CC BY
71
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 8 No. 1 2012, pp. 48-56 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2012 by Perfilyeva, Rymareva, Zhivetev, Papkina
ORIGINAL ARTICLE
Influence of the hyperthermia and infection on activity of the general peroxidase of the potato of two grades, contrast on stability to Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Perfilyeva1 A.I., E.V. Rymareva1, M.A. Zhivetev1, A.W. Papkina2
1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Irkutsk, Russia
2 Irkutsk State University, Irkutsk, Russia
Tel: (395-2)42-50-09 E-mail:[email protected]
Received November 25, 2011
Studied change of activity of a general peroxidase in plants in vitro, in vegetated plants of steady and susceptible grades of a potato under influence abiotic (hyperthermia) and biotic (infection pathogen) stresses. It shown that activity of a peroxidase in plants of a susceptible grade changed more intensively, than in steady plants, without dependence from object of research (a plant in vitro, leaves of vegetated plants).
Key words: Potato, in vitro, vegetation, plants, peroxidase, hyperthermia.
ORIGINAL ARTICLE
Влияние гипертермии и заражения на активность общей пероксидазы картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Перфильева А.И.1, Е.В. Рымарева1, М.А. Живетьев1, А.В. Папкина2
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск, Россия
2 Иркутский государственный университет, г. Иркутск, Россия
Tel: (395-2)42-50-09 E-mail:[email protected]
Поступила в редакцию 25 Ноября 2011
Изучали изменение активности общей пероксидазы в растениях in vitro, в вегетирующих растениях устойчивого и восприимчивого сортов картофеля под влиянием абиотического (гипертермии) и биотического (заражение патогеном) стрессов. Показано, что активность пероксидазы в растениях восприимчивого сорта изменялась интенсивнее, чем в растениях устойчивого, вне зависимости от объекта исследования (растения in vitro, листья вегетирующих растений).
Key words: картофель in vitro, вегетирующие растения, пероксидаза, гипертермия.
Одним из наиболее важных антиоксидантных ферментов, являющихся показателем неспецифического иммунитета является пероксидаза, активность и спектр изоформ которой меняются под действием биологических и небиологических агентов (Рогожин и др., 2004). Стрессоры различной природы приводят к повышению активности пероксидазы. Например, в ответ на воздействие солями отмечены как активация фермента, так и качественные изменения в его спектре (Аникеева, Егоров, 2001), а также показано, что
при недостатке кислорода увеличивается интенсивность работы фермента и существенно меняется состав катионных форм (Ласточкин, 2005). Обезвоживание сопровождается не только повышением активности пероксидазы цитоплазмы и хлоропластов, но и изменением их изоферментного состава (Гайдаш, 2005). Под влиянием низких температур в листьях озимой ржи также возрастала активность фермента (Андреева, 1988). Повышение активности фермента ранее было отмечено и при механических повреждениях (Павловская и др.,
2010). На этиолированных проростках пшеницы показано, что их обработка в течение часа при 42°С увеличивала активность пероксидазы в корнях проростков и уменьшала ее в листьях (Орлова и др., 2007). Известно, что гипертермия изменяет активность антиоксидантных ферментов. Например, показано, что у ржи гипертермия необратимо изменяла активность каталазы, снижала активность каталазы огурца, сопровождаясь обесцвечиванием хлорофилла, что свидетельствует о существенном окислительном повреждении (Кошкин, 2010).
В настоящее время широкое распространение получило заболевание картофеля - кольцевая гниль картофеля, вызываемая бактерией Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) (Иванюк и др., 2005). Показано, повышение активности пероксидазы в растениях картофеля, зараженных данным патогеном (Граскова, 2011). Для выявления обеззараживающего эффекта гипертермии в зараженных Cms растениях картофеля в данной работе определяли изменение активности общей пероксидазы, как одного из важнейших маркеров иммунного статуса растительного организма. Причем изменения активности данного фермента исследовали в растениях картофеля различной структурной организации: картофель in vitro, вегетирующие растения (в вегетационных сосудах, в полевых условиях). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы растения картофеля (Solanum tuberosum L). Сорт Луговской - устойчивый к бактериальному фитопатогену Cms и сорт Лукьяновский -восприимчивый к Cms. Растения in vitro выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) 42.2 г/л (Sigma, США) с
добавлением сахарозы 20 г/л, пиридоксина 1 мл/л, тиамина 1 мл/л и феруловой кислоты 1 мл/л, рН 5.8-6.0. Черенки культивировали при температуре 24-25оС днем и 19-20оС ночью, освещенности 5-6 кЬх и продолжительности фотопериода 16 часов. Растения in vitro заражали суспензией Cms (штамм Ac 14 05), OD заражения = 1,3. Ранее было установлено, что Cms полностью колонизирует растения картофеля на 2-е сутки после заражения (Перфильева, Рымарева, 2011). Поэтому, зараженные растения спустя 2 суток после заражения подвергали термообработке (37; 39; 45°С) в течение 2 ч в термостате, затем выдерживали при комнатной температуре 2 ч, после чего определяли активность общей пероксидазы в тканях картофеля.
Для исследования активности фермента в листьях вегетирующих зараженных растений картофеля, проводили предпосадочную
обработку клубней картофеля. Клубни подвергали инъекции бактериальной суспензией Cms (OD = 1,0), затем клубни прогревали в термостате при 45°С, 1 ч. В силу того, что зараженные клубни нельзя высаживать в поле, во избежание заражения почвы патогеном, их высаживали в вегетационные сосуды с почвой.
Исследовали также влияние гипертермии на активность пероксидазы вегетирующих
растений картофеля, произрастающих в
естественной среде обитания. Клубни картофеля обрабатывали в термостате при 45°С, 1 ч, после чего, клубни высаживали на экспериментальном участке СИФИБРа.
Эксперименты на вегетирующих растениях проводили в 2009-2010 гг.
Для измерения активности общей
пероксидазы брали листья среднего яруса
вегетирующего картофеля / целое растение картофеля in vitro, определяли вес и растирали в двойном объеме 0.1 М цитратно-фосфатного буфера pH 5,5. Полученный гомогенат центрифугировали при 3000g в течение 10 мин и супернатант использовали для определения активности фермента при длине волны 580 нм в 2 мл реакционной смеси следующего состава: 0.5 мл 0.1 М цитратно-фосфатный буфер (pH 6.2 или 4.4), 0.5 мл 0.3% Н2О2 («Реахим», Россия), 0,5 мл 0,05% гваякол (Sigma, США).
350
д
м
а
4
8 2 300
5 5 250 а а 200 щ Н 150
л
т
с
о
н
й
и
т
к
<
н
о
к
100
50
Активность фермента рассчитывали по методу Бояркина (Бояркин, 1951) по формуле:
А = Е ( а • в • у) / d • t , где
А - активность фермента, у.е./мг;
Е - коэффициент экстинкции, равный 0,125;
а - отношение количества буфера, взятого для приготовления вытяжки в мл к весу сырой ткани;
Р - степень дополнительного разведения вытяжки в реакционной смеси;
у - степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси; d - толщина поглощающего слоя; t - время реакции, с.
a 0 % 1 2 1 2 1 2
26°С 26°C+Cms (2 26°C+Cms (7
суток) суток)
Вариант
Рисунок 1. Влияние Cms на активность общей пероксидазы растений картофеля in vitro. 1 -Лукьяновский; 2 - Луговской. n = 3. M ± S.D.
а
<<
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
4 5
Варіант
Рисунок 2. Влияние термообработки и заражения на активность общей пероксидазы растений картофеля in vitro сорта Лукьяновский. 1 - 26°С (контроль); 2 - 26°С + Cms; 3 -37°С; 4 - 37°С + Cms; 5 - 39°С; 6 - 39°С + Cms; 7 - 45°С; 8 - 45°С + Cms. n = 3. M ± S.D.
1
2
3
6
7
8
<Я
^ о Й 2
о ^ a н
в 13
в о
H v
О A
и S? в = н X <
180
160
140
120
100
80
60
40
20
f
t
3 4 5
Вариант
Рисунок 3. Влияние термообработки и заражения на активность общей пероксидазы картофеля сорта Луговской in vitro. 1 - 26°С (контроль); 2 - 26°С + Cms; 3 - 37°С; 4 - 37°С + Cms; 5 - 39°С; 6 - 39°С + Cms; 7 - 45°С; 8 - 45°С + Cms. n = 3. M ± S.D.
0
1
2
6
7
8
140
л
м
Я
Ч
В
W
а
о
а
И
л
н
W
о
X
a
в
н
а
<
2
ч
о
a
н
х
о
а
120
100
80
60
40
20
3 4 5 6
Вариант
0
1
2
7
8
Рисунок 4. Активность общей пероксидазы в листьях картофеля сортов Лукъяновский и Луговской, выращенных из клубней, зараженных Cms и обработанных повышенными температурами. (1 - Лукьяновский, 26 °С (контроль); 2 -Лукьяновский, Cms + 26 °С; 3 - Лукьяновский, 45 °С; 4 - Лукьяновский Cms + 45 °С; 5 - Луговской, 26 °С; 6 - Луговской, Cms + 26 °С; 7 - Луговской, 45 °С; 8 -Луговской, Cms + 45°С/Фаза бутонизации. п = 3-7. М ± S.D.
t. МП
1 120
i 4 100
и §
к о о во
& £
к 60
Й О к
и о м ы 40
д и
1 20
3 0
—Е—
т Г
i Чг~
12 3 4
Взрныгг
Рисунок 5. Активность общей пероксидазы в листьях картофеля сортов Луговской и Лукъяновский, выращенных из клубней, предварительно подвергнутых влиянию повышенной температуры (1 - Лукьяновский, 26°С; 2 - Лукьяновский, 45°С; 3 -Луговской, 26°С (контроль); 4 - Луговской, 45°С) п = 5. М ± S.D.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние термообработки и заражения на активность общей пероксидазы растений картофеля in vitro.
При сравнении активности исследуемого фермента у картофеля двух сортов, сразу после заражения и спустя 2 суток, активность пероксидазы растений Луговского сорта была чуть выше, чем активность пероксидазы из растений восприимчивого сорта Лукьяновский (рис.1). На 7-е сутки активность фермента у растений обоих сортов увеличивалась, причем интенсивнее у растений восприимчивого.
Представленные данные согласуются с данными, ранее полученными Грасковой (2008). Показано, что у растений восприимчивого сорта при заражении патогеном происходит синтез пероксидазы de novo, что требует времени и что не позволяет растению своевременно сформировать необходимую устойчивость (Граскова, 2008).
Оценивая влияние термообработки на активность исследуемого фермента в растениях
каждого сорта, следует отметить, что у растений восприимчивого сорта (Лукьяновский) заражение при любой термообработке повышало активность пероксидазы (рис.2).
У устойчивого же сорта (Луговской) активность общей пероксидазы при заражении повышалась лишь при обычной и закаливающей температуре (37°С), а при более высоких температурах (39 и 45°С) снижалась (рис.3).
Таким образом, под действием термообработки активность общей пероксидазы в различной степени повышалась у здоровых растений обоих сортов (рис. 2, рис. 3). У растений восприимчивого сорта она несущественно превышала таковую устойчивого сорта. Это свидетельствует о том, что защитная реакция на абиотический стресс носит неспецифический характер. Однако, совместное воздействие двух неблагоприятных факторов существенно изменяло активность общей пероксидазы. В тканях растений восприимчивого сорта наблюдали более высокую активность этого фермента при температуре 45°С по сравнению с устойчивым сортом в аналогичных
условиях. Это косвенно подтверждает специфичность устойчивости сортов растения-хозяина к патогену. Причем, в данном случае активность общей пероксидазы зависит от интенсивности гипертермии.
Влияние термообработки и заражения на активность общей пероксидазы в листьях вегетирующих растений картофеля, выращенных в вегетационных сосудах.
Исследования показали, что активность общей пероксидазы в тканях листьев здоровых растений восприимчивого сорта после термообработки клубней (45°С) понижалась, а у растений устойчивого сорта увеличивалась. В листьях зараженных растений восприимчивого сорта картофеля, как в контроле (26°С), так и обработанных при 45°С, наблюдалась тенденция к повышению активности общей пероксидазы (рис. 4). Наибольшее увеличение активности вызывала гипертермия по сравнению с контролем. Гипертермия на фоне заражения не вызывала дополнительного повышения активности фермента.
Активность общей пероксидазы в тканях листьев картофеля устойчивого сорта, выращенных из предварительно зараженных клубней, либо не изменялась после обработки при 26°С, либо уменьшалась при 45°С по сравнению с контролем.
Таким образом, на активность общей пероксидазы вегетирующих растений обоих сортов наибольшее влияние оказывала термообработка, что свидетельствует о неспецифичности ответных реакций растений. С другой стороны, специфичность ответа растений зависила от устойчивости к патогену. Так, у восприимчивого сорта активность общей пероксидазы повышалась, а у устойчивого -
снижалась, не зависимо от способа воздействия. Следует учитывать, что обработке подвергали клубни, а долговременную реакцию наблюдали через 45 дней. Это свидетельствует о запуске пролонгированных механизмов,
обеспечивающих долговременную ответную реакцию растений.
Влияние термообработки на активность общей пероксидазы в листьях вегетирующих растений картофеля, выращенных в полевых условиях.
Для исследования активности общей пероксидазы использовали листья среднего яруса кустов картофеля, выращенных в полевых условиях. Результаты активности фермента представлены на рис. 5.
Активность общей пероксидазы в тканях листа растений, выращенных из шокированных клубней (45°С) восприимчивого сорта была чуть выше, а у устойчивого сорта практически не изменялась (рис. 5). Из этого следует, что в условиях естественной среды, предпосадочная термообработка клубней изменяла активность общей пероксидазы листьев в зависимости от сорта картофеля.
Таким образом, на изменение активности пероксидазы под влиянием абиотического и биотического стрессоров не оказывают влияния условия культивирования картофеля. В трех условиях культивации (in vitro, вегетационные сосуды, полевые условия) у сортов наблюдалась одинаковая тенденция в изменении активности общей пероксидазы. Причем, интенсивность изменения фермента была различной, что объясняется разнообразными условиями выращивания. В данной работе не наблюдалось специфичности изменения активности пероксидазы в зависимости от условий
выращивания, данный показатель зависел только от сорта. У восприимчивого сорта активность пероксидазы возрастала как при гипертермии, так и при заражении. Пероксидазная активность тканей устойчивого сорта незначительно изменялась при влиянии стрессоров. Таким образом, показатель изменения активности пероксидазы может выступать маркером стрессового состояния организма в большей степени для растений восприимчивого сорта. ВЫВОДЫ
Наибольшие изменения, как при абиотическом, так и при биотическом стрессах наблюдались в растениях восприимчивого сорта (Лукьяновский). Активность общей пероксидазы увеличивалась при гипертермии, заражении и совместном действии гипертермии и заражения как на растения in vitro, так и на растения, выращенные в вегетационных сосудах и в полевых условиях.
У устойчивого сорта активность фермента при всех видах обработки существенно не изменялась, либо незначительно снижалась в растениях in vitro, в тканях листа вегетирующих растений, выращенных в вегетационных сосудах и в полевых условиях.
ЛИТЕРАТУРА
Андреева В.А. (1988) Фермент пероксидаза. М.: Наука, 128 с.
Аникеева Т.А., Егоров В.В. (2001) Влияние липидов и солей жирных кислот на активность пероксидазы в растворе. Вестник Московского университета. Серия химия, 42, 138-141.
Бояркин А.Н. (1951) Быстрый метод определения активности пероксидазы. Биохимия, 16, 352.
Гайдаш М.В. (2005) Процесс перекисного окисления липидов и активность пероксидазы в прорастающих семенах ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения и засухи. Канд. Дис., 130с.
Граскова И.А. (2008) Роль слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидаз в устойчивости растений к биотическому стрессу. Автореф. дисс. доктора биол. наук, Иркутск, 46 с.
Граскова И.А. (2011) Роль пероксидаз в устойчивости растений к биотическому стрессу. - Berlin: LAP LAMBER Academic Publishing, 356 с.
Иванюк В.Г., Банадысев С.А., Журомский Г.К. (2005) Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. - Мн.: Бенлпринт, 696 с.
Кошкин Е.И. (2010) Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур: учебник. -М.: Дрофа, 638 с.
Ласточкин В.В. (2005) Роль антиоксидантной энзиматической системы в адаптации растений к условиям аноксии и постаноксической аэрации. Канд. Дис., 128с.
Орлова А.Г., Олюшина Л.Н., Французова В.П., Веселов А.П. (2007) Влияние гипертермии на активность пероксидазы и ИУК-оксидазы проростков пшеницы. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 3, 116-118.
Павловская Н.Е., Гагарина И.Н., Горькова И.В., Козявина К.Н., Муштакова В.М., Фомина В.Н., Роговин В.В. (2010) Пероксидазозависимый иммунитет гороха к фузариозу. Вестник ОрелГАУ, 5, 72-74.
Перфильева А.И., Рымарева Е.В. (2011) Влияние гипертермии на распространение возбудителя кольцевой гнили картофеля по растениям картофеля in vitro. Вестник
ИрГСХА, 46, 30-36.
Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. (2004) Пероксидаза: строение и механизм действия. Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 200 с.
