CC BY
12УДК 636.5.033 : 636.064.6 : 576.356.2
Крюков В.И., доктор биологических наук, профессор, Власова Е.Ю., студентка 5 курса, ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет им. Н.В. Парахина», Россия, г. Орёл тел. 8 (4862) 47 51 71, e-mail: iniic@ mail.ru
Kryukov V.I., Doctor of Biological Sciences, Professor Vlasova E.Y., the student 5 rates Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Education «Orel State Agrarian University named after N.V. Parakhin», Orel, Russia
ВЛИЯНИЕ ГИПОВИТАМИНОЗА НА ЧАСТОТУ МИКРОЯДЕР В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ИНДЕЙКИ ДОМАШНЕЙ (MELEAGRIS GALLOPAVO)
(Effect of hypovitaminosis on the frequency of the micronuclei in turkey's (Meleagris gallopavo)
peripheral blood erythrocytes)
Высокая продуктивность сельскохозяйственной птицы может быть достигнута лишь при рациональном кормлении, обеспечивающим их биохимический гомеостаз, стабильность генома и нормальную работу эпигенетических механизмов. В статье изложены результаты анализа цитогенетических нарушений в эритроцитах периферической крови 6-недельных индюшат трёх групп, получавших разное количество витаминов групп А, Б3 и Е. Птицы первой группы с 37-го по 41-й день развития получали полный рацион кормления, содержащий поливитаминную добавку «Алфавит АД3Е». Индейки второй группы получали тот же рацион, но со сниженным на 50% от нормы количеством поливитаминной добавки. Из рациона птиц третьей группы поливитаминная добавка была полностью исключена. На 43 -й день у всех птиц была взята кровь и сделаны мазки. В окрашенных азур-эозином по Романовскому препаратах анализировали частоту эритроцитов с микроядрами и аномалиями ядер (почкующихся, двухлопастных, выемчатых, хвостатых). Установлен рост частот ядерных аномалий с уменьшением количества поливитаминной добавки в рационе. Частоты эритроцитов с микроядрами в первой, второй и третей группах птиц составили 0,85, 1,11 и 1,13%о, соответственно. Частоты микроядер в первой и третьей группах имели статистически достоверные различия (Р<0,05). Суммарные частоты всех других ядерных аномалий в группах были равны 0,56, 1,19 и 1,49%, соответственно. Две последние величины статистически достоверно отличались от первой (Р<0,05). На основании полученных данных сделан вывод о снижении уровня стабильности генома индеек при недостатке витаминов А, Б3 и Е в их рационе.
Ключевые слова: эритроциты, микроядра в эритроцитах, периферическая кровь, гиповитаминоз
Введение. В настоящее время Россия оказалась самым быстроразвивающимся производителем мяса индейки с рекордно высоким за последние десять лет среднегодовым темпом прироста (25%). Общий объем производства мяса индейки в России в 2018 году превысил 259 тыс. тонн. Это на 28 тыс. тонн (12%) боль-
High productivity of poultry can be achieved only with the rational feeding of birds, which provides biochemical homeostasis, genome stability and normal functioning of epigenetic mechanisms. This article presents the results of an analysis of cytogenetic disorders in peripheral blood erythrocytes of 6-week-old turkeys of three groups that received different amounts of vitamins of groups A, D3, and E. Birds of the first group received a complete feeding ration containing the multivitamin supplement «Alphabet AD3E» from the 37th to the 41st day of development. Turkeys of the second group received the same diet, but the amount of multivitamin supplement in it was reduced by 50% from the norm. The multivitamin supplement was completely excluded from the diet of birds of the third group. Blood samples were taken from all birds and smears were made on the 43rd day. Slides were stained with azure-eosin according to Romanovsky. The frequency of erythrocytes with micronuclei and anomalies of the nuclei (budding, two-lobed, notched, caudate) was analyzed. The test results showed an increase in the frequency of nuclear abnormalities with a decrease of the multivitamin supplement amount in the diet. The frequencies of erythrocytes with micronuclei in the first, second, and third groups of birds were 0.85, 1.11, and 1.13%o, respectively. The micronucleus frequencies in the first and third groups had statistically significant differences (P<0.05). The total frequencies of all other nuclear anomalies in the groups were 0.56, 1.19, and 1.49%, respectively. The last two values were statistically significantly different from the first value (P<0.05). Based on the data obtained, it was concluded that a decrease in the amount of vitamins A, D3 and E in the diet reduces the level of stability of the turkey genome.
Keywords: red blood cells, microkernels in red blood cells, peripheral blood, hypovitaminosis
ше, чем в 2017 году. В 2019 г. аналитики прогнозируют прирост российского производства мяса индейки на 70-80 тыс. тонн, т.е. до 330-340 тысяч тонн. [1]. Вместе с тем, сложные экономические условия, в которых на современном этапе вынуждены функционировать птицеводческие предприятия страны, застав-
ляют изыскивать пути снижения затрат на выращивание птиц. Одним из путей уменьшения таких затрат руководство одной из птицефабрик рассматривало уменьшение количества в рационе птиц дорогостоящих импортных кормовых витаминных добавок. Однако многие витамины в организме птиц не синтезируются и должны поступать с кормом, т.к. биологически необоснованное уменьшение физиологически активных компонентов в кормах может приводить к серьёзным нарушениям биохимического гомеостаза и ослаблению репарационных процессов в клетках. Поэтому руководство птицефабрики перед принятием им решений об изменении рациона кормления птиц предложило группе сотрудников Орловского аграрного университета изучить возможные последствия этих изменений.
Значение витаминов для сохранения биохимического гомеостаза и регуляции физиологических процессов организмов исследовано достаточно подробно. Роль витаминов в регуляции интенсивности мутагенеза изучено существенно слабее. К тому же, большая часть таких исследований выполнена с использованием бактериальных культур и лабораторных млекопитающих. Исследований на птицах существенно меньше. И лишь только небольшая часть из них выполнена с использованием цитогенетических методов. Одним из них является метод анализа частот возникновения в клетках микроядер, а также ряда других аномалий морфологии ядра.
Микроядра в клетках живых организмов представляют собой небольшие содержащие хроматин структуры, расположенные отдельно от основного ядра клетки. Они образуются из фрагментов хромосом или целых хромосом, которые оказались не связанными с нитями веретена деления. В результате эти хромосомы или их фрагменты остаются в цитоплазме, вне образующихся новых ядер. Причиной возникновения микроядер могут быть различные внутренние и внешние факторы. Присутствие микроядер в клетках свидетельствует о генотоксическом стрессе и/или генетической нестабильности организма. Микроядерный тест широко используется при исследованиях мутагенеза у человека [2]. Методики анализа микроядер в различных тканях для целей медицинских исследований в значительной степени стандартизированы. В ветеринарной практике это предстоит ещё сделать.
Выполненный нами поиск публикаций по микроядерному тестированию сельскохозяйственных птиц позволил обнаружить лишь одно сообщение о спонтанной частоте образования микроядер в эритроцитах трёх индеек в Мексике [3]. Таким образом, для индеек пока отсутствуют научные сведения о межпородных, половых и возрастных различиях частот спонтанного образования микроядер у здоровых птиц. Если у человека, помимо частот спонтанного мутагенеза у здоровых индивидуумов, изучены частоты образования микроядер в клетках при самых различных заболеваниях [4], то для индеек данные о частотах микроядер, образующихся при различных их патологических состояниях, в том числе - при гиповитаминозах, полностью отсутствуют. Отсутствие таких сведений делает полученные нами данные очень актуальными.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлся анализ возможных генетических последствий уменьшения количества этих витаминов в рационе индеек путём анализа частот формирования микроядер и других ядерных аномалий в эритроцитах периферической крови полуторамесячных индюшат, выращенных при полном рационе питания и при рационах с пониженным содержанием поливитаминной добавки. В соответствии с целью были определены задачи - изучить: а) спонтанную частоту образования микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах периферической крови индюшат при полном рационе кормления, содержащим добавки витаминов А, D3, E; б) частоту образования микроядер в эритроцитах периферической крови самцов индеек при снижении в их рационе количества поливитаминной добавки на 50% от нормы, а также при полном отсутствии поливитаминной добавки в рационе.
Материалы и методы исследования
Эксперимент был выполнен в марте 2019 г. на базе птицеводческой фабрики ЗАО «Краснобор» (пос. Рассвет, Тульская обл.). Материалом для исследования служили самцы индейки домашней (Meleagris gallopavo f. domestica) породы Big-6. Всех птиц до начала эксперимента выращивали при стандартных условиях содержания и кормления. Из 36-дневных здоровых птиц общего поголовья были сформированы три экспериментальные группы по 8 самцов в каждой. Птицы 1-ой (контрольной) группы получали полный кормовой рацион, в том числе витаминный препарат «Алфавит АДзЕ», задаваемый птицам методом выпойки из расчёта 0,5 л/1000 л воды в течение 5 дней (с 37-го по 41-й дни развития). Птицы 2-ой (опытной) группы получали полный кормовой рацион, но витаминный препарат «Алфавит АД3Е» давали птицам в указанные выше сроки в половинной дозе -из расчёта 0,25 л/1000 л воды. Птицы 3-ей (опытной) группы получали стандартный кормовой рацион, но без витаминного препарата «Алфавит АДзЕ». «Алфавит АДзЕ» - коммерческое название комплексного препарата жирорастворимых витаминов на водной основе. В 1 мл препарата содержится витамина А - 50 000 МЕ, витамина D3 - 5000 МЕ, витамина Е - 30 мг.
В связи с одновременным проведением биохимических исследований индеек всех трёх групп, кровь для анализа у птиц брали на 8 день после начала эксперимента (утро 43-х суток индивидуального развития индюшат) из подкрыльцовой вены, используя для каждой особи индивидуальный одноразовый шприц. Каплю цельной крови наносили на обезжиренное предметное стекло и стандартным методом делали мазок [5]. В лаборатории мазки крови фиксировали в 96%-ном этаноле в течение 30 мин и высушивали. Фиксированные препараты окрашивали 2%-ным красителем Гимза по Романовскому. Окрашенные препараты промывали в проточной воде в течение 15 мин, трижды ополаскивали дистиллированной водой и высушивали. Мазки анализировали, используя микроскоп «AxioImager A1» («Zeiss», Германия) с цифровой
видеокамерой «ProgRes CF» и программным обеспечением «Видеотест-Морфология 5.0». В мазке крови каждой птицы анализировали не менее 3000 эритроцитов. По техническим причинам мазки крови были проанализированы у 7 птиц каждой исследуемой группы. Таким образом, выборка проанализированных эритроцитов для каждой из трёх групп индюшат была более 21 тыс. клеток.
Анализ ядерных аномалий в эритроцитах был выполнен в соответствии с классификацией, представленной в работе [6]. Учитываемые эритроциты показаны на рис. 1: помимо нормальных эритроцитов
(А) учитывали эритроциты с микроядрами (Б), а также с аномальными ядрами: почкующимися (В), дву-лопастными (Г), выемчатыми (Д) и хвостатыми (E).
Достоверность различий в частотах нарушений между вариантами опыта определяли после ф-преобразования частот аномалий [7, с. 166-169]. Все расчёты были выполнены с использованием электронных таблиц MS Excel. В итоговых таблицах частоты нормальных эритроцитов и сумма долей всех аномалий указаны в процентах, индивидуальные частоты аномалий - в %о (промилле).
А Б В Г Д Е
Рис. 1. Нормальный эритроцит (А), эритроцит с микроядром (Б) и эритроциты с аномальными ядрами: почкующимся (В), двулопастным (Г), выемчатым (Д) и хвостатым (Е).
Результаты и обсуждение
При исследовании микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах птиц других видов было обнаружена широкая индивидуальная изменчивость частот анализируемых показателей [8, 9], причины которой ещё предстоит исследовать. В связи с этим получен-
ные нами результаты микроскопического анализа эритроцитов в мазках крови индюшат трёх исследованных групп представлены для каждой исследованной особи (табл. 1-3). По этим данным рассчитаны частоты клеток с микроядрами и другими ядерными аномалиями (табл. 4).
Таблица 1 - Количества нормальных и аберрантных эритроцитов у птиц 1-й группы,
получавших полный рацион, включающий полную дозу кормовой добавки «Алфави т АДзЕ»
Эритроциты Номер птицы в исследованной выборке Сумма
1 2 3 4 5 6 7
С нормальными ядрами 3135 3316 3196 3201 3221 3117 5463 24649
С микроядрами 2 3 2 3 3 2 6 21
С почкующимися ядрами 3 1 1 2 4 2 6 19
С двулопастными ядрами 0 0 1 0 0 0 2 3
С выемкой в ядре 12 18 8 9 6 4 14 71
С хвостатым ядром 1 0 0 1 2 1 0 5
С неклассифицированным аномалиями 3 5 2 4 1 3 3 21
Всего клеток с аномалиями 21 27 14 19 16 12 31 140
Всего эритроцитов 3156 3343 3210 3220 3237 3129 5494 24789
Таблица 2 - Количества нормальных и аберрантных эритроцитов у птиц 2-й группы, получавших полный рацион, включающий половинную дозу кормовой витаминной добавки _ «Алфавит АДзЕ»_
Эритроциты Номер птицы в исследованной выборке Сумма
1 2 3 4 5 6 7
С нормальными ядрами 5002 3495 3319 3074 3568 3164 3887 25509
С микроядрами 4 5 3 5 3 2 4 26
С почкующимися ядрами 5 3 1 4 5 4 6 28
С двулопастными ядрами 2 3 1 2 4 2 1 15
С выемкой в ядре 29 24 19 22 26 11 19 150
С хвостатым ядром 0 2 4 3 3 2 1 15
С неклассифицированным аномалиями 19 7 11 9 14 8 6 74
Всего клеток с аномалиями 59 44 39 45 55 29 37 308
Всего эритроцитов 5061 3539 3358 3119 3623 3193 3924 25817
Таблица 3 - Количества нормальных и аберрантных эритроцитов у птиц 3-й группы,
получавших стандартный рацион, но без кормовой витаминной добавки «Алфавит АД3Е»
Эритроциты Номер птицы в исследованной выборке Сумма
1 2 3 4 5 6 7
С нормальными ядрами 5413 3373 3346 3350 3116 3479 4161 26238
С микроядрами 5 4 5 6 1 5 4 30
С почкующимися ядрами 8 4 5 6 7 9 4 43
С двулопастными ядрами 3 2 1 4 4 5 5 24
С выемкой в ядре 29 23 21 36 16 24 31 180
С хвостатым ядром 3 1 5 4 6 4 3 26
С неклассифицированным аномалиями 18 9 7 19 17 10 13 93
Всего клеток с аномалиями 66 43 44 75 51 57 60 396
Всего эритроцитов 5479 3416 3390 3425 3167 3536 4221 26634
Таблица 4 - Средние частоты эритроцитов с нормальными и аномальными ядрами
в периферической крови индеек трёх исследованных групп
Частота эритроцитов Исследованные группы индеек
1 группа 2 группа 3 группа
Нормальных, % 99,44 ±0,03 98,81 ±0,04 98,51 ±0,05
Аномальных, % , 0,56 ±0,003 1,19 ±0,04 1,49 ±0,05
в том числе (в промилле):
С микроядрами, % 0,85 ±0,11 1,11 ±0,12 1,13 ±0,13
С почкующимися ядрами, % 0,77 ±0,10 1,08 ±0,12 1,61 ±0,16
С двулопастными ядрами, % 0,12 ±0,05 0,58 ±0,10 0,90 ±0,12
С выемкой в ядре, % 2,86 ±0,20 5,81 ±0,28 6,76 ±0,31
С хвостатым ядром, % 0,20 ±0,05 0,58 ±0,09 0,98 ±0,12
С неклассифицированными аномалиями, % 0,85 ±0,12 2,87 ±0,21 3,49 ±0,24
Питательная несбалансированность кормов включена в группу алиментарных неблагоприятных факторов, способных оказывать негативное воздействие на развитие индеек [10]. Их значение в 3-ю фазу онтогенеза индеек (с 5 по 8 недели) очень велико для развития птиц и, следовательно, для сохранения стабильности их генома. Количество витаминов в рационе исследованных птиц отразилось на цитогенетиче-ских параметрах следующим образом.
Частоты нормальных эритроцитов. Нормальные эритроциты имеют овальную форму с расположенным в центре овальным же ядром (рис.1, А) и без хроматиновых образований в цитоплазме. Средняя частота нормальных эритроцитов у индеек первой группы, получавших полную дозу витаминов, составила 99,44%, незначительно варьируя у отдельных птиц от 99,19 до 99,62% (табл. 1 и 3). Индейки второй группы, получавшие половинную дозу поливитаминной добавки, имели несколько меньшую среднюю частоту нормальных эритроцитов, равную 98,81% и варьирующую у отдельных особей от 98,48 до 99,09% (табл. 2).
Отсутствие в рационе птиц витаминной добавки сказалось на дальнейшем падении частоты нормальных эритроцитов. Средняя частота нормальных эритроцитов у птиц этой группы оказалась равной 98,51% с размахом изменчивости у отдельных птиц от 97,81 до 98,81% (табл. 3).
Частоты нормальных эритроцитов во второй группе птиц (получавших половинную дозу витаминов) и в третьей группе (не получавших витаминов) статистически достоверно отличаются от частоты нормальных эритроцитов у птиц первой (контрольной) группы при Р<0,001.
Частоты эритроцитов с микроядрами. Если кроме основного ядра в цитоплазме эритроцита обнаруживали дополнительную хроматиновое образование, то его учитывали как микроядро (см. рис.1, Б) Обычно микроядром считают хроматиновые тела, размер которых составляет от 1/10 до 1/3 диаметра основного ядра, лежащих в одной фокальной плоскости с основным ядром, имеющих тот же самый цвет, структуру и преломление света, как и главное ядро, и чётко отделённых от основного ядра слоем цитоплазмы. Индивидуальные частоты микроядерных эритроцитов у отдельных особей контрольной группы варьировали от 0,62 до 1,09%. Средняя частота эритроцитов с микроядрами у семи индюков из этой группы, получавшей полную дозу витаминов, была равной 0,85%. У птиц, получавших половинную дозу витаминов, средняя частота микроядерных эритроцитов была несколько выше, чем в контрольной группе и составляла 1,11%. Различия были статистически не достоверны. Индивидуальные частоты эритроцитов с микроядрами варьировали от 0,79 до 1,60%. В 3-ей группе птиц, не получавших витаминной добавки, средняя частота эритроцитов с микроядрами была самой высокой - 1,13% при варьировании частот у отдельных особей от 0,32 до 1,47%. Таким образом, полное исключение витаминной добавки из рациона птиц привело к росту средней частоты микроядерных эритроцитов до значений, статистически достоверно отличающихся от частоты микроядерных эритроцитов в первой (контрольной) группе птиц при Р<0,05. Это может свидетельствовать о нарушении гомеоста-тических и репарационных процессов в организме птиц, не получавших витаминов.
В единственной обнаруженной нами публикации, содержащей сведения о спонтанных частотах возникновения микроядер у индеек, указана величина, установленная по мазкам крови трёх птиц, была равна 0,22%о [3]. В нашем случае у здоровых индеек частота микроядер была в 4 раза выше. Из-за отсутствия других опубликованных данных о частотах микроядер в эритроцитах индеек объяснить это различие в результатах пока не представляется возможным. Однако размах изменчивости частот микроядер можно проанализировать на примере значительно более детально изученного вида птиц - курицы домашней (Gallus domesticus).
В одной из первых публикаций, касающихся вопроса микроядер в эритроцитах у кур [6], микроядерные эритроциты не были обнаружены вообще (частота микроядер = 0). Частота всех других ядерных аномалий была равна 1,14±0,11%. Средняя спонтанная частота микроядерных эритроцитов у 5 проанализированных кур, выращенных в сельской местности Саудовской Аравии и вскормленных натуральными кормами, составила 0,34%. Индивидуальные частоты клеток с микроядрами у отдельных особей варьировали от 0,1 до 0,8% т.е. различия были восьмикратными [11]. При исследовании влияния иммуностимуляторов маннана и ß-глюкана (mannan и ß-glucan) на цыплят в контрольной интактной выборке средняя спонтанная частота образования микроядер оказалась равной 1,47±0,31% (процента) [12]. Спонтанная частота микроядерных эритроцитов, обнаруженная у 38-суточных петушков кросса Хаббард Ф-15 была ещё более высокой и составила 4% (процента). Добавление в период с 11 по 38 сутки к основному рациону петушков 1,5, 2,0 и 2,5% фитоминералосорбента приводило к снижению частоты микроядерных эритроцитов до, соответственно, 3,0, 2,5 и 1,8% [13]. Таким образом, частота микроядер в эритроцитах периферической крови курицы домашней варьирует от нуля (или 0,02%, если учитывать те случаи, когда микроядра всё-таки были обнаружены) до 4%. Столь значительные различия между спонтанными частотами микроядер в периферической крови организмов одного и того же вида достаточно необычны. Причинами таких больших отличий в частотах могут быть не только индивидуальные особенности птиц, но и возможные различия у разных исследователей критериев выявления ядерных аномалий. В обоих случаях целесообразны дальнейшие исследования этого явления и, что не менее важно - стандартизация протокола учёта анализируемых аномалий.
Частоты эритроцитов с почкующимися ядрами. Ядра с пузыревидными выпячиваниями кариоплазмы (рис.1, В) названы почкующимися. Размер такой «почки» может достигать 1/3 от общего объёма ядра. Предполагают, что образование почкующихся ядер связано с амплификацией определённой части генома [6].
Частота эритроцитов с почкующимися ядрами в первой группе птиц (получавших полную дозу витаминной добавки) была равной 0,77%. При рационе кормления с половинной дозой витаминов наблюдали рост частоты почкующихся микроядер до 1,08%. Отсутствие в рационе витаминной добавки приводило к
ещё большему росту частоты таких аномалий - до 1,66%.
Частоты эритроцитов с двулопастным ядром -
ядром с перетяжкой, делящей его на две приблизительно равные доли; ширина ядра в области перетяжки 1/3-1/2 малого диаметра ядра (рис.1, Г). Двуло-пастные ядра, возможно, представляют собой ранние этапы аномального амитотического деления эритроцитов. Этот процесс должен будет приводить к неправильному распределению хромосом по дочерним клеткам. Средняя частота двулопастных ядер в эритроцитах индюшат, получавших полную дозу витаминной добавки, была равна 0,12%. Уменьшение дозы витаминов вдвое повышало среднюю частоту образования таких структур в периферической крови индюков до 0,58%. У группе птиц, не получавших витаминов, частота двулопастных ядер возрастала до 0,90%.
Частоты эритроцитов с выемкой в ядре. Такое ядро имеет чётко видимую выемку (зазубрину) глубиной от 1/5 до 1/2 длины большого диаметра ядра, края которой не соприкасаются (рис.1, Д). Ядра с выемкой оказались самым распространённым морфологическим отклонением. Их частота у птиц первой группы (полная доза витаминов в рационе) составила 2,86%, во второй группе (половинная доза витаминов в рационе) - 5,81% и в третьей группе (без витаминной добавки в рационе) - 6,76%. В некоторых эритроцитах просматривалась вторая выемка с противоположного конца ядра, создавая впечатление процесса расщепления ядра по длинной его оси на две приблизительно равные доли. Однако ни в одном из таких эритроцитов никаких признаков его подготовки к цитокинезу не наблюдали.
Частоты эритроцитов с хвостатыми ядрами. Хвостатыми были названы ядра, один край которых резко сужен и вытянут. Длина «хвоста» может быть до 1/3 большого диаметра ядра (рис.1, E). Ряд исследователей высказали предположение, что хвостатые ядра являются следствием разрыва кариоплазматиче-ских мостиков в клетке, при образовании в ней ди-центрической хромосомы, центромеры которой растягиваются нитями веретена деления к разным полюсам. В результате разрыва такой хромосомы ядерная оболочка, сформированная вокруг двух дочерних ядер образует у каждого ядра клювообразный вырост или «ядерный хвост» (рис. 1, Е). Частота хвостатых ядер в эритроцитах индюшат, получавших полную дозу витаминов, была равна 0,20%. Выращивание птицы на рационе лишь с половинной дозой витаминов вызывало увеличение частоты клеток с такими аномалиями до 0,58%. Полное исключение из рациона поливитаминной добавки приводило к ещё большему росту частоты хвостатых ядер до 0,98%. Эти данные позволяют сделать заключение о том, что недостаток в рационе птиц витаминов групп А, Бз и Е может приводить к увеличению частоты дицентрических хромосом.
Частоты эритроцитов с недифференцированными аномалиями ядер. Помимо указанных выше ядерных аномалий в эритроцитах были обнаружены и другие типы нарушений морфологии ядра (рис. 2), которые не могли быть отнесены ни к одному из ти-
пов аномалий, предложенных в работе [6] для анализа В нашей работе такие нарушения были отнесены в нестабильности генома у птиц. Их классификация одну группу - «недифференцированных» или «недолжна быть предметом специального исследования. определённых» аномалий.
Рис. 2. Различные не дифференцируемые аномалии ядер в эритроцитах индеек
Суммарная (средняя) частота всех недифференцированных ядерных аномалий в группе птиц, получавших полную дозу витаминов, была равна 0,85%. У индюков, получавших половинную дозу витаминов, частота таких аномалий возрастала до 2,87%. Периферическая кровь индюков, не получавших витаминов, содержала 3,49% эритроцитов с недифференцированными аномалиями ядер.
Суммарные частоты всех ядерных аномалий. Средние частоты эритроцитов с ядерными аномалиями всех шести типов в первой, второй и третьей группах птиц были равны 0,56, 1,19 и 1,49% соответственно. Последние две величины статистически достоверно отличались от первой (контрольной). Таким образом, уменьшение дозы витаминов вполовину и полное изъятие витаминной добавки из рациона птиц приводило к статистически достоверному росту суммарных частот эритроцитов с аномалиями. Средние частоты всех ядерных аномалий (включая эритроциты с микроядрами) у птиц первой второй и третьей групп составили 0,56, 1,19 и 1,49%, соответственно.
Эмбриональное развитие птиц и следующий за ним постнатальный онтогенез происходят под контролем генотипа. Во время развития птицы в процессе реализации наследственной информации происходит формирование видовых и индивидуальных биохимических, физиологических и морфологических свойств организма, формирующих хозяйственно ценные признаки птицы. Большая часть этих признаков имеют полигенную природу, поэтому их формирование происходит в результате сложного взаимодействия многих генов и биохимических процессов, детерминируемых работой этих генов. Устойчивое функционирование генотипа в большой мере зависит от внешних условий, в которых происходит развитие организма. Эти средовые факторы, внешние относительно генотипа, могут существенно влиять на реализацию генетической информации, ослабляя или усиливая её реализацию. Для осуществления этой сложной регуляции биохимических процессов геном птицы должен обладать определённой степенью стабильности, осуществляемой гомеостатическими механизмами на биохимическом уровне и процессами репарации наследственного материала на генетическом уровне.
Биохимический состав кормов является одним из внешних факторов, способных влиять и на стабильность генома птиц, и на характер реализации генетической программы в процессе откорма птиц. Не касаясь вопросов мутагенности различных химических
веществ, не предназначенных для кормления птицы, но иногда загрязняющих корма в результате различных событий и процессов, остановимся лишь на объекте нашего исследования - роли витаминов в нормальном функционировании генома.
Витамины представляют собой органические биологически активные соединения различной химической природы, выполняющие функции биокатализаторов либо самостоятельно, либо в составе других ферментов. Витамин А нужен для дифференцировки тканей у эмбрионов и нормального развития птенцов. Недостаток этого витамина у взрослых птиц приводит к нарушению зрения, снижению прироста живой массы, прекращению яйцекладок. Витамин D регулирует фосфорно-кальциевый обмен. Он способствует нормальному образованию костной ткани и скорлупы яиц. Недостаток витамина D приводит к нарушению минерального обмена, развитию рахита, у взрослых птиц снижается яйценоскость, в отложенных яйцах снижается качество скорлупы. Витамин Е способствует усвоению других жирорастворимых витаминов, обеспечивает нормальную функцию нервной и репродуктивной систем, активизирует пролиферацию клеток. При недостатке витамина Е могут развиваться мышечная дистрофия, некроз клеток, атаксия, паралич, бесплодие, угасание сперматогенеза, задержка развития и гибель эмбрионов.
В 1949-1952 гг. А. Новиком и Л. Сцилардом было открыто и описано явление антимутагенеза. Вещества, предотвращающие или ослабляющие действие мутагенного фактора, получили название антимутагенов. К настоящему времени антимутагенные свойства обнаружены у более чем 300 соединений, как природного происхождения, так и синтезированных химическим путём. В зависимости от химической природы исследователи разделяют эти антимутагены на несколько групп. Одну из этих групп представляют витамины. Каротиноиды (провитамины витамина А), витамины С, Е, В4, К, обладая антимутагенным действием, обеспечивают стабильность генома [14-17]. Однако помимо антимутагенных свойств витамины при определённых условиях могут проявлять комута-генные и даже мутагенные свойства. Комутагенное действие обнаружено у витаминов С, В2 и Е. Принимая во внимание неоднозначное значение витаминов для сохранения стабильности генома, следует предположить, что дальнейшее расширение круга исследований роли витаминов в процессах мутагенеза и антимутагенеза необходимо.
Заключение
Производство мяса индейки является одним из наиболее перспективных направлений в российском птицеводстве [18]. В условиях интенсивных технологий выращивания сельскохозяйственных птиц важным фактором достижения высокой продуктивности должно быть биологически полноценное кормление. Научно обоснованные рационы кормления сельскохозяйственной птицы являются результатом многолетних исследований учёных, и попытки их сокращения должны быть изучены до внедрения в производственную практику. В нашем исследовании показано, что уменьшение дозы витаминов в рационе птиц приводит к росту частоты микроядер и иных ядерных аномалий в эритроцитах периферической крови индюков. Это свидетельствует о росте частот аберраций хромосом в клетках кроветворных тканей. Надо полагать, что подобные нарушения происходят и в других тканях птиц, в том числе и генеративных. В этом случае недостаток витаминов в рационе птиц может приводить к снижению жизнеспособности следующих поколений птиц из-за унаследованных хромосомных нарушений.
Основываясь на полученных результатах, следует заключить, что сокращение в рационе индеек количества витаминных добавок с целью снижения себестоимости их откорма является нерациональным.
При анализе публикаций о частотах микроядер в клетках крови у индеек была обнаружена лишь одна работа [3], где сообщены результаты анализа микро-
1. Производство и рынок индейки в России // Ин-
формационно-Аналитическое Агенство «ИМИТ». Сообщение от 30.01.2019. http://emeatru/new.php?id=114353 (дата обращения 19.07.2019).
2. Falck G. Micronuclei in human peripheral lympho-
cytes - mechanistic origin and use as a bi-omarker of genotoxic effects in occupational exposure. / People and Work. Research Reports 104. Helsinki: Finnish Institute of Occupational Health. - 2014. - 108 p.
3. Zfiniga-Gonzalez G. et al. Spontaneous micronuclei
in peripheral blood erythrocytes from 54 animal species (mammals, reptiles and birds): part two. / Z6niga-Gonzalez G., Torres-Bugarin O., Luna-Aguirre J. [et al.] // // Mutation Res. - 2000. -V. 467. - № 1. - P. 99-103.
4. Калаев В.Н., Красножон К.Б., Игнатова И.В.
Оценка стабильности генома больных сахарным диабетом I типа с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии // Фундаментальные исследования. -2012. -№11. - С. 288-295.
5. Clark P., Boardman W.S., Raidal S.R. Atlas of
Clinical Avian Hematology. West Sussex, United Kingdom. A John Wiley & Sons, Ltd., Publication. - 2009. - VIII+182 p.
ядер у 3 мексиканских особей. Отечественных публикаций по этой теме не обнаружено. Возможно, публикуемые нами данные являются первой характеристикой спонтанных и индуцированных гиповитаминозом частот ядерных аномалий в эритроцитах индеек, выращиваемых в России.
Выводы
1) Спонтанная частота образования микроядер в эритроцитах индеек, получавших с полным рационом витаминную добавку «Алфавит АД3Е», была равной 0,88%. Спонтанная частота всех выявленных ядерных аномалий в сумме составила 0,56%.
2) Двукратное уменьшение в рационе индюков дозы витаминной добавки «Алфавит АД3Е» приводило к увеличению частоты образования микроядер до 1,01%. Суммарная частота всех ядерных аномалий увеличивалась до 1,01%.
3) Полное исключение из рациона индюков витаминной добавки «Алфавит АД3Е» вызывало увеличение частоты микроядерных эритроцитов до 1,13%. Суммарная частота ядерных аномалий возрастала до 1,49%.
4) Уменьшение дозы витаминной добавки «Алфавит АЭ3Е» в рационе индеек и, тем более, полное её исключение из рациона не целесообразно, даже с учётом экономии птицефабрикой средств, предполагаемых при сокращении объёма закупок витаминного препарата.
Литература
6. Курса М.А. и др. Цитогенетические параметры
нестабильности генома птиц в эколого-генетическом мониторинге / М.А. Курса, Е.С. Афанасьева, С.Р. Рушковский, Р.А. Барчук [и др.] // Проблеми безпеки атомних електростанцш i Чорнобиля. Выпуск 3, часть 2. Киев. - 2005. - С. 92-98.
7. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологи-
ческих и медицинских исследованиях. М.: Медицина, - 1975. - 295 с.
8. Adam M.L. et al. Assessment of Genome Damage
in Bird and Mammal Species as a Tool for Improvements in ex-situ Conservation at Zoos / M.L. Adam, R.A. Torres, M. Kiska, F.F. Oliveira // Natureza & Conservagao, Brazilian Journal of Nature Conservation. - 2013. - V. -11. - № 1. - P. 59-64.
9. Baesse C.Q. et al. Effect of urbanization on the
micronucleus frequency in birds from forest fragments / C.Q. Baesse, V.C. de Magalhaes Tolentino, S. Morelli, C. Melo // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2019. - V. 171. -P. 631-637.
10. Шевченко А.И., Ёлкина Л.Г. Характер прояв-
ления ряда неблагоприятных факторов в различные периоды роста и развития индеек // Птица и птицепродукты. - 2012. - № 1. - С. 49-51.
11. Saleh K., Sarhan M.A.A., 2007. Clastogenic anal-
ysis of chicken farms using micronucleus test in peripheral blood // Journal of Applied Sciences Research. -2007. -V. 3. -№ 12. -P. 1646-1649.
12. El-Seehy, M.A. El-Moghazy G.M., El-Okazy
A.M. Effect of mannan and p-glucan as feed additives on genotoxicity and immunity on broilers // Alexandria Science Exchange Journal. - 2013. - V. 34. - № 2. - P. 164-169.
13. Яковлева И.Н. и др. Микроядерный тест гено-
токсичности и его снижение при добавках к комбикорму птиц фитоминералосорбента / Яковлева И.Н., Мусиенко Н.А., Дронов В.В., и др. // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т.214. - С. 506510.
14. Дурнев А.Д. Антимутагенез и антимутагены //
Физиология человека. - 2018. - № 3. - С.116-137.
15. Clycombe K.J., Meydani S.N. Vitamin E and ge-
nome stability // Mutat. Res. Fundament. and Molec. Mech. of Mutagenesis. - 2001. - V. 475. -P. 37-45.
16. Collins A.R. Carotenoids and genomic stability //
Mutat. Res. Fundam. and Molec. Mech. of Mutagenesis. - 2001. - V. 475. - P. 21-28.
17. Halliwell B. Vitamin C and genomic stability //
Mutat. Res. Fundament. and Molec. Mech. of Mutagenesis. - 2001. - V. 475. - P. 29-35.
18. Давлеев А.Д. Ключевые факторы и тенденции
российского рынка индейки в 2014-2020 гг. Части 1 и 2. // Птица и птицепродукты. -2015. - № 4. - С. 12-15. - № 5. - С. 10-14.
Поступила в редакцию: 10.08.2019 г.
Крюков Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор, старший научный сотрудник ИНИИ ЦКП ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина», email: [email protected], тел. 8 (4862) 47-51-71, e-mail: [email protected]
Власова Евгения Юрьевна, студентка 5 курса ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет им. Н.В. Парахина», Россия, г. Орёл, тел. 8 (4862) 47 51 71, e-mail: [email protected]
