CC BY
57
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №5/2016 ISSN 2410-700X_
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК: 571.27
Гаврилин Кирилл Владимирович
доктор биол. наук, профессор ФГБОУ ВО МГУТУ им. КГ. Разумовского (ПКУ), г. Москва, РФ
E-mail: k.gavrilin@yandex.ru Пономарев Андрей Константинович канд. биол.наук, доцент ФГБОУ ВО МГУТУ им. КГ. Разумовского (ПКУ), г. Москва, РФ
E-mail: ponomarev777@inbox.ru Забегалов Александр Юрьевич
Студент
ФГБОУ ВО МГУТУ им. КГ. Разумовского (ПКУ), г. Москва, РФ
E-mail: 9150699@mail.ru
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ КЛАССА ПИРИМИДИНОВ НА НАПРЯЖЕННОСТЬ АНТИИНФЕКЦИОННОГО ИММУНИТЕТА КАРПА
(CYPRINUS CARPIO L., 1758)
Аннотация
Представлены данные полученные в ходе иммунологических исследований групп карпов, получавших с кормом различные дозы (5-40 мг/кг) метилурацила или ксимедона. Выявлено положительное влияние обоих соединений на напряженность антиинфекционного иммунитета. Уровень БАСК в группах получавших ксимедон и метилурацил в наибольшей испытанной дозе составил 25,4±1,9% и 24,9±3,8%, соответственно. Аналогичный показатель в контрольной группе - 19,8%. Аналогичные результаты обнаружении и при исследовании уровня завершенного фагоцитоза: 0,997±0,019; 0,901±0,047 при контрольном значении -0,792±0,076.
Ключевые слова
Пиримидины, метилурацил, ксимедон, иммуностимуляторы для рыб, БАСК, индекс завершенного фагоцитоза
За последние десятилетия, как в гуманной, так и в ветеринарной медицине начало развиваться новое направление исследований, которые направлены на поиск, испытания и изучение механизмов действия химических соединений способных тем или иным способом влиять (стимулировать или подавлять, то есть моделировать) иммунные реакции организма человека и животных. При этом стало очевидно, что терапевтическое действие целого ряда лекарственных средств, связано с их способностью повышать общую сопротивляемость организма и влиять на специфические иммунные реакции [3, с. 698].
Принципиальная возможность влиять на широкий спектр защитных реакций рыб, при помощи иммуномодулирующих лекарственных средств химической или биологической природы, показана как зарубежными, так и отечественными исследователями. Скармливание инвазированным ихтиофтириусами (Ichthyophthirius spp.) Oncorhynchys mykiss различных препаративных форм аскорбиновой кислоты задерживало развитие болезни и снижало уровень гибели рыб [9, с. 347]. Выявлено положительное влияние экстракта гриба Чаги (Inonotus obliquus) на регенерацию остеонов поврежденных плавников Xiphophorus hellerii и подавление ускоренного роста эпителиальной ткани [1, с. 96]. Выявлено иммуностимулирующее действие на рыб ряда пробиотиков [2, с. 64][7, с. 96][8, с. 86].
Рассматриваемое направление исследований может представлять собой несомненный интерес для практических запросов отечественной аквакультуры. Это иммунопрофилактика бактериальных болезней рыб. Это коррекция иммунодофецитных состояний гидробионтов различного генеза. В качестве
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №5/2016 ISSN 2410-700X_
перспективных направлений можно указать задачи снижения смертности рыб при вирусных заболеваниях, усиление действия и снижении отрицательных последствий применения антибиотиков и т.д.
Активность пиримидинов в организме человека, обусловлена тем, что они действуют как синтетические аналоги эндогенных регуляторных пептидов. По данным литературы, эти фармакологические эффекты реализуются несколькими путями. Например, ксимедон активирует аденилатциклазу, что приводит к быстрому накоплению циклического аденозинмонофосфата в клетке, что стимулирует обменные процессы, в первую очередь, биосинтеза белка. Препарат воздействует на систему регуляции активного транспорта кальция в клетке, влияет на процессы тканевого дыхания, перекисного окисления липидов и активность антиоксидантной системы. Он также влияет на сульфгидрильный статус иммунокомпетентных клеток, проявляет антимутагенную и антимикробную активность.
В медицине и ветеринарии накоплен большой опыт применение иммуномодуляторов, но учитывая различия в биологической организации теплокровных животных и рыб, эти данные нельзя без дополнительных исследований экстраполировать на пойкилотермных животных. В связи с чем, целью настоящей работы была оценка перспективности данного направления исследований. Было необходимо выяснить, будут ли «медицинские» иммуностимуляторы оказывать аналогичное действие на рыб. В связи с этим нами была проведена оценка влияния двух достаточно широко используемых в гуманной медицине иммуностимуляторов из группы пиримидинов на примере карпа (Cyprinus carpio).
Объектом исследования служили клинически здоровые двухлетки карпа, средне штучной массой 100±10 г. Рыб содержали в аквариумах, где была обеспечена аэрация и фильтрация воды при температуре 25°С. Условия содержания соответствовали биологическим потребностям карпа. На базе полноценного экструдированного корма для декоративных прудовых рыб TetraPond (Tetra GmbH, Германия) были изготовлены корма с ксимедоном (гидроксиэтилдиметилдигидропиримидин) и метилурацилом (диоксометилтетрагидропиримидин). Затем рыб случайным образом разделили на 7 групп по 40 особей в группе и рассадили в одинаковые емкости. Плотность посадки рыб соответствовала рыбоводным нормативам и составляла не более 1000 г на 100 л воды. Была сформирована контрольная и 6 опытных групп. Контрольная группа получала корм без добавок. Опытные группы получали корм с добавками одного из исследуемых соединений (метилурацила или ксимедона) в дозах 5, 10, 40 мг/кг ихтиомассы.
Кормление осуществлялось методом вольного группового скармливания, в течение 10 дней. Учитывая благоприятные для жизнедеятельности карпа условия, обеспечивающие высокую пищевую активность, норма кормления была рассчитана, как 5% корма от ихтиомассы в сутки. По вышеуказанной причине перерасчета доз препаратов, с учетом несъеденного корма не требовалось.
Пробы крови для иммунологических исследований отбирали через 24 и 168 часов после последнего введения препаратов.
Исследование гуморального звена иммунитета базировалось на исследовании уровня бактерицидной активности сыворотки крови. Известно, что сыворотка крови животных, в том числе и рыб, обладает выраженными антимикробными свойствами. БАСК является интегрированным выражением противомикробных свойств гуморального звена неспецифического иммунитета: лизоцима, комплемента, пропердина, протеаз, С-реактивного белка, агглютининов, преципитинов и т.д. [5, с. 5]. Бактерицидную активность сыворотки крови определяли с помощью фотонефелометрического колориметрирования согласно методике, описанной О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой [6, с. 8].
Клеточное звено иммунитета исследовали путем изучения индекса завершенного фагоцитоза [4, с. 42]. Данное исследование позволяет оценить способность фагоцитирующих клеток цельной крови захватить и убить бактериальные клетки, а также отражает действие гуморального иммунитета как специфического, так и не специфического. В связи с чем, отмечается высокая корреляция результатов с результатами, полученными при изучении БАСК.
Результаты проведенных исследований изложены в таблицах 1 и 2.
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №5/2016 ISSN 2410-700X
Таблица 1
Влияние пиримидинов на гуморальное звено иммунной системы рыб
Группа Препарат Доза, мг/кг ихтиомассы Время исследования, часов БАСК, %
Контроль - - 0 19,5±1,6
24 19,6±2,8
168 19,8±1,1
Опытная 1 Ксимедон 5 24 18,9±2,5
168 19,1±4,5
Опытная 2 10 24 19,3±1,6
168 19,2±0,9
Опытная 3 40 24 25,4±1,9*
168 19,9±2,2
Опытная 4 Метилурацил 5 24 18,6±0,6
168 18,8±1,7
Опытная 5 10 24 19,1±2,6
168 18,9±3,1
Опытная 6 40 24 24,9±3,8*
168 19,5±2,7
Примечание: различие с контролем достоверно Р<0,05.
Таблица 2
Влияние пиримидинов на клеточное звено иммунной системы рыб
Группа Препарат Доза, мг/кг ихтиомассы Время исследования, часов Индекс завершенного фагоцитоза
Контроль - - 0 0,786±0,056
24 0,792±0,076
168 0,789±0,057
Опытная 1 Ксимедон 5 24 0,782±0,054
168 0,791±0,038
Опытная 2 10 24 0,792±0,046
168 0,793±0,071
Опытная 3 40 24 0,997±0,019*
168 0,795±0,093
Опытная 4 Метилурацил 5 24 0,794±0,032
168 0,788±0,065
Опытная 5 10 24 0,797±0,078
168 0,791±0,068
Опытная 6 40 24 0,901±0,047*
168 0,786±0,055
Примечание: различие с контролем достоверно Р<0,05.
После учета и статистической обработки результатов эксперимента были сделаны следующие выводы. В течение проведения опыта были созданы благоприятные стабильные условия содержания рыб. Уровень БАСК в контрольной группе течение всего эксперимента стабилен. Колебания составляли не более 2% и не превышали стандартную ошибку метода.
Было установлено, что ни метилурацил ни ксимедон в диапазоне доз 5 - 10 мг/кг не оказывают стимулирующего действия на гуморальное звено иммунитета рыб. Во все сроки исследования средний по группам №№1, 2, 4 и 5 показатель БАСК достоверно не отличался от контроля, а незначительные различия очевидно были обусловлены индивидуальными особенностями особей.
При этом ксимедон продемонстрировал тенденцию к более выраженному положительному влиянию на гуморальное звено иммунитета рыб. Хотя различия между средними по группам №№ 3 и 6 показателям статистически не существенны.
Длительность иммуностимулирующего эффекта не значительна. При прекращении введения препаратов эффект достаточно быстро исчезает. Так на 7-е сутки исследования показатели БАСК в группах 3 и 6 возвращались к уровню контрольной группы.
Анализ данных представленных в таблице 2 позволяет сделать нижеследующие выводы. Как и в
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №5/2016 ISSN 2410-700X_
предыдущем случае статистически значимый эффект, наблюдали только у рыб получавший наибольшую из испытанных доз - 40 мг/кг. Эффект оказываемый пиримидинами на клеточное звено иммунитета рыб, так же не продолжителен. Через 7 суток после завершения введения соединений показатели возвращаются к исходным.
По воздействию на клеточное звено иммунитета ксимедон несколько превосходит метилурацил. Но статистически существенных различий, между средними по группам 3 и 6 показателям, обнаружить также не удалось.
Проведенные эксперименты позволили решить поставленные задачи. В ходе исследований был выявлен статистически значимый иммуностимулирующий эффект испытанных соединений. Было установлено положительное влияние и метилурацила и ксимедона гуморальное и клеточное звено иммунной системы рыб.
Полученные в ходе исследований результаты совпали с теоритически ожидаемыми. Согласно данным литературных источников, ксимедон более «совершенный» и активный препарат.
Принимая во внимание положительные результаты наших исследований (статистически доказанный иммуностимулирующий эффект) дальнейшие работы в данном направлении следует признать перспективными. Необходимо отметить, что речь идет не просто об обнаружении неких положительных эффектов, а об совпадения результатов полученных при исследовании рыб и данных накопленных в медицине.
Необходимо учитывать, что эксперименты носили предварительный характер и охватывали только незначительный спектр заведомо не токсичных для карпа доз. Можно обоснованно предполагать, что исследования с использованием концентраций препаратов близким к максимально переносимым продемонстрируют более выраженные результаты.
Список использованной литературы:
1. Кобиашвили Г.А., Никифоров-Никишин Д.Л., Никифоров-Никишин А.Л., Бородин А.Л. Подавление регенерации эпителиальной ткани хвостового плавника меченосца водным экстрактом чаги // Рыбное хозяйство. 2008. № 1. С. 96.
2. Лукьянова Н.А., Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И. «Зоонорм» - пробиотический препарат, используемый в прудовом рыбоводстве. Рыбное хозяйство, 2008. №5. С. 64-67.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2011. - 1216 с.
4. Методические указания по определению уровня естественной резистентности организма рыб к инфекционным болезням. № 432-3. Утверждены Госагропромом СССР 13.07.1987.
5. Микряков В.Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета у рыб. Рыбинск: ИБВВ РАН, 1991. 153 с.
6. Смирнова О.В., Кузьмина Т.А. Определение бактерицидной активности сыворотки методом нефелометрии // Журн. микробиол. 1966. № 4. С. 8-11.
7. Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И. Испытания лечебного корма с субалином в рыбхозах Московской области. Рыбное хозяйство, 2012. №4. С. 96-98.
8. Юхименко Л.Н., Бычкова Л.И., Зюкин А.Н., Климов А.В. Профилактика бактериальной геморрагической септицемии с использованием «Субалина» (на примере ОАО «Бисеровский рыбокомбинат»). Рыбное хозяйство, 2009. №1. С. 86-88.
9. Wahli T., Frischknecht R., Schmit M., Gabaudan J., Verlhac V., Meier W. A comparison of the effect of silicone coated ascorbis acid and ascorbul phosphate on the course of ichthiophthiriosis in ranbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) // Fish Diseases. 1995. №4. P. 347-355.
© Гаврилин К.В., Пономарев А.К., 2016
