CC BY
30
УДК 616.24-002.191-053.3 © Д.Ф. Сергиенко, 2010
Д.Ф. Сергиенко
ВЛИЯНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ НА ТЕЧЕНИЕ МУКОВИСЦИДОЗА У ДЕТЕЙ
ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава»
Изучены ассоциации полиморфизмов Т-1488С в гене ИФН-у, 3'-UTR G/C гена ИЛ-4 и I50V гена ИЛ-4Яа с течением бронхолегочного процесса и с характером поражения системы пищеварения у больных муковисцидозом. Учитывая полученные ассоциации с фенотипическими проявлениями недуга, изучаемые полиморфизмы можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений муковисцидоза и их анализ может оказаться полезным при прогнозировании возможных осложнений у конкретных больных с муковисцидозом.
Ключевые слова:муковисцидоз, дети, гены, цитокины.
D.F. Sergienko
THE INFLUENCE OF GENETIC POLYMORPHISMS ON THE COURSE OF MUCOVISCIDOSIS IN CHILDREN
There were studied the associations of polymorphisms T-1488C in the gene ITN-3'-UTR G/C gene IL-4 and 150V gene IL-4Ra with the course of bronchopulmonary process and character of damage in the system of digestion in patients with mucoviscidosis. Taking into consideration the received associations with phenotypic manifestations of the disease the studied polymorphisms could be considered as modificators of clinical features of the ailment and their analysis could be useful in prognostics of possible complications in proper patients with mucoviscidosis.
Key words: mucoviscidosis, children genes, cytokines.
Муковисцидоз (МВ) - наиболее частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), характеризующееся клиническим полиморфизмом [1]. Взаимосвязь между вариабельностью клинической картины и CFTR генотипом неоднозначна. Отсутствие прямой взаимосвязи между характером течения МВ и CFTR генотипом подтверждается многочисленными исследованиями [2, 3, 8]. Разнообразие фенотипических проявлений у больных МВ, имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, объясняется действием модифицирующих генов вне локуса МВ. Модифицирующее действие могут оказывать как гены, продукты которых влияют на экспрессию, функцию и утилизацию белка CFTR, так и гены, продукты которых участвуют в процессах, задействованных в патогенезе клинических проявлений МВ. Активный поиск кандидатных генов, оказывающих влияние на характер течения МВ, ведется в настоящее время многими группами исследователей. Для этого были изучены полиморфные аллели различных генов, особое внимание уделяется генам, вовлеченным в процессы иммунной защиты и воспаления. Особенно активно ведутся поиски генов-кандидатов, модулирующих степень поражения легких. В результате было получено много фактов, подтверждающих взаимосвязь полиморфизма генов, кодирующих провосполительные и противовоспалительные цитокины, а также факторы защиты слизистых, с тяжестью течения МВ. Согласно исследованиям, проведенным как в нашей стране, так и зарубежом, доказана ассоциация вариантных аллелей гена MBL2, ФНО-а (фактора некроза опухоли), ИЛ-1Р (интрлейкина-1Р) с более тяжелым течением легочного процесса при МВ [2, 3, 4, 8].
В настоящее время очень активно рассматривается возможное участие в развитии патологии легких и печени генов, ответственных за экспрессию ИЛ-4 (интерлейкина-4) и ИФН-у (интерферона-у) и их рецепторов, которым отведены одни из ведущих ролей в иммунологическом воспалении, разворачивающимся при кисто-фиброзе поджелудочной железы [2, 3].
Несмотря на ключевое значение данных цитокинов в генезе хронического воспаления при муковисцидо-зе, в доступной медицинской литературе данных о влиянии полиморфизмов в гене ИФН-у, ИЛ-4 на течение муковисцидоза как у детей, так и у взрослых нами не найдено. В тоже время, генетические полиморфизмы указанных генов могут играть определенную роль как в прогрессировании бронхолегочного процесса, так и формировании осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
Задачи исследования:
1. Проанализировать частоты полиморфизмов в генах ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-4Rа среди больных муковис-цидозом и здоровых индивидов.
2. Изучить ассоциации полиморфизмов в указанных генах с течением бронхолегочного процесса и с характером поражения системы пищеварения у больных муковисцидозом.
Материалы и методы. В исследование были включены 63 пациента с МВ. Все дети были обследованы по общим клиническим методикам согласно стандартам, рекомендованным для данной категории больных. В контрольную группу для проведения генетических исследований вошел 91 здоровый русский житель г. Томска.
Определение полиморфных генетических маркеров генов проводили на базе НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск.
Для выполнения молекулярно-генетического анализа производили выделение тотальной ДНК из цельной крови с помощью стандартного метода фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфных маркеров изучаемых генов осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализа). Характеристика исследованных полиморфизмов генов представлена в таблице 1.
Таблица 1
Генетическая характеристика исследуемых полиморфизмов
Ген Хромосомная локализация Локализация в гене Полиморфизм Название белка Фермент рестрикции Роль в иммунном ответе
IL4 5q31.1 3'-UTR 3'-UTR G/C Интерлейкин-4 Taq I Провоспалительный ответ, стимуляция гумор. звена
IL4RA 16р12.1-р11.2 Экзон 3 I50V Рецептор к интерлейкину - 4 RsaI Взаимодействие с ГЬ4, влияние на гуморальный ответ
ИФН-у 12q14 промотор Т-1488С интерферон-гамма Нра! Провоспалительный ответ, стимуляция клеточного звена иммунитета
У пациентов с различными аллелями и генотипами анализировались следующие параметры: пол, возраст, объем терапии, место проживания, время манифестации кишечного и респираторного синдромов, возраст постановки диагноза, форма заболевания и тяжесть течения, показатели функции внешнего дыхания по данным спирографии, результаты посева мокроты, массо-растовой индекс, поражения гепатобилиарной системы.
Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), сравнения частот аллелей и генотипов, оценки связи аллелей генов с МВ использовали критерий X Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы равном 1, а также двусторонний точный тест Фишера в случае, если ожидаемое значение хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности было меньше 5. Кроме того, об ассоциации с патологическим фенотипом различных генотипов (или их комбинаций) и аллелей судили по величине отношения шансов (Odds Ratio - OR), которое показывает, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов). Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием описательных статистик. Для определения достоверности различий качественных признаков использовали анализ таблиц сопряженностей с вычислением точного значения критерия X и точного критерия Фишера. Для анализа количественных признаков при сравнении двух независимых выборок применяли критерий Манна-Уитни, при сравнении трех и более выборок - Н-критерий Краскола-Уолисса.
Результаты и их обсуждение. Обследовано 64 пациента с МВ, из них 30 девочек и 33 мальчика. По возрасту дети были распределены следующим образом: с года до 3-х лет - 3,7%, с 3 до 7 лет - 3,7%, с 7-12 лет -34,9%, подростки старше 12 лет - 58,7%. Средний возраст постановки диагноза составил 3,14±0,25 года (0,1-14 лет). Средний возраст манифестации проявлений со стороны легких и желудочно-кишечного тракта - 0,33±0,11 (0 до 10) и 0,19±0,081 (от 0 до 6) года, соответственно. Смешанная форма заболевания отмечалась у 93,3% (60) больных, преимущественно кишечная - у 2 детей, преимущественная легочная - у 1 пациента. Тяжелое течение МВ наблюдалось у 63,5% (40) пациентов, у 31,74% (19) - течение средней тяжести у 4,77% (3) - легкое.
Высев Staphylococcus aureus присутствовал у 41,27% пациентов. Высев Pseudomonas aeruginosa отмечен у 42,86% больных, Burkholderia cepacia была идентифицирована при микробиологическом посеве мокроты у 26,98% больных, Alcaligenes xylosoxidans - у 3,2%, Haemophilus influenzae - у 4,81%. Среди всего многообразия осложнений заболевания доминировали формирование хронического легочного сердца и цирроз печени (49,8% и 31,7% соответственно).
При изучении полиморфизма генов модификаторов иммунного ответа (ИЛ-4, ИЛ-4RA, ИФН-у) у больных МВ и в контрольной группе были выявлены следующие особенности. В контрольной выборке русских жителей г. Томска и больных МВ распределение генотипов практически всех изученных полиморфных вариантов соответствовало ожидаемому при равновесии Хайди-Вайнберга (табл. 2). Выявлена ассоциация полиморфизма Т-1488С гена ИФН-у с развитием муковисцидоза: OR=1,77 (1,10<0R<2,87) (p=0,018). Для других изученных маркеров генов модификаторов иммунного ответа связи с заболеванием получено не было.
Таблица 2
Распределение генотипов и частот аллелей изучаемых генов в группах здоровых доноров и больных МВ
Частота аллеля P ОЯ
больные контроль
G/C 3'-UTR полиморфизм гена IL4
C=0,330 1 C=0,323 0,985 1,03 (0,65<0R<1,64)
Полиморфизм 150V гена IL4RA
I=0,590 1 I=0,625 0,536 0,86 (0,57<0R<1,51)
Полиморфизм T-1488C гена IFN у*
С=0,433 1 С=0,321 0,018 1,77 (1,10<0R<2,87)
При исследовании взаимосвязи полиморфизма в гене ИФН-у с течением бронхолегочного процесса при МВ был обнаружен ряд закономерностей.
У носителей мутантного аллеля модификации Т-1488С прослеживалось более благоприятное течение бронхолегочного процесса, выражающееся лучшими показателями объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) (71,6% от д. против 54,8% от д.; р=0,046) (где д. - должного) в старшей возрастной группе и более редким высевом грамотрицательной микрофлоры из бронхиального дерева (45,8% и 91,2%, соответственно; р<0,01), по сравнению с гомозиготами по нормальному аллелю Т (табл. 3).
Таблица 3
Таблица средних значений ФЖЕЛ и ЖЕЛ у больных МВ с разными генотипами по гену 1488 Т-С в зависимости от возраста
ФЖЕЛ T/C, C/C Т/Т Критерий Манна-Уитни
5-11 лет 74,1±6,3 77,4±9,4 Z=-0,31;p=0,75
12-18 лет 72,4±4,6 62,1±7,6 Z=1,73; p=0,1
ОФВ1 T/C, C/C Т/Т
5-11 лет 77,4±5,8 74,3±8,6 Z= 0,46; p=0,71
12-18 лет 71,6±5,9 54,8±7,9 Z= 2,34; p=0,046
Возможно, столь благоприятное влияние аллеля С связано с высокой экспрессией ИФН-у, способного повышать фагоцитарную и бактерицидную деятельность макрофагов, нейтрофилов в очаге поражения (легочной ткани), секрецию оксида азота (N0), регулировать липополисахоридиндуцированное воспаление [5, 7].
При анализе ассоциаций изучаемого полиморфизма с желудочно-кишечными проявлениями МВ было доказано, что у больных муковисцидозом, являющихся носителями аллеля С в гена ИФН-у наблюдается ранняя манифестация кишечного синдрома (0,15 года против 0,32 года) и более частое формированием цирроза печени (53,8% против 16,2%; р=0,003), чем у обладателей генотипа Т/Т.
Полученный результат закономерно соотносится с ролью ИФН-у, который, с одной стороны, способен оказывать прямое цитотоксическое действие на гепатоциты и повышать содержание цитолитических ферментов, с другой - увеличивать количество и стимулировать пролиферацию звездчатых клеток печени, что в конечном итоге приводит к усилению фибропластической активности и новообразованию коллагеновых волокон [6]. В тоже время повышение синтеза NO, обусловленное высокими титрами ИФН-у, способствует развитию портальной гипертензии [11].
Изучение 3'-UTR G/C гена ИЛ-4 позволило впервые выявить у больных МВ ассоциацию полиморфного аллеля С с менее благоприятным развитием бронхолегочного процесса, заключающимся в достоверном снижении показателей функции внешнего дыхания: функциональной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) (p<0,01) и ОФВ1 (p<0,1). Анализ данных показал, что среди пациентов с аллелем G в гомозиготном состоянии доминируют дети с нормальными показателями ФЖЕЛ и ОФВ1, в то время как с генотипами G/C, С/С - с умеренными и легкими изменениями функции внешнего дыхания.
Мы полагаем, что выявленная закономерность обусловлена повышением экспрессии гена, ассоциированным с нарастанием уровня ИЛ-4 в биотопах. Это, в свою очередь, ведет к выраженной девиации иммунного ответа в сторону гуморального механизма, в основе которого лежит активация В-лимфоцитов и синтез иммуноглобулинов различных классов, в том числе и IgE. Избыточное количество АТ при невозможности элиминации возбудителя приводит к нарастанию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). В результате повреждающего действия ЦИК происходит нарушение целостности морфологических структур органа с формированием бронхоэктазов, что клинически выражается в снижении показателей функции внешнего дыхания (ФВД). С другой стороны, высокий уровень иммуноглобулинов Е (IgE) способствует повышению гиперреактивности бронхов и усилению обструктивного синдрома [5, 9].
Значимых различий по частоте идентификации в микробиологическом анализе мокроты P. aeruginoza, S. аигеш и B. cepacia между группами пациентов с разными генотипами гена ИЛ-4 не выявлены.
Функционирование ИЛ-4 невозможно без его рецептора. Рецептор состоит из двух субъединиц а и у. Альфа субъединица связывается с ИЛ-4 и передает от него сигнал внутрь клетки, а гамма - взаимодействует с различными регуляторами этого процесса [10, 12, 13].
Учитывая роль гена ИЛ-4Ra в генезе воспалительного процесса, мы проанализировали влияние полиморфных вариантов (Ile50Val) на течение муковисцидоза у детей.
Анализ показателей ФВД показал, что в группе больных с генотипами I/V, V/V выявлены достоверно (р=0,05) более высокие показатели ФЖЕЛ (79,6±3,3% от д.) по сравнению с группой больных с генотипом I/I (65,3±5,1% от д.) (Z=2,04, p=0,05) (табл. 4). Показатели ОФВ1 у больных с аллелем V достоверно выше
(73,3±3,9% от д.), чем у пациентов с генотипом I/I (64,1±4,3% от д.; р=0,05). Статистический анализ данных показал, что достоверных различий между пациентами с различными генотипами по полиморфизму I50V гена ИЛ-4Ra и характером микробиологического пейзажа мокроты не выявлено. Однако, P. aeruginosa обнаруживалась чаще в мокроте пациентов с мутантным аллелем V, чем у больных МВ с генотипом I/I, но различия не достигали 5%-го уровня значимости (%j2=2,37; p=0,12).
Таблица 4
Средние значения показателей функции внешнего дыхания (ФЖЕЛ и ОФВ1) у больных с различными генотипами по мутации I50V гена ИЛ-4Иа
Показатель ИЛ-4Яа U Р
I/V, V/V I/I
ОФВ1 % 73,3±3,9 64,1±4,3 2,14 0,05
ФЖЕЛ % 79,6±3,3 65,3±5,1 2,08 0,05
Мы полагаем, что нарушение функции внешнего дыхания у больных с I50 обусловлены увеличением активности субъединицы а рецептора ИЛ-4, повышение активации STAT-6 - внутриклеточного активатора транскрипции генов ИЛ-4 и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Это, в свою очередь, ведет к избыточной активности ИЛ-4 ответа, выраженной активации гуморального механизма, синтезу иммуноглобулинов различных классов, в том числе и IgE, которые в свою очередь способствуют повышению гиперреактивности бронхов, выраженности обструктивного синдрома, что отражается в снижении ОФВь Избыточное количество АТ, секрети-руемое вследствии стимуляции В-лимфоцитов ИЛ-4 приводит к нарастанию ЦИК, в результате повреждающего действия которых происходит нарушение целостности морфологических структур органа с формированием бронхоэктазов, что клинически выражается в снижении ФЖЕЛ. Следствием грубых морфологических изменений в легких является повышение давления в легочной артерии, что в дальнейшем способствует формированию хронического легочного сердца. В ходе статистического анализа получена ассоциация полиморфизма 150V гена IL4Rа аллеля I с развитием хронического легочного сердца при МВ (p=0,03). Резюмируя вышеизложенное, можно утверждать, что у больных МВ гомозигот I/I установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса и более частое формирование ХЛС, чем у пациентов с генотипом V/V, V/I полиморфизма I50V гена ИЛ-4Ra.
Таким образом, резюмируя все вышеизложенное, можно утверждать, что гены ИЛ-4, ИЛ-4Rа и ИФН-у можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений МВ. Анализ изученных полиморфизмов может оказаться полезным при прогнозировании возможных осложнений у конкретных больных МВ.
Выводы:
1. Частоты изученных мутаций и полиморфизмов в генах ИЛ-4 и ИЛ-4 Rа в выборках здоровых индивидов и больных муковисцидозом не различаются. Выявлено достоверное различие частот генотипов и аллелей по модификации T-1488C гена ИФН-у, по сравнению с выборкой здоровых индивидов (p<0,01). Получена ассоциация полиморфизма Т-1488С гена ИФН-у с развитием муковисцидоза: OR=1,77 (p=0,018).
2. У больных муковисцидозом, являющихся носителями мутации Т-1488С в гена ИФН-у, выявлено более тяжелое, чем у обладателей генотипа Т/Т, поражение желудочно-кишечного тракта, проявляющееся ранней манифестацией кишечного синдрома (0,15 года против 0,32 года) и частым формированием цирроза печени (53,8% против16,2%; р=0,003). У носителей мутантного аллеля модификации Т-1488С прослеживается более благоприятное течение бронхолегочного процесса, выражающееся лучшими показателями ОФВ1 (71,6% от д. против 54,8% от д.; р=0,046) в старшей возрастной группе и более редким высевом грамотрицательной микрофлоры из бронхиального дерева (45,8% и 91,2%, соответственно; p<0,1), по сравнению с гомозиготами по нормальному аллелю Т.
3. У больных муковисцидозом, с генотипом G/C, С/С по сравнению с гомозиготными носителями аллеля G миссенс-мутации 3'-UTR G/C гена ИЛ-4, установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса, проявляющееся снижением показателей ФЖЕЛ (70,7% от д. против 83,1% от д.; р=0,016) и ОФВ1 (66,6% от д. против 76,3% от д.; р=0,1). Различия в показателях ФВД у пациентов с данной мутацией наиболее выражены в старшей возрастной группе.
4. У больных муковисцидозом, гомозигот I/I гена ИЛ-4Ra, установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса, проявляющееся снижением показателей ФВД: ФЖЕЛ (65,3% от д. против 79,6% от д.; р<0,05), ОФВ! (64,1% от д. против 73,3% от д.; р<0,05) и более частым формирование хронического легочного сердца (р=0,037) по сравнению с носителями аллеля V (p<0,05).
ЛИТЕРАТУРА
1. Капранов Н.И. Перспективы ранней диагностики и адекватного лечения больных муковисцидозом, в РФ // Муковисцидоз у взрослых и детей // Материалы IX национального Конгресса по муковисцидозу. - Москва. - 2009. - С. 7-13.
2. Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. Значение некоторых генов-модификаторов в клиническом течении и исходах муковисцидоза // Пульмонология (приложение по муковисцидозу). - 2006. - С. 46-49.
3. Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н., Рудко А. А. Генетические иммунологические маркеры воспалительного процесса при муковисцидозе у детей // Сборник статей и тезисов VIII национального Конгресса по муковисцидозу. - Ярославль, 2007. - С. 45-48.
4. Корытина Г.Ф., Бабенкова Л.И., Янбаева Д.Г. Полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (TNFA, LTA, IL1B и IL1-RN) у больных муковисцидозом и хроническими бронхолегочными заболеваниями // Медицинская генетика. - 2004. - № 7. - С. 333-339.
5. Лесков В.П., Чередеев А.Н., Горлина Н.К. Клиническая иммунология для врачей. - М.: Фармарус Принт, 1997. - 124 с.
6. Мажитов А.В. Клинико-патогенетическое значение перикисного окисления липидов и цитокинов у больных неалкогольным стеатогепатитом: автореф. Дис.... канд. мед. наук. - Махачкала. - 2008. - 22 с.
7. Ожегова Д.С. Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Томск, 2009. - 24 с.
8. Петрова Н.В., Гинтер Е.К. Десятилетний опыт молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза в МНГЦ РАМН // Пульмонология. - 2001. - № 3. - С. 17-20.
9. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М. Генетика атопии // Вестник ВоГиС. - 2006. - Т. 10, № 3. - С. 42-503.
10. Фрейдин М.Б. Значение генетических преддиктов для первичной профилактики бронхиальной астмы у детей // Педиатрия. - 2005. - № 6. - С. 4-7.
11. Яковенко А.В., Яковенко Э.П. Цирроз печени: вопросы терапии // Consilium medicum. - 2006. - № 7. -С. 26-28.
12. Mitsuyasu H., Yanagihara Y., Mao X.-Q. Dominant effect of Ile50Val variant of the Human lL-4 receptor a-chain in lgE synthesis // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 1227-1231.
13. Mitsuyasu, H., Yanagihara Y., Mao X.-Q. Ile50Val variants or iL4Ra upregulates IgE synthesis and assotiates with atopic asthma // Nat. Genet. - 1998. - Vol. 19. - P. 119-120.
Сергиенко Диана Фикретовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры факультетской педиатрии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава», Россия, 414000, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 61-01-84, е-mail: gazken@rambler.ru
