CC BY
31
УДК 577.152.274:547.8
Є. А. Строцька, Я. Б. Раєцька, С. Я. Мандрик, Л. І. Остапченко, А.А. Грищенко*
вплив хімічних сполук на Активність н+д+-атфази
плазматичних мембран парієтальних клітин шлунка щурів
Київський національний університет імені їараса Шевченка (м. Київ) *Інститут молекулярної біології і генетики нАн України (м. Київ)
Робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідних тем: «Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії» (№ д/р 0101U002291) та «Вивчення біохімічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції і профілактики» (№ д/р 0106U005750).
Вступ. Останнім часом серед населення багатьох країн, в тому числі України, спостерігається прогресуюче поширення патологій органів травлення, зокрема хвороб шлунково-кишкового тракту. Однією з найпоширеніших захворювань органів травлення є виразкова хвороба шлунка. Незважаючи на значну кількість існуючих лікарських засобів в терапії виразкового захворювання, дійсно ефективних серед них небагато. У зв’язку з тим, пошук нових засобів фармакологічного корегування виразкової хвороби шлунка є актуальною проблемою сучасності.
Останні десять років найбільш ведучими серед антисекреторних препаратів є інгібітори активності ключового ферменту синтезу соляної кислоти парієтальними клітинами шлунку - Н+,К+-АТФази. Інгібітори Н+,К+-АТФази (омепразол, лансопразол, рабепра-зол, пантопразол тощо) за своїм хімічним складом є представниками класу похідних бензімідазолів, механізм дії яких спрямований на блокування активності Н+,К+-АТФази шляхом утворення міцних ковалентних зв’язків з ферментом [4, 8]. Таким чином, взаємодіючи з ферментом парієтальних клітин слизової оболонки шлунка по типу необоротного інгібування, похідні бензімідазолів блокують процес кислотопродукування до синтезу молекули Н+,К+-АТФази de novo.
Основним недоліком похідних бензіміда-золів є їхній вплив на рівень сироваткового гастрину в крові з подальшим розвитком гіперплазії ECl-клітин [6].
В останні роки велика кількість робіт направлена на дослідження інгібіторних властивостей сполук, які відносяться до групи К+-конкурентних інгібіторів Н+,К+-АТФази [9]. Серед таких інгібіторів найбільш широко вивчаються похідні хіноліну та піримідину. На основі даної групи сполук ведуться спроби синтезувати новий клас інгібіторів ферменту парієтальних клітин для лікування виразкової патології. Дана група інгібіторів має ряд переваг над похідними бензімідазолів. По-перше, сполуки цієї групи здатні впливати на фермент швидше та період їх інгібі-торної дії є малим, в порівнянні з похідними бензімідазолів. Така властивість має велике значення при пригніченні секреції соляної кислоти в залежності від фаз та стадій виразкового захворювання шлунка. По-друге, зв’язуючись з певними сайтами молекули ферменту вони не порушують нативну конформацію ензиму, таким чином необхідність відновлення структури до синтезу молекули Н+^-АТФази de novo відсутня. Та, в-третіх, сполукам з групи конкурентних інгібіторів Н+,К+-АТФази властива інша фармокінетика.
Метою дослідження було проведення скринінгу хімічних сполук похідних хіноліну та піримідину на активність Н^^-АТФази плазматичних мембран парієтальних клітин шлунка щурів.
Об’єкт та методи дослідження. Дослідження проводили на самцях білих щурів лінії Ві-стар масою 180-220г (n=21). Тварин піддавали декапітації.
Парієтальні клітини виділяли із загальної фракції клітин слизової оболонки шлунка та підраховували за методикою [2]. Отримання фракції плазматичних мембран проводили за рекомендаціями [1] центрифугуванням на 30% сахарозному градієнті (густина 1,127).
Потенційні інгібітори Н+,К+-
АТФази: етил-4-бензиламіно-8-метил-3-
хінолінкарбоксилат (171723), етил-4-(2-
етиланілін)-8-метоксі-3-хінолінкарбоксилат (171788), етил-4-(2-толуідин)-3-
хінолінкарбоксилат (42130) та 3-пропіл-
8,9,10,11-тетрагідро[4,5]тієно[3,2-е][1,2,4] тріазол[4,3-с]піримідин (208604) застосовува-
ли в концентрації 50 мМ. Досліджувані сполуки були синтезовані у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Активність Н+,К+-АТФази визначали за методом [В] та розраховували за кількістю неорганічного фосфату [5] в нмоль Фн за хв на мг білка.
Експериментальні дані оброблялись статистично з використанням t- критерію Стью-дента. Статистичний аналіз одержаних даних здійснювали в режимі програмного забезпечення Excel - 2000.
Результати досліджень та їх обговорення.
Було проведено скринінг сполук, потенційних інгібіторів Н+,К+-АТФази. Вибір сполук проводилось за методиками SAR (Structure Activity Relationship) по принципу найбільшої структурної схожості з відомими оборотними інгібіторами досліджуваного ферменту серед основних структурних класів хімічних сполук - похідних хіноліну та піримідину. Для перевірки системи тестування потенційних інгібіторів в дослідженні у якості контролю застосовували кверцетин [7].
У результаті наших експериментів було встановлено інгібіторний ефект на активність ферменту двох сполук: етил-4-(2-етиланілін)-8-метоксі-В-хінолінкарбоксилат (171788) та В-пропіл-8,9,10,11-тетрагідро[4,5]тієно[В,2-е] [1,2,4]тріазол[4,В-с]піримідин (208604)
(рис.1).
Рис. 1. Вплив сполук з інгібіторними властивостями на активність Н+,К+-АТФази па-рієтальних клітин шлунку щурів; (М ± т, п =21); де: 1 - контроль; 2 - кверцетин; 3 -171723; 4 - 171788; 5 - 42130; 6 - 208604.
Для решти сполук при досліджуваній концентрації, спостерігалось зниження активності Н+,К+-АТФази парієтальних
клітин шлунка щурів за відсутності її пригнічення.
Отримані нами дані впливу хімічних сполук на активність Н+,К+-АТФази слизової обо-
лонки шлунка можна пояснити існуванням різних реакційно-здатних функціональних груп, за якими дані сполуки відрізняються між собою, що може свідчити про наявність цих функціональних груп в молекулі активного центру досліджуваного ферменту.
Неповне пригнічення активності Н+,К+-АТФази, яке нами було помічено при дослідженні впливу хімічних сполук, що відносилися до класу хінолінів: 17172В та 421В0, можна пояснити, спираючись на механізм дії даних сполук по аналогії з відомими інгібіторами [10], який проявляється у К-конкурентному інгібуванню ферменту. Це дає можливість припустити, що дані сполуки при досліджуваній концентрації (50 мкМ) проявляли низьку спорідненість до ферменту в катіонзв’язуючому центрі.
Отже, отримані нами результати впливу сполук з класу похідних хіноліну та піримі-дину на активність ферменту можуть стати основою для розробки нових фармакологічних препаратів у якості ефективних інгібіторів Н+,К+-АТФази.
Висновки. В результаті проведеного дослідження скринінгу сполук похідних хіноліну та піримідину на активність Н+,К+-АТФази парієтальних клітин слизової оболонки шлунка показало на користь сполуки 171788 з класу хінолінів для подальшого її використання як засіб для зниження шлункової секреції.
Перспективи подальших досліджень.
Відомості щодо впливу хімічних сполук на спроможність інгібувати активність Н+,К+-АТФази плазматичних мембран слизової оболонки шлунку щурів і виявлення найбільш ефективної у цьому плані сполуки є вагомим внеском у пошук засобів фармакологічного корегування секреції кислоти для створення на цій підставі нових лікувальних препаратів.
список літератури
1. Рыбальченко В. К. Структура и функции мембран: практ. I Рыбальченко В. К., Коганов Н. М. - Київ: - 1988. - С. 312.
2. Таиров М. М. Клеточная локализация аденилатциклаз, стимулируемых гистамином в слизистой оболочке желудка крыс и их роль в регуляции желудочной секреции I Таиров М. М., Берсимбаев Р. И., Аргутинская С. В., Сал-ганик Р. И. II Биохимия. - 1983. - № 6. - С. 1035 - 1041.
3. Asano S. Functional expression of gastric H+,K+-ATPase and site-directed mutagenesis of the putative cation binding site and the catalytic center I Asano S., Tega Y., Konishi K., Fujioka M., Takeguchi N. II J.B.C. - 1996. - № 5. - Р. 2740
- 2745.
4. Besancon M. Sites of reaction of the gastric H+,K+-ATPase with extracytoplasmic thiol reagents I Besancon M., Simon A., Sachs G., Shin J. M. II J.B.C. - 1997. - №272 - P. 22438
- 22446.
5. Fiske C. H. The colorimetric determination of phosphorus I Fiske C. H., Subbarow Y. II J.B.C. - 1925. - №66 - Р. 375 -400.
6. Hirschowitz B. I. Clinical aspects of ECL-cell abnormalities // J.Biol.Med. - 1998. - №3-4. - P. 303 - 310.
7. Murakami S. Inhibition of gastric H+/K(+)-ATPase by quercetin / Murakami S., Murakami M., Otomo S. // J.Enzyme. Inhib. - 1992. - № 4 - P. 293 - 298.
8. Olbe l. A proton - pump inhibitor expedition: the case histories of omeprazole and esomeprazole / Olbe l., Carlsson E., Lindberg P. // Drug Discovery - 2003. - №2 .
- P. 132 - 139.
9. Perlin D. S. Ion pumps as targets for therapeutic intervention: old and new paradigms // Electronic Journal of Biotechnology - 1998. - №2 - P. 1-10.
10. Watts J. A. A Model of Reversible Inhibitors in the Gastric H+/K+-ATPase Binding Site Determined by Rotational Echo Double Resonance NMR / Watts J. A., Watts A., Middleton D. A. //J. B. C. - 2001. - №46. - P. 43197 - 43204.
УДК 577.152.274:547.8
влияние химических соединений на Активность н+^-атфазбі плазматических мембран париетальных клеток желудка крыс
Строцкая Е. А., Раецкая Я. Б, Мандрык С. Я., Остапченко Л. И, Грищенко А. А.
Резюме. Проведен скрининг химических соединений: производных хинолина и пиримидина на активность Н+,К+-АТФазы плазматических мембран париетальных клеток желудка крыс. Установлен ингибиторный эффект на активность фермента плазматических мембран париетальных клеток для двух соединений: этил-4-(2-этиланилин)-8-метокси-В-хинолинкарбоксилат (171788) и В-пропил^^^И-тетра^дро^^^е^^^^^^^] триазол[4,В-^пиримидин (208604).
Ключевые слова: Н+,К+-АТФаза, париетальные клетки, производные хинолина и пиримидина, язва желудка.
UDC 577.152.274:547.8
chemical substances influence on the rats h+,k+-atpase activity from pareital cells
PLASMA MEMRANE
Strotska E. A., Raetska Ya. B., Mandryk S.Ya., Ostapchenko L. I., Grishenko A. A.
Summary. It was studies screening compounds (quinoline- and pyrimidine-derivatives) on H+,K+-ATPase activity of rats parietal cells plasma membrane. Inhibitory effect for two compounds: ethyl-4-(2-ethylaniline)-8-methoxy-quinolinecarboxylic (171788) and 3-propyl-
8,9,10,11-tetrahydro[4,5]thieno[3,2-e][1,2,4,]triazolo[4,3-c]pyrimidine (208604), was established.
Key words: H+,K+-ATPase, parietal cells, quinoline- and pyrimidine-derivatives, stomach ulcer.
Стаття надійшла 12.11.2009 р.
