В этих клетках возникновение антивоспалительного эффекта обеспечивается киназой JAK2; фактором транскрипции STAT3; транскрипционным фактором NF-kB. Под влиянием холинергической стимуляции реализация данных биохимических механизмов в макрофагах, моноцитах, нейтрофилах ингибирует продукцию ими факто-
ра некроза опухоли-a (ФНО-а), протеина B1 - HMGB1, макрофагально-воспалительного протеина-2 - MIP-2, ин-терлейкинов - ИЛ-10, ИЛ-6 [5, 7]. Активация АЦХ холи-нергических рецепторов клеток фагоцитарно-моноцитар-ной системы (ФМС) приводит к снижению летальности от сепсиса [2, 3, 4, 8] вследствие уменьшения продукции этими клетками провоспалительных цитокинов (ПВЦ) [4, 8]. Доказано, что такой же эффект способен вызвать м-холиномиметик ацеклидин, действующий на mAChR ядра n. vagus продолговатого мозга [4].
Установлено, что при введении фосфорорганических соединений (ФОС) до моделирования сепсиса вызывают снижение летальности мышей от экспериментального инфекционного процесса вследствие эффекта АЦХ [3]. До сих пор не вполне ясна роль активации a7nAChR в уменьшении летальности животных после отравления ФОС и последующем моделировании сепсиса [3].
Изучение возможности снижения летальности при сепсисе путем воздействия на различные участки холи-нергического антивоспалительного пути (cholinergic anti-inflammatory pathway), в частности, при помощи активаторов a7nAChR, в настоящее время представляют большой интерес [4, 9, 10].
Забродский Павел Францевич (Zabrodskii Pavel Franzevich), доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, профессор кафедры медико-биологических дисциплин Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» (Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ»), pfzabrodsky@gmail.com
Громов Михаил Сергеевич (Gromov Mihail Sergeevich), доктор медицинских наук, профессор, ректор Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» (Саратовский филиал Самарского медицинского института «РЕАВИЗ»), saratov@reaviz.ru
Масляков Владимир Владимирович (Maslyakov Vladimir Vladimirovich), доктор медицинских наук, профессор, проректор по научной работе Саратовского филиала НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ», заведующий кафедрой клинической медицины, maslyakov@inbox.ru
Токсикологический вестник №з (126)
Целью исследования являлось оценка роли активации а 7nAChR анабазином в снижении летальности от сепсиса мышей и уменьшении концентрации в крови провоспа-лительных цитокинов ФН(Ох, ИЛ-lß и ИЛ-6 при остром отравлении ФОС.
Материал и методы исследования. Эксперименты проводили на нелинейных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (приказ Минздравразвития России от 23 августа 2010 г., №708н). Активацию a7nAChR осуществляли подкожным введением анабазина [11] (Sigma-Aldrich) в дозе 0,5 DL50 за 2 ч до моделирования сепсиса. Эффект анабазина сравнивали с эквилетальной дозой (0,5 DL50) ФОС (диметилдихлорвинилфосфата - ДДВФ) (Sigma-Aldrich). (DL50 анабазина, ДДВФ составляли для мышей при подкожном введении соответственно 10,6±1,2 и 43,5+4,0 мг/кг. Через 2 ч после применения холинерги-ческих препаратов (ХП) у мышей вызывали сепсис вну-трибрюшинным введением 2,5-109 суточной культуры микробных тел E. Coli [1, 4, 12]. В контрольную группу 1 входили мыши, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия соответственно подкожно (0,5 мл), а через 2 ч - внутрибрюшинно (2,0 мл). Регистрацию летальности мышей после моделирования сепсиса проводили через 4 и 24 ч без применения ХП (контрольная группа 2; мыши за 2 ч до введения взвеси E. coli получали подкожно по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия), а также с использованием ДДВФ и анабазина (группы 3, 4 соответственно). Концентрацию ПВЦ ФНО-а, ИЛ1 ß и ИЛ-6 исследовали в плазме крови всех групп мышей методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits). Кровь для исследований забирали из ретроорбитального венозного синуса. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием /-критерия достоверности Стьюдента.
Результаты и обсуждение. При острой интоксикации ДДВФ (0,5 DL50), сопровождающейся активацией как mAChR, так и nAChR, в том числе и a7nAChR (применение ФОС за 2 ч до моделирования сепсиса) после введения взвеси E. coli через 4 ч происходило снижение летальности мышей по сравнению с контрольной группой
2 (сепсис) на 11,7%, в 1,88 раза (p < 0,05), а через 24 ч - на 26,7%, в 1,42 раза (p < 0,05).
Активация a7nAChR анабазином [11] в эквилетальной дозе (0,5 DL50) при таком же сроке применения препарата до моделирования сепсиса после введения E. coli через 4 ч приводила к уменьшению летальности мышей по сравнению с контрольной группой 2 (сепсис) на 16,7%, в 3,01 раза (p < 0,05), а через 24 ч - на 41, 4%, в 1,85 раза (p < 0,05) (табл. 1).
Полученные данные свидетельствуют о том, что острая интоксикация ФОС и активация a7nAChR анабазином в эквилетальной дозе (0,5 DL50) существенно увеличивают выживаемость животных в ранней фазе сепсиса. При этом эффект активации a7nAChR анабазином более выражен, чем действие ФОС, однако, отличия показателей (летальности) статистически не значимы (p > 0,05).
При сепсисе (контрольная группа 2) в крови существенно увеличивалось содержание ФНО-а, ИЛ-üß и ИЛ-6 по сравнению с группой 1 (интактные животные), особенно выраженное через 4 ч после внутрибрюшинного введения взвеси E. coli (соответственно в 20,22 и 27,50 и 61,15 раза (p < 0,05) (табл. 2).
Острое отравление ДДВФ за 2 ч до моделирования сепсиса приводило через 4 ч после введения E. coli мышам (группа 3) к снижению концентрации в крови ФНО-а, ИЛ-üß и ИЛ-6 по сравнению показателями при сепсисе (контрольная группа 2) без применения ФОС соответственно в 2,51; 1,77 и 5,88 раза (p<0,05).
Активация a7nAChR анабазином в дозе 0,5 DL50 за 2 ч до введения E. coli мышам (группа 4) вызывала редукцию содержания в крови животных ФНО-х, ИЛ-üß и ИЛ-6 после моделирования сепсиса через 4 ч по сравнению параметрами контрольной группы 2 (сепсис) соответственно в 3,18; 2,21 и 7,76 раза (p < 0,05).
После моделирования сепсиса через 24 ч концентрация ФНОчх в крови мышей (группы 2, 3, 4) по сравнению с показателями контрольной группы 1 существенно не изменялась. В этот же период содержание ИЛ-üß и ИЛ-6 при сепсисе (контрольная группа 2) увеличивалось по сравнению с показателями контрольной группы 1 соответственно в 4,72 и 7,19 раза (p < 0,05). При остром отрав-
Таблица 1
Влияние ФОС и активатора a7nAChR анабазина (применение за 2 ч до введения взвеси E. coli) на летальность мышей после моделирования сепсиса (М+m)
Серии опытов Срок исследования летальности после введения E. coli, ч
4 24
Сепсис (контрольная группа 2, п = 40) 25,0±6,8 90,0±4,7
ДДВФ + сепсис (группа 3, п = 30) 13,3±6,2* 63,3±8,8*
Анабазин + сепсис (группа 5, п = 35) 8,3±4,6* 48,6±8,3*
Примечание. * - p < 0,05 по сравнению с контролем (группа 2).
лении ДДВФ и применении анабазина за 2 ч до модели- ей a7nAChR. рования сепсиса через 24 ч после введения E. coli мышам концентрация ИЛ-lß в крови была меньше данного показателя в контрольной группе 2 (сепсис) соответственно в l,67 (p > 0,05) и 1,89 раза (p > 0,05), а содержание ИЛ-6 - соответственно в 2,38 (p < 0,05) и 2,42 раза (p < 0,05).
Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение летальности мышей при сепсисе после острого отравления ФОС (ДДВФ) обусловлено активацией а 7nAChR клеток и уменьшением продукции ими ПВЦ. Данные литературы свидетельствуют о том, что активируются a7nAChR моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, а также лимфоидных дендритных клеток [4, 5, 7, 8, 13].
Активация a7nAChR ингибиторами ацетилхолинэсте-разы и другими н-холиномиметиками клеток не только ФМС, но и других систем и органов может рассматриваться как перспективный способ одного из направлений лечения септических состояний, а также других патологических состояний (заболеваний) [2, 9, 14].
Выводы. 1. Острая интоксикация ФОС и активация а 7nAChR анабазином в эквилетальной дозе (0,5 DL50; применение препаратов за 2 ч до моделирования сепсиса) после внутрибрюшинного введения взвеси микробных тел E. coli через 4 и 24 ч существенно увеличивают выживаемость мышей в ранней фазе сепсиса.
2. При острой интоксикация ФОС и активации а 7nAChR анабазином в эквилетальной дозе (применение препаратов за 2 ч до моделирования сепсиса) после вну-трибрюшинного введения взвеси микробных тел E. coli через 4 и 24 ч отмечается уменьшение в крови концентрации провоспалительных цитокинов.
3. Снижение летальности мышей при сепсисе при остром отравлении ФОС (ДДВФ) обусловлено активаци-
Таблица 2
Влияние ФОС и активатора а 7nAChR анабазина (применение за 2 ч до введения взвеси E. coli) на концентрацию провоспалительных цитокинов в крови мышей после моделирования сепсиса,
пг/мл (М+m)
Серии опытов ФНОа няф ИЛ-6
4 24 4 24 4 24
Контрольная группа 1 23±3 (7) 25±4 (7) 14±3 (7) 18±4 (7) 26±5 (7) 20±4 (7)
Сепсис (контрольная группа 2) 465±48a (7) 36±9 с (4) 385±39a (7) 85±23ас (4) 1590±180a (6) 143±37ас (4)
ДДВФ + сепсис (группа 3) 185±21ab (6) 31±4с (6) 218±23ab (6) 45±5ас (7) 270±30ab (7) 60±7abt (7)
Анабазин + сепсис (группа 4) 146±16ab (7) 20±4с (7) 174±18ab (7) 51±6ас (7) 205±25ab (7) 59±6abc (7)
Примечание. 4 и 24 - время после моделирования сепсиса, ч; в скобках - число животных; а - р < 0,05 по сравнению с контрольной группой 1; ь - р < 0,05 по сравнению с соответствующим параметром при сепсисе (контрольная группа 2); с - р < 0,05 по сравнению с показателем через 4 ч.
Токсикологический вестник №з (126)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Забродский П.Ф. Влияние армина на факторы неспецифической резистентности организма и первичный гуморальный ответ. Фармакология и токсикология. 1987; 49(2); 57-60.
2. Забродский П.Ф. Изменение антиинфекционной неспецифической резистентности организма под влиянием холинергической стимуляции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995; 119 (8): 164-167.
3. Забродский П.Ф. Механизм снижения летальности в ранней фазе сепсиса при остром отравлении фосфорорганическими соединениями. Токсикологический вестник. 2011; 1: 2-5.
4. Забродский П.Ф., Лим В.Г., Шехтер М.С., Кузьмин А.В. Роль м- и н-холинорецепторов в реализации холинергического антивоспалительного механизма в ранней фазе сепсиса. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012; 153 (5): 656-659.
5. Oke S.L., Tracey K.J. From CNI-1493 to the immunological homunculus: physiology of the inflammatory reflex. J. Leukoc. Biol. 2008; 83(3): 512-517.
6. Tracey K.J. Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway. J. Clin. Invest. 2007; 117 (2): 289- 296.
7. BorovikovaL.V., Ivanova S., Zhang M., Yang H., Botchkina G.I., WatkinsL.R. et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 2000; 405 (6785): 458-462.
8. Pavlov VA. Cholinergic modulation of inflammation. Int. J. Clin. Med. 2008; 1 (3): 203-212.
9. Newham P., Ross D., Ceuppens P., Das S., Yates J.W., Betts C. et al. Determination of the safety and efficacy of therapeutic neutralization of tumor necrosis factor-a (TNF-a) using AZD9773, an anti-TNF-a immune Fab, in murine CLP sepsis. Inflamm. Res. 2014; 63(2): 149-160.
10. Pohanka M. Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a target in pharmacology and toxicology. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13 (2): 2219-2238.
11. Welch K.D., Pfister JA., Gardner D.R., Green B.T., Panter K.E. The role of the a7 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor on motor coordination in mice treated with methyllycaconitine and anabasine. J. Appl. Toxicol. 2013; 33 (9): 1017-1026.
12. Song D.J., HuangX.Y., Ren L.C., YangX.H., XiaoM.Z., Wang S. Effect of lentiviral vector encoding on triggering receptor expressed on myeloid cells 1 on expression of inflammatory cytokine in septic mice infected by Bacteroides fragilis. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009; 25 (1): 36-41.
13. Hauber H.P., Zabel P. Pathophysiology and pathogens of sepsis. Internist. (Berl.). 2009; 50 (7): 779-80, 782-784, 786-787.
14. Hoeger S., Fontana J., Jarczyk J., Selhorst J., Waldherr R., Krämer B.K., et al. Vagal stimulation in brain dead donor rats decreases chronic allograft nephropathy in recipients. Nephrol . Dial. Transplant. 2014; 29(3): 544-549.
REFERENCES:
1. Zabrodskii P.F. Effect of armin on nonspecific resistance factors of the body and on the primary humoral immune response. Farmakologija i toksikologija. 1987; 49(2); 57-60 (in Russian).
2. Zabrodskii P.F. Change in the non-specific anti-infection resistance of the body exposed to cholinergic stimulation. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. 1995; 119 (8): 164-167 (in Russian).
3. Zabrodskii P.F. Mechanism to reduce mortality in the early phase of sepsis in acute organophosphate poisoning. Toksikologicheskij vestnik. 2011; 1: 2-5 (in Russian).
4. Zabrodskii P.F. , Lim V.G., Shekhter M.S., Kuzmin A.V. Role of nicotinic and muscarinic cholinoreceptors in the realization of the cholinergic anti-inflammatory pathway during the early phase of sepsis. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny). 2012; 153 (5): 656-659 (in Russian).
5. Oke S.L., Tracey K.J. From CNI-1493 to the immunological homunculus: physiology of the inflammatory reflex. J. Leukoc. Biol. 2008; 83(3): 512-517.
6. Tracey K.J. Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway. J. Clin. Invest. 2007; 117 (2): 289-296.
7. BorovikovaL.V, Ivanova S., ZhangM., YangH., Botchkina G.I., WatkinsL.R. et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 2000; 405 (6785): 458-462.
8. Pavlov VA Cholinergic modulation of inflammation. Int. J. Clin. Med. 2008; 1 (3): 203-212.
9. Newham P., Ross D., Ceuppens P., Das S., Yates J.W., Betts C. et al. Determination of the safety and efficacy of therapeutic neutralization of tumor necrosis factor-a (TNF-a) using AZD9773, an anti-TNF-a immune Fab, in murine CLP sepsis. Inflamm. Res. 2014; 63(2): 149-160.
10. Pohanka M. Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a target in pharmacology and toxicology. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13 (2): 2219-2238.
11. Welch K.D., Pfister J.A., Gardner D.R., Green B.T., Panter K.E. The role of the a7 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor on motor coordination in mice treated with methyllycaconitine and anabasine. J. Appl. Toxicol. 2013; 33 (9): 1017-1026.
12. Song D.J., Huang X.Y., Ren L.C., Yang X.H., Xiao M.Z., Wang S. Effect of lentiviral vector encoding on triggering receptor expressed on myeloid cells 1 on expression of inflammatory cytokine in septic mice infected by Bacteroides fragilis. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009; 25 (1): 36-41.
13. Hauber HP., Zabel P. Pathophysiology and pathogens of sepsis. Internist. (Berl.). 2009; 50 (7): 779-80, 782-784, 786-787.
14. Hoeger S., Fontana J., Jarczyk J., Selhorst J., Waldherr R., Krämer B.K., et al. Vagal stimulation in brain dead donor rats decreases chronic allograft nephropathy in recipients. Nephrol . Dial. Transplant. 2014; 29(3): 544-549.
P.F. Zabrodskii, M.S. Gromov, V.V. Maslyakov
ACTIVATION OF ALPHA 7 NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR AS A MORTALITY REDUCTION FACTOR IN THE EARLY PHASE OF SEPSIS AT ACUTE POISONING WITH ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS
Branch of Non-state Educational Institution of Higher Professional Education "Samara Medical Institute REAVIZ", Saratov, 410004, Russian Federation.
It was established in experiments in inbred mice that organophosphorus compound (dimethyl dichlorovinyl phosphate) administrated 2 hours prior to modeling sepsis (intraperitoneal injection of E. co-li) significantly reduces the mortality of mice in the consequence of activation of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor (a7nAChR) by phagocytic-monocytic system of acetylcholine and decreases pro-inflammatory cytokines (TNFki, IL-ip and IL-6) in blood.
Key words: alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor (a7nAChR), cholinergic anti-inflammatory pathway, organophosphorus compounds, pro-inflammatory cytokines, sepsis
Материал поступил в редакцию 31.03.2014 г
