CC BY
32
УДК 616.24-002:616-092.4/.9:615.357:576.31
Л.В.Вохминцева
ВЛИЯНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО ДИСБАЛАНСА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ
Новосибирский государственный медицинский университет
РЕЗЮМЕ
С целью исследования влияния гормонального дисбаланса на течение пневмонии провели гистологическое исследование лёгких, определили активность лизосомальных ферментов в гомогенате лёгких и содержание катионных белков в нейтро-филах крови. Пневмонию моделировали интрат-рахеальным введением сефадекса А-25 в дозе 5 мг/кг веса. Гормональный дисбаланс моделировали введением гидрокортизона (0,310-9 М/100 г) и адреналином (0,610-6 М/100 г) в течение 3 дней через неделю после введения аллоксана (120 мкг/100 г массы тела). Наличие гормонального дисбаланса приводит к повышенному выбросу в периферическую кровь нейтрофилов с высоким содержанием катионных белков, усилению миграции и дегрануляции нейтрофилов в ткани лёгких, что обусловливает усиление повреждения лёгких.
SUMMARY
L.V.Vokhmintseva
HORMONAL DISBALANCE EFFECT ON EXPERIMENTAL PNEUMONIA
To study hormonal disbalance effect on pneumonia we carried out histological analysis of the lungs determined lysosomal enzyme activity in lung homogenate and cation protein content in blood neutrophils. Pneumonia was simulated with injection of sefadex A-25 at a dosage 5 mg/kg intratracheally. Hormonal disbalance was simulated with hydrocortisone (0,3*10"9 М/100 g) and adrenaline (0,6*10"6 М/100 g) during 3 days, a week after alloxane injection (120 mkg/100 g). Hormonal disbalance leads to increased release of neutrophils rich in cation protein into the blood, enhanced migration and degranulation of neutrophil in lung tissue which results in lung tissue injury.
В формировании сложной воспалительной реакции в лёгких при пневмонии помимо медиаторных систем участвуют железы внутренней секреции. Выделяя гормоны, они оказывают существенное влияние не только на течение всех фаз этого компенсаторно-приспособительного процесса, но и обусловливают коррекцию метаболизма повреждённых органов-мишеней [4, 9]. Поэтому изучение особенностей течения воспаления в лёгких на фоне введения адаптивных гормонов представляет несомненный интерес.
Целью настоящей работы явилось исследование
влияние гормонального дисбаланса на структурноморфологические изменения в лёгких, функциональную активность нейтрофилов периферической крови, а также активность лизосомальных ферментов в ткани легких у крыс с экспериментальной пневмонией.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена на самцах крыс линии Вистар массой 200-220 г (ЦНИЛ Новосибирского государственного медицинского университета). Животные получали обычный полноценный общевиварный рацион и воду ad libitum. Животным первой группы (n=12) моделировали пневмонию интратрахеальным введением с помощью специального зонда под эфирным наркозом суспензии сефадекса А-25 («Pharmacia Uppsala», Швеция) в дозе 0,5 мг/100 г (диаметр гранул 40-100 мкм), приготовленной на тёплом физиологическом растворе [5]. Второй группе животным (n=12) вводили сефадекс А-25 на фоне гормонального дисбаланса [2], который моделировали введением гидрокортизона (0,3 • 10-9 М/100 г) совместно с адреналином (0,6-10-6 М/100 г) в течение 3 дней через неделю после введения аллоксана (120 мкг/100 г массы тела). Этой группе животных сефадекс вводили на следующий день после приёма гормонов. Крыс дека-питировали на 2, 10 и 20-е сутки после заключительного воздействия. Все болезненные процедуры выполняли согласно Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Контролем служил материал от интактных животных (n=16) соответствующего возраста, находившихся на общевиварном рационе.
Для гистологического анализа кусочки легкого фиксировали в 10%-ном растворе формалина, гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Г.И.Меркулов, 1974).
Для приготовления гомогенатов образцы ткани лёгких растирали в форфоровой ступке с предварительно истолчённым стеклом и суспендировали в 9 объёмах 0,25 М раствора сахарозы с 0,001 М ЭДТА, при рН 7,4. Стекло и оставшиеся неразрушенные со-единительно-тканные элементы удаляли центрифугированием (1000 об/мин в течение 3 мин.) при охлаждении.
В надосадочной части гомогената определяли общую активность маркёрных лизосомальных ферментов - кислой фосфатазы, катепсина Д и р-галактозидазы; для этого гомогенат соединяли в соотношении 1:1 с 0,2%-ным раствором тритона Х-100 («Ferak», ГДР). Определение активности кислой фосфатазы проводили по методу de Duve et. al. [12]. В качестве субстрата использовали Р-глицерофосфат натрия («Merck», Германия). Количество неоргани-
ческого фосфата определяли по методу C. Fiske и J. Subbarow [11]. Активность фермента выражали в мкмоль фосфата/мин на 1 г белка. Определение активности катепсина Д осуществляли по методу A.J. Barrett [7], в качестве субстрата использовали гемоглобин («Reanal», Венгрия). Активность фермента выражали в мкмоль тирозина/мин на 1 г белка. Активность р-галактозидазы определяли по методу A.J.Barrett [7]. В качестве субстрата использовали 4-нитрофенил-р^-галактопиранозид («Serva», США). Активность фермента выражали в микромолях р-нитрофенола/мин. на 1 г белка.
Концентрацию белка в гомогенате лёгких оценивали по методу J.H.Lowry et. al. [8].
Наличие в азурофильных гранул одновременно и катионных белков и кислых гидролаз [1] позволяет косвенно оценить содержание лизосомальных ферментов с помощью ЛКТ-теста, который проводили по методу В.Е.Пигаревского [3]. Из цельной гепари-низированной крови приготавливали тонкие и равномерные мазки, высушивали на воздухе и окрашивали 0,1%-ным спиртовым раствором зелёного прочного («Serva», США) на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8,1-8,2. Затем препараты докрашивали 0,25%-ным водным раствором азура А. Содержание лизосомальных катионных белков определяли путём расчёта среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по формуле: СЦК=(0а+0,5б+1в+1,5г+2д+2,5е+3ж)/100, где буквами (а - ж) обозначено количество однотипных клеток с определённой степенью окрашиваемости цитоплазмы зелёным прочным, а цифрами 0-3 степень интенсивности окрашивания. Кроме того, был проведён подсчёт процентного распределения нейтрофи-лов по интенсивности окрашивания. Клетки с интенсивностью окрашивания «0» - «0,5» обозначались как низкоактивные клетки (НАК), «1,0» - «1,5» - как среднеактивные клетки (САК), «2» - «3» - высокоактивные клетки (ВАК).
При статистическом анализе данных использовались следующие показатели вариационной статистики: среднее арифметическое значение (М), стандартная ошибка среднего значения (m). Определение достоверности различий сравниваемых параметров между разными выборками проводили с использованием непарного критерия Стьюдента (достоверным считали различия при р<0,05) [6].
Результаты исследований и их обсуждение
При введении в трахею сефадекса А-25 на 2-е сутки эксперимента отмечали: полнокровие, очаги микрокровоизлияний, вокруг бронхов и сосудов крупного и среднего калибра формировались лимфо-макрофагальные инфильтраты с примесью нейтро-филов и эозинофилов. Наблюдали диффузное утолщение межальвеолярных перегородок за счёт их инфильтрации макрофагами и лимфоцитами, а также единичными нейтрофилами, выявляли очаги эмфиземы. В просвете крупных бронхов воспалительный клеточный инфильтрат был представлен преимущественно нейтрофилами. На 10-й день эксперимента сохранялись полнокровие и очаги микрокровоизлия-
ний. Вокруг бронхов и сосудов плотные клеточные инфильтраты состояли преимущественно из лимфоцитов, макрофагов, в отдельных участках с образованием лимфоидных фолликулов. Наблюдались диффузные утолщения межальвеолярных септ за счёт инфильтрации лимфоцитами и макрофагами, сохранялись очаги эмфиземы. В этот срок исследования наблюдали приток макрофагов, которые сменили нейтрофилы в очаге воспаления и лимфоцитов с формированием лимфоидных фолликулов. Через 20 дней с момента введения сефадекса вокруг крупных бронхов и сосудов отмечали крупные воспалительные клеточные инфильтраты преимущественно из лимфоцитов и макрофагов с некрозом слизистой бронхов. Однако вокруг бронхов среднего и мелкого калибра выраженность воспалительного инфильтрата была снижена, очаговое утолщение межальвеоляр-ных перегородок было обусловлено преимущественно воспалительной инфильтрацией из лимфоцитов и макрофагов, также сохранялись очаги эмфиземы.
Результаты исследования в группе животных с экспериментальной пневмонией, протекающей на фоне гормонального дисбаланса показали: на 2-й день после введения сефадекса наблюдалось выраженное полнокровие, отёк, в перибронхиальном пространстве выраженная воспалительная инфильтрация преимущественно нейтрофильного характера с наличием макрофагов и лимфоцитов, серозным экссудатом в альвеолах. На 10-й день с момента введения сефадекса наблюдали неравномерное полнокровие, в перибронхиальном пространстве, в интерстициальном пространстве воспалительная инфильтрация, состоящая преимущественно их макрофагов и лимфоцитов. На 20-й день от момента введения сефадек-са наблюдали неравномерное полнокровие, вокруг отдельных бронхов воспалительный инфильтрат из макрофагов и лимфоцитов, местами формирующий узелковые скопления. Утолщения межальвеолярных перегородок было связано с отёками и воспалительной инфильтрацией. Наличие гормонального дисбаланса у животных приводило к развитию серозногнойной пневмонии.
Развитие воспалительного процесса в лёгких в условиях нормального гормонального фона сопровождалось увеличением активности лизосомальных ферментов в гомогенате легких уже через 2 суток с момента введения сефадекса на 39% для р-галактозидазы, на 5В% для кислой фосфатазы и на В9% для катепсина Д, по сравнению с контрольной группой (табл. 1). В дальнейшем к 10-м суткам активности кислой фосфатазы и р-галактозидазы увеличивались, тогда как активность катепсина Д, наоборот понизилась, но оставалось выше показателей контрольной группы. К 20 суткам активность кислой фосфатазы достигла максимальных значений, в то время как активности р-галактозидазы и катепсина Д остались на прежнем уровне.
Более выраженная деструкция лёгочной ткани в условиях гормонального дисбаланса сопровождалось более значительными изменениями лизосомального аппарата лёгких (табл. 1). Активность кислой фосфа-тазы на 2 день после введения сефадекса в гомогена-
те лёгких была выше в 1,3 раза, по сравнению с животными с нормальным уровнем гормонов. В дальнейшем это различие сохранялось, активность фермента была в среднем в 1,2 раза выше во все сроки эксперимента. Показатели активности катепсина Д в группе животных с гормональным дисбалансом во все сроки эксперимента превышали значения активности фермента у крыс с нормальным гормональным фоном. Для р-галактозидазы достоверные различия наблюдались через 10 и 20 суток с момента введения сефадекса.
Известно, что источником лизосомальных ферментов являются не только резидентные клетки лёгких, но и клетки, мигрирующие в орган при развитии воспалительной реакции [10]. К таким клеткам относятся, прежде всего, нейтрофилы, от функциональной активности которых зависят деструктивные процессы происходящие в очаге воспаления.
Для оценки функционального состояния нейтро-филов периферической крови был исследовано содержание катионных белков в азурофильных гранулах нейтрофилов (табл. 2). Содержание катионных белков в нейтрофилах крыс на 2-е и 10-е сутки достоверно снижалось по сравнению с контролем. Кроме того, начиная с первого дня, наблюдалось достоверное перераспределение клеток по интенсивности окрашивания: на 40% снижалось число ВАК. Отмечалась тенденция к снижению САК (на 15%). К 10-м суткам развития экспериментальной пневмонии происходило дальнейшее увеличение количества НАК, которое повышалось в сравнении с контрольными цифрами на 77%. При этом содержание ВАК оставалось пониженным, на уровне первого дня (8,3±0,52 против 14,0±0,78 в контроле, р<0,001). На 20-й день число ВАК оставалось низким, оно было более чем в 2 раза меньше, чем у контрольных животных. Коли-
чество САК к этому сроку снижалось на 10,7%.
Развитие пневмонии на фоне гормонального дисбаланса сопровождалось выбросом в периферическую кровь нейтрофилов, которые имели более высокое содержание катионных белков по сравнению с контрольными животными (табл. 2). На 2 сутки развития пневмонии СЦК превышал значения в группе с нормальным гормональным фоном в 1,5 раза (р<0,05). При этом количество ВАК и САК превышало на 35% и 53% (р<0,05), соответственно, аналогичные показатели в группе крыс без гормонального дисбаланса. На 10 сутки эксперимента СЦК в группе с гормональным дисбалансом был ниже контрольных значений, но превышал показатели в группе с нормальным гормональным фоном. Количество ВАК и САК снизилось (р<0,05), но оставалось в 2 и 1,28 раза (соответственно) выше у крыс с пневмонией протекающей на фоне нормального уровня гормонов. К 20 суткам повышение СЦК практически до контрольных значений было обусловлено повышением уровня САК, их количество превышало контрольные значения в 3 раза (р<0,05), а показатели в группе с пневмонией, протекающей без гормонального дисбаланса, в 1,74 раза (р<0,05).
Таким образом, наличие гормонального дисбаланса у животных, а именно, повышение уровня адреналина и гидрокортизона на фоне сниженной продукции инсулина, развивающейся в результате введения аллоксана, приводит к повышенному выбросу в периферическую кровь нейтрофилов, обладающих более высоким содержанием катионных белков в азурофильных гранулах. Повышенная миграция ней-трофилов в очаг повреждения сопровождается усиленной секрецией гидролитических ферментов во внеклеточную среду, что приводит к развитию значительной деструкции межклеточного матрикса лёг-
Таблица1
Изменения активности лизосомальных ферментов в гомогенате лёгких у крыс с пневмонией, протекающей в условиях различного гормонального фона (мкМ/мин/г)
Ферменты Кон- троль 2 дня 10 дней 20 дней
I группа II группа I группа II группа I группа II группа
Кислая фосфатаза 174±10,1 275±12,5* 351±19,4*# 320±19,0* 495±26,3*# 384±21,8* 437±27,1*#
Катепсин Д 2,8±0,13 5,3±0,27* 5,8±0,31* 3,7±0,17* 6,8±0,27*# 5,1±0,24* 6,3±0,24*#
Р-галактозидаза 3,3±0,12 4,6±0,20* 4,8±0,22* 5,9±0,28* 5,1±0,26*# 5,3±0,26* 6,1±0,31*#
Примечание: здесь и далее I группа - пневмония, протекающая на фоне нормального уровня гормонов, II группа - пневмония, протекающая на фоне гормонального дисбаланса; статистически значимые различия обозначены при сравнении: * - различных экспериментальных воздействий с контролем, # - пневмонии, протекающей на фоне гормонального дисбаланса с пневмонией у крыс с нормальным уровнем гормонов.
Таблица 2
Изменение показателей ЛКТ-теста у крыс в динамике развития экспериментальной пневмонии, протекающей в условиях различного гормонального фона
Показатели Контроль 2 дня 10 дней 20 дней
I группа II группа I группа II группа I группа II группа
СЦК 1,12±10,1 0,78±0,03* 1,2±0,0*# 0,73±0,03* 0,82±0,0*# 0,84±0,03* 1,0±0,0*#
НАК, % 35,0±2,8 60,0±3,30* 32,0±0,0# 65,0±2,74* 53,0±0,0*# 52,0±4,34* 19,0±0,0*#
САК, % 51,0±2,8 32,0±2,85* 49,0±0,0# 32,0±2,67* 41,0±0,0*# 45,0±3,25* 78,5±0,0*#
ВАК, % 14,0±0,7 8,0±0,64* 19,0±0,0*# 3,0±0,24* 6,3±0,0*# 2,8±0,17* 2,5±0,0*
ких. В результате, пневмония, развивающаяся на фоне гормонального дисбаланса, приобретает неблагоприятный острый характер, в отличие от пневмонии, протекающей на фоне нормального уровня гормонов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Биология антибиотиков животного происхождения [Текст]/В.Н.Кокряков.-СПб.: Наука, 1999.-162 с.
2. Влияние глюкокортикоидов и катехоламинов
на состояние лизосомального аппарата тканей кроликов с экспериментальным диабетом [Текст]/Л.Е.Панин, Т.К.Климентьева,
Н .Н.Маянская//Проблемы эндокринологии.-1982.-
№1.-С.70-73.
3. Клиническая морфология нейтрофильных гра-нулоцитов [Текст]/под ред. В.Е.Пигаревского.-Л., 1988.-142 с.
4. О роли тиреоидных гормонов в воспалении [Текст]/Л.В.Вохминцева, С.С.Рымарь//Вестник Российского государственного медицинского универси-тета.-2004.-№3.-С.182-183.
5. Противовоспалительный эффект отечественного будесонида на модели неинфекционного гранулемато-за лёгких [Текст]/Сладкопевцев А.С. [и др.]//Бюлл. эксперим. биол. мед..-2001.-№5.-С.517-559.
6. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ
STATISTIKA [Текст]/О.Ю.Реброва.-М.: Медиа Сфера, 2002.-312 с.
7. Lysosome enzymes [Text]/A.J.Barrett//Lysosomes, a laboratory handbook.-Amsterdam-London, 1972.-P.46-149.
8. Protein measurements with the folin phenol reagent [Text]/Lowry J.H. [et. al.]//J. Biol. Chem.-1951.-Vol.199, №1.-P.265-275.
9. Regulation of nuclear factor-kappa B, activator protein-1, and glutathione levels by tumor necrosis fac-tor-alpha and dexamethasone in alveolar epithelial cells [Text]/I.Rahman//Biochem. Pharm.-2000.-Vol.60, №8.-P.1041-1049.
10. Selective transport of cytokine-induced neutrophil chemoattractant from the lung to the blood facilitates pulmonary neutrophil recruitment [Text]/L.J.Quinton [et. al.]//Am. J. Phys.-Lung Cell. Mol. Phys.-2004.-Vol.286, №3.-P. L465-L472.
11. The colorimetric determination of phosphorus [Text]/CFiske, J.Subbarow//J. Biol. Chem.-1925.-Vol.62.-P.375-400.
12. Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue [Text]/C. de Duve, B.C.Pressman, E.A.Gianetto//Biochem. J.-1955.-Vol.60, №.4.-P.604-617.
П □ □
УДК:616.24-022:616.9:614.211-08:616-071
Г.В.Трубников, И.Г.Полякова
АТИПИЧНАЯ ПНЕВМОНИЯ МИКОПЛАЗМЕННОЙ И ХЛАМИДИЙНОЙ ЭТИОЛОГИИ НА ПОЛИКЛИНИЧЕСКОМ ЭТАПЕ (ПО ДАННЫМ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ)
Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул
РЕЗЮМЕ
У 214 больных с внебольничной пневмонией проведены исследования по диагностике атипичной (микоплазменной и хламидийной) инфекций (ИФА, бактериологическое, ПЦР, РИФ). Микоплазменная пневмония выявлена у 21,5%, хламидийная - у 12,1%, сочетанная атипичная инфекция - у 7,0% обследованных. Ретроспективно изучены особенности атипичной пневмонии на догоспитальном этапе. Выявлено, что у больных атипичной пневмонией в 2-3 раза чаще выявляется отягощенный эпиданамнез, развитие заболевания начинается с продромального периода. Микоплазменная пневмония чаще возникает у лиц юношеского и молодого, хламидийная - пожилого и старческого возраста. Для атипичной пневмонии характерно рентгенологическое подтверждение диагноза в более поздние сроки от начала заболевания, тяжелое течение пневмонии наблюдается в 2-3 раза чаще, чем при пневмонии иной этиологии. Этиологическая диагностика микоплазменной и хламидийной пневмонии на поликлиническом этапе отсутствует.
SUMMARY
G.V.Trubnikov, I.G.Polyakova
ATYPICAL PNEUMONIA OF MICOPLASMIC AND CHLAMIDIC ETIOLOGY AT THE OUTPATIENT STAGE
We examined 214 patients with outpatient pneumonia to diagnose atypical (micoplasmic and chlamidic) infections. Micoplasmic infection was diagnosed in 21,5%, chlamidic infection in 12,1%, combined atypical infection in 7,0% of patients. We carried out retrospective study to assess peculiarities of atypical pneumonia during outpatient period. The results suggest that patients with atypical pneumonia have complicated epidanamnesis 2-3 times as often with diseases developing during prodromal period. Micoplasmic infection is more common in young patients while chlamidic infections is more often found in elderly patients. Atypical pneumonia is characterized by the late X-ray support of the diagnosis, severe course is observed more often compared to pneumonias of different etiologies. Etiological diagnostics of
