CC BY
42
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616:612.017.1
В. И. Селедцов, А. Г. Гончаров, В. А. Шмаров В. В. Малащенко, М. Е. Меняйло, Н. Д. Газатова Н. М. Тодосенко, А. Е. Мельников, О. Б. Мелащенко А. З. Мархайчук, Е. Швецова
ВЛИЯНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВАЦИОННЫЙ СТАТУС И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
Проведено исследование, характеризующее прямое влияние GM-CSF и Epo на активацию и функциональную активность Т-лимфоцитов, находящихся в разной степени дифференцировки. Получены данные, указывающие на наличие у Epo и CSF-GM противоспалительных иммунорегулятор-ных свойств. Достигнутые результаты демонстрируют значимость прямого влияния этих гемопоэтинов на функциональную активность Т-кле-ток в общем механизме гемопоэтической иммунорегуляции.
The authors present the results of a study proving a direct effect of GM-CSF and Epo on the functional activity and activation status of T-cells in varying degrees of differentiation. The obtained data demonstrate immunoregulatory and anti-inflammatory properties of Epo and CSF-GM. The study shows the direct impact of hematopoietins on the T-cells functional activity in hemato-poietic immunoregulation.
Ключевые слова: Т-лимфоцит, цитокин, гемопоэтин, активация, CD25, CD38.
Key words: T-cell, cytokine, hematopoietin, activation, CD25, CD38.
Введение
В последнее десятилетие в физиологии достаточно четко сформировалось представление о новой системе организма, вовлеченной в адаптогенез, — цитокиновой сети. Она наряду с нервной, эндокринной и иммунной системами принимает активное участие в формировании и регуляции адаптивных реакций, определяет их интенсивность и продолжительность. Считается, что цитокиновая сеть не только осуществляет связь между иммунокомпетентными клетками, но и опосредует межсистемные взаимодействия в организме. В настоящее время к семейству цитокинов относят около 220 пептидных молекул [5]. Предметом нашего исследования стали цитокины, относящиеся к группе гемо-поэтических факторов, основное назначение которых — стимуляция роста и дифференцировки кроветворных и иммунокомпетентных клеток.
Гемопоэтические реакции — важный элемент в механизмах адаптации к изменяющимся условиям внешней среды. В реализации этих реакции ведущая роль принадлежит группе эндогенных гуморальных
© Селедцов В.И., Гончаров А.Г., Шмаров В. А., Малащенко В.В., Меняйло М.Е., Газатова Н.Д., Тодосенко Н. М., Мельников А. Е., Мелащенко О. Б., Мархайчук А. З., Швецова Е., 2016
Вестник Балтийского федерального университета им. И. Канта. Сер.: Естественные и медицинские науки. 2016. № 2. С. 60 — 72.
веществ, стимулирующих кроветворение, — гемопоэтинам. Данные вещества стимулируют кроветворение, в том числе и ту его часть, которая формирует иммунную защиту организма. Роль гемопоэтинов сводится не только к восполнению количества иммунокомпетентных клеток; они, по-видимому, также принимают участие в регуляции адаптивных иммунных реакций и поддержании иммунной памяти. Однако представления о роли гемопоэтинов в регуляции долговременной иммунной памяти пока не сформированы. В настоящей работе приведены результаты исследования влияния эритропоэтина (erythropoietin, Epo) и гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) на активацию и функциональную активность Т-лимфоцитов человека.
К классическим гемопоэтинам относятся гранулоцитарный коло-ниестимулирующий фактор (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), макрофа-гальный колони-стимулирующий фактор (macrophage colony-stimulating factor, M-CSF), интерлейкин-3 (interleukin-3, IL-3), интерлейкин-7 (IL-7) и эритропоэтин (erhytropoietin, Epo) [20]. Инфекция, травма, неблагоприятные внешние воздействия — все это гемопоэз-возмущаю-щие факторы. По сути, любое антигенное воздействие является гемо-поэз-возмущающим и приводит к развитию адаптивных, пролифера-тивных, иммунных реакций и формированию иммунной памяти. Логично предположить, что иммунные клетки, активирующиеся в ответ на антигенную стимуляцию, сразу попадают под влияние гемопоэти-нов, находящихся в их микроокружении. В частности, показано, что эритропоэтин усиливает антигенпрезентирующую функцию дендритных клеток и тем самым усиливает первичный иммунный ответ [24].
Гемопоэтины, по-видимому, также являются регуляторами патологических иммунных реакций. Например, показано, что GM-CSF усиливает воспалительные реакции при аутоиммунных заболеваниях [33]. Тем не менее в целом эффекты гемопоэтических факторов на адаптивные иммунные реакции остаются малоизученными. Практически не исследовано влияние этих факторов на клеточные механизмы формирования и поддержания иммунной памяти. Знание гемопоэтических механизмов регуляции адаптивных иммунных реакций позволит, с одной стороны, глубже понять фундаментальные механизмы адаптогене-за, с другой — расширит теоретическую основу для разработки новых методических подходов к лечению иммунологических расстройств.
Основными клетками — продуцентами GM-CSF являются макрофаги, тучные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и Т-лимфоциты [15]. Этот цитокин практически всегда присутствует в тканях и плазме крови. Его продукция усиливается под влиянием противовоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, и фактор некроза опу-холи-альфа [7; 14; 16; 17; 19; 29; 35]. GM-CSF стимулирует рост предшественников гранулоцитов, макрофагов, эозинофилов и мегакариоци-тов [10; 11; 32]. Прямые эффекты этого фактора на Т-лимфоциты в специальной литературе не описаны. Влияние GM-CSF на Т-клетки может реализоваться опосредованно, через активацию антиген-презентирую-щих клеток, поскольку он выступает важнейшим дифференцировоч-
61
62
ным цитокином для дендритных клеток [37]. Согласно опубликованным данным [37], рецепторы к СМ-СББ могут экспрессироваться на Т-клетках. Однако мембранная экспрессия этих рецепторов трудновы-являема [37].
Еро — основной ростовой фактор для эритроидных клеток [3; 9; 22]. Продуцентами Еро у взрослого человека выступают почечная ткань, гепатоциты и эпителиальные клетки, окружающие центральные вены [3; 22; 38]. Внешним стимулирующим фактором для выработки эри-тропоэтина может быть снижение парциального давления кислорода и, соответственно, уменьшение насыщения крови кислородом, а внутренним фактором — кровопотеря или разрушение эритроцитов. Оба этих фактора могут присутствовать как при травме, так и при развитии инфекционного процесса. Наибольшая экспрессия рецепторов Еро имеет место на ядросодержащих эритроидных клетках. Рецепторы Еро также обнаружены на моноцитах/макрофагах, лимфоидных, эндотелиаль-ных, нервных клетках и кардиомиоцитах [26; 28]. В литературе описано подавление высокими дозами Еро роста предшественников гранулоци-тов и макрофагов [9; 12; 38]. Отмечены разнонаправленные эффекты Еро на продукцию активированными Т-клетками ШМ-у и 1Ь-10, ТМБ-а, 1Ь-4 и 1Ь-5 [1; 24]. Также описан ингибирующий эффект Еро на Т-кле-точную пролиферацию [18].
Таким образом, анализ литературных данных, посвященных влиянию СМ-СББ и Еро, указывает на возможность их вовлечения в регуляцию адаптивного иммуногенеза. Но детального анализа непосредственного влияния этих цитокинов на Т-лимфоциты разной зрелости в специальной литературе не представлено. Восполнить этот пробел призваны наши исследования, целью которых было охарактеризовать прямые эффекты эритропоэтина (Еро) и гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (СББ-СМ) на активацию и функциональную активности Т-лимфоцитов человека разной степени диф-ференцировки.
Материалы и методы
В исследование были включены 42 здоровых донора в возрасте от 21 до 40 лет. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности (Ficoll-Paque™ PREMIUM sterile solution, density 1,077±0,001 g/ml, GE Healthcare, США). Позитивную селекцию CD3+ клеток проводили методом колоночной магнитной сепарации (MS Columns, Miltenyi Biotech, Германия) с использованием суперпарамагнитных частиц MACS MicroBeads, коньюгированных с высокоспецифичными моноклональ-ными антителами (МКАТ) к молекуле CD3 (CD3 MicroBeads human, Miltenyi Biotech, Германия). Подсчет клеток осуществляли на автоматическом счетчике частиц (Z2, Beckman coulter, США).
Выделенные CD3+ Т-клетки (1,0—1,5 • 106 кл/мл) культивировали в 24-луночных планшетах в бессывороточной среде TexMACS (Miltenyi Biotech, Германия), в присутствии частиц, коньюгированных с антителами к молекулам CD2, CD3 и CD28 (T-Cell Activation/Expansion Kit human, Miltenyi Biotech, Германия), или без них в контроле в течение
48 часов при 370С во влажной атмосфере, содержащей 5 % СО2. Данный комплекс имитирует функции антигенпрезентирующей клетки, направленные на активацию Т-лимфоцита. В эксперименте был использован диапазон концентраций (0,01; 0,10; 1,00 и 10,00 нг/мл) рекомби-нантной формы GM-CSF (Miltenyi Biotech, Германия), а также Epo-P (Эпокрин, Россия) — 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 МЕ/мл.
Иммунофенотипирование клеток проводили с использованием бло-катора Fc-рецепторов и МКАТ, коньюгированных с флюоресцентной меткой, в виде коктейля, приготовленного ex temporo, к поверхностным антигенам: CD3, CD4, CD8, CD197, CD45RA, CD25, CD38 (BioLegend, США). Цитометрический анализ выполняли на анализаторе BD Accuri C6.
Цитокины определяли в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа (твердофазный сэндвич-метод) с использованием следующих наборов реагентов: гамма-интерферон-ИФА-Бест, интерлейкин-2-ИФА-Бест, интерлейкин-4-ИФА-Бест, интерлей-кин-10-ИФА-Бест (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) — на биохимическом и иммуноферментном анализаторе ChemWell 2910 (AwarenessTechno-logy, Inc.).
Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения IBM SPSS Statistics v21 (Statistical Package for the Social Sciences, США). При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова — Смирнова). Вычисляли средневыборочные характеристики: медиану (М), первый и третий квартили (Qi, Q3); для оценки достоверности различий выборок использовали парный непараметрический критерий для зависимых выборок Вилкоксона. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.
63
Результаты и обсуждение
Для определения чистоты выделенной популяции и ее жизнеспособности клетки инкубировали с РЕ-коньюгированными анти-CD3 антителами и раствором Propidium iodide (PI) (eBioscience, США). Исходное содержание Т-клеток в выделенных суспензиях составляло 99,0 ± 1,0 %, их жизнеспособность была не менее 95 %.
Цитометрический анализ Т-клеток позволял отнести их к CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитам, выявить внутри них субпопуляции наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти, а также терминально-дифференцированных эффекторных клеток. В каждой Т-клеточной субпопуляции определяли число CD25+ и CD38+ клеток.
Согласно имеющимся данным, GM-CSF принимает участие в развитии воспалительных реакций. Мы оценили прямое влияние GM-CSF на активацию Т-лимфоцитов по мембранной экспрессии молекул CD25, CD38, а также на их функциональную активность по продукции цито-кинов. Из данных таблицы 1 видно, что GM-CSF в минимальной концентрации (0,01 нг/мл) оказывал статистически значимое негативное влияние на содержание CD25+ клеток среди терминально дифференцированных CD4+лимфоцитов, культивируемых с активирующими частицами.
Содержание С025+ клеток среди Т-лимфоцитов, прокультивированных с СМ-С8Б (Ме (<2|-СЬ))
Клеточная популяция Соде ржание С025+ клеток, %
Без активации С активацией СМ-СББ (нг/мл) без активации СМ-СББ (нг/мл) с активацией
10,00 0,01 0,10 1,00 10,00
СБЗ+ 0,2 (0,1-0,8) 22,2 (12,6-24,7) 0,3 (0-1,1) 20,7 (13,9-21,9) 21,9 (13,7-23,8) 22,0 (14,7-24,7) 20,0 (14,1-23,7)
СБЗ+СБ4+: 0,2 (0,1-0,9) 14,0 (7,7-17,4) 0,1 (0-1,1) 12,1 (7,7-16,3) 14,0 (8,2-16,7) 13,6 (8,2-17,9) 13,0 (8,6-15,5)
+ О и СБ45КА+ СБ197+ 0 (0-0,1) 4,9 (1,1-9,4) 0 (0-0,1) 5,1 (0,9-8,1) 5,7 (0,6-10,3) 6,9 (1,0-9,3) 5,1 (0,7-9,2)
СБ45КА-СБ197+ 0,1 (0-0,8) 10,8 (1,9-16,3) 0,1 (0-0,9) 11 (2,0-17,3) 13,0 (2,1-17,2) 12,7 (2,3-18,9) 12,6 (2,6-15,5)
СБ45КА-СБ197- 0,7 (0,1-4,1) 40,2 (26,5-47,4) 0,5 (0-4,9) 34,2 (6,7-44,3) 38,0 (7,9-45,9) 39,1 (9,2-46,3) 40,4 (8,4-46,0)
СБ45КА+ СБ197- 0,4 (0-4,4) 48,7 (29,9-64,0) 0(0-3,8) 32,9* (3,9-55,3) 35,3 (4,3-60,4) 40,4 (7,1-59,7) 45,0 (2,7-60,9)
СБЗ+СБ8+ 0,4 (0,3-0,6) 32,9 (21,6-41,4) 0,6 (0-0,8) 33,2 (23,2 - 36,5) 34,5 (23,0-40,3) 35,6 (24,5-40,2) 32,9 (23,7-40,9)
+ оо О и СБ45КА+ СБ197+ 0,1 (0-0,1) 7,1 (4,4-15,4) 0,1 (0-0,1) 6,2 (1,95-17,8) 12,3 (3,0-17,0) 10,7 (2,4-20,4) 10,4 (2,8-16,4)
СБ45КА-СБ197+ 0,1 (0-0,6) 29,8 (27,8-39,2) 0,2 (0-0,9) 24,9 (15,5 - 35,9) 27,3 (20,9-35,8) 37,6 (22,2-37,7) 31,1 (18,1-40,3)
СБ45КА-СБ197- 0,9 (0,6-1,4) 48,9 (35,6-68,7) 1,5 (0-2,0) 46,8 (34,2-60,6) 48,7 (32,0-65,6) 46,6 (34,4-66,1) 49,2 (33,8-66,3)
СБ45КА+ СБ197- 0,6 (0,3-1,2) 31,0 (25,6-39,4) 0,8 (0-2,0) 29,0 (13,5-40,1) 32,3 (14,3-40,9) 31,1 (14,4-42,1) 31,1 (16,8-44,3)
Согласно данным, представленным в таблице 2, СМ-СББ в диапазоне концентраций от 0,01 до 1 нг/мл статистически значимо увеличивал содержание С038+ клеток среди С03+ Т-лимфоцитов, культивируемых с активирующими частицами. Также было выявлено позитивное влияние СМ-СББ в концентрации 0,1 нг/мл на содержание С038+ клеток среди С08+ Т-лимфоцитов. В концентрациях 1 и 0,1 нг/мл СМ-СББ усиливал активацию С04+ наивных Т-лимфоцитов и С04+ центральных Т-клеток. В концентрации 0,1 нг/ мл СМ-СББ также оказывал позитивное действие на активацию С08+ наивных Т-лимфоцитов и С08+ центральных Т-клеток памяти. Таким образом, установлено, что СМ-СББ способен усиливать активацию Т-лимфоцитов, которые либо локализованы в центральных лимфоидных органах, либо должны туда мигрировать и которые еще не растратили свой ростовой потенциал.
В ответ на активацию Т-лимфоциты способны вырабатывать как про-воспалительные (ГЬ-2, ШЫ-у), так и антивоспалительные цитокины (ГЬ-4, ГЬ-10). Спектр продуцируемых цитокинов характеризует функциональную направленность Т-клеточной активности [36]. Мы исследовали эффекты СМ-СББ (в диапазоне концентраций от 0,01 до 10 нг/мл) на Т-кле-точную продукцию цитокинов. Установлено, что СМ-СББ в максимальной концентрации (10 нг/ мл) достоверно усиливал продукцию как ГЬ-2, так и ГЬ-4. В то же время в концентрациях 10 и 0,01 нг/ мл СМ-СББ приводил к статистически значимому снижению продукции ГЬ-10 активированными Т-лимфоцитами. При минимальной концентрации (0,01 нг/мл) СМ-СББ также снижал Т-клеточную продукцию ГРЫу. Таким образом, СМ-СББ способен оказывать разнонаправленное влияние на продукцию цитоки-нов активированными Т-клетками, в котором преобладает противовоспалительная ТЪ2 направленность, характеризующаяся снижением продукции ГЫР-у и повышением выработки ГЬ-4.
Анализируя полученные результаты, можно сказать, что взаимодействие СМ-СББ со своим рецептором на поверхности Т-лимфоцитов практически не оказывало влияния на активацию большинства Т-клеток, выявляемую по мембранной экспрессии молекулы С025. Отмечено лишь статистически значимое влияние СМ-СББ (0,01 нг/мл) на активацию терминально дифференцированных С04+ лимфоцитов. Экспрессия С025 (альфа цепи рецептора к 1Ь-2) ассоциируется с клональной экспансией Т-лимфоцитов, происходящей в ходе антиген-индуциро-ванного адаптивного иммуногенеза [6]. СМ-СББ, по-видимому, не играет существенной роли в механизме размножения антиген-реактивных Т-клеток, а следовательно, и в механизме поддержания долговременной иммунной памяти. С другой стороны, СМ-СББ оказывал статистически значимое влияние на активацию Т-клеток, выявляемую по мембранной экспрессии С038. С038 — это полифункциональная молекула, которая участвует, в частности, в синтезе и гидролизе цикличной АДФ-рибозы, регулирующей уровень кальция в клетке. Возможно, что экспрессия С038 в большей степени, чем экспрессия С025, отражает функциональную активность Т-клетки, прежде всего ту ее часть, которая напрямую не связана с клеточным делением. Интересно, что СМ-СББ, по-видимому, способен снижать провоспалительную активность Т-клеток. Этот факт указывает на возможное участие СМ-СББ в цитокиновой регуляции воспаления, функционирующей по механизму обратной связи.
65
Содержание СОЭ8+ клеток среди Т-лимфоцитов, прокультивированных с СМ-С8Б (Ме (<2гСЬ))
Клеточная популяция Содержание СОЭ8+ клеток, %
Без активации С активацией СМ-СББ (нг/мл) без активации СМ-СББ (нг/ мл) с активацией
10,00 0,01 0,10 1,00 10,00
СБЗ+ 10,6 (7,6-16,6) 24,9 (20,6-29,7) 10,0 (8,9-16,1) 25,9* (23,3-32,1) 26,9* (24,0-31,7) 26,7* (22,7-31,9) 25,1 (22,1-29,4)
СБЗ+СБ4+ 8,2 (6,0-10,7) 25,4 (21,0-30,7) 8,7 (5,2-11,6) 30,2 (27,4-33,0) 30,9 (28,7-33,7) 30,5 (28,2-33,7) 28,1 (26,9-32,1)
3 и СБ45КА+ СБ197+ 23,4 (15,5-30,5) 47,1 (29,1 -62,7) 21,3 (14,3-31,3) 49,5 (39,8-66,4) 51,0 (36,0-67,5) 50,8* (41,5-63,3) 49,9 (35,7-61,6)
СБ45КА-СБ197+ 9,1 (7,1-12,8) 28,6 (24,3 - 29,9) 10,3 (7,3-13,1) 29,1 (24,6-32,6) 31,3* (27,6-32,3) 29,1 (25,8-33,4) 28,9 (25,7-30,0)
СБ45КА-СБ197- 3,7 (2,2-5,3) 14,2 (10,3-19,0) 2,8 (1,9-4,4) 15,5 (9,8-20,0) 15,7 (9,7-21,1) 16,8 (11,0-20,9) 15,1 (11,1-19,5)
СБ45КА+ СБ197- 8,3 (5,7-15,2) 40,3 (29,8-51,0) 8,6 (6,3-10,8) 45,7 (37,6-54,6) 47,1 (38,6-55,5) 44,2(38,1-53,4) 42,3 (36,9-54,6)
СБЗ+СБ8+ 9,3 (7,6-19,8) 20,6 (15,8-27,7) 9,7 (8,5-18,4) 21,8 (17,5-30,1) 22,5* (17,9-29,7) 20,9 (17,6-29,6) 19,4 (18,2-26,4)
+ оо О и СБ45КА+ СБ197+ 9,5 (5,3-24,4) 25,7 (19,2-37,6) 9,9 (7,4-22,9) 28,6 (22,6-38,1) 29,3* (22,5-40,6) 26,5 (21,0-38,8) 24,6 (21,8-37,5)
СБ45КА-СБ197+ 12,6 (9,6-18,4) 25,4 (17,7-33,3) 11,8 (10,6-17,3) 26,0 (19,8-34,3) 26,9* (21,7-34,0) 26,3 (19,1-33,9) 23,8 (19,6-29,2)
СБ45КА-СБ197- 2,8 (1,7-4,9) 8,0 (4,9-10,2) 2,7 (1,7-4,5) 6,3 (5,4-10,0) 8,1 (5,5-11,8) 8,0 (5,0-10,0) 7,3 (4,6-10,6)
СБ45КА+ СБ197- 6,7 (2,4-8,9) 15,4 (11,7-18,9) 7,0 (2,7-10,9) 15,5 (12,7-22,3) 16,8 (14,9-22,3) 17,1 (15,1-19,5) 15,4 (13,8-21,5)
Согласно данным, Еро-Р (100 ме/мг) не оказывал существенного влияния на активацию Т-клеток, выявляемую по экспрессии СD25. Мы также проанализировали содержание CD38+ клеток среди Т-лимфоци-тов, прокультивированных с активирующими частицами. Согласно полученным результатам, Epo не оказывал статистически значимого влияния на активацию как СD4+, так и СD8+ Т-клеткок (данные не приводятся).
Добавление максимальной концентрации (100 ме/мг) Epo в среду не оказывало существенного влияния на продукцию ^-2, ^-4, ^-10 и ШМ-у покоящимися Т-лимфоцитами. Активация Т-клеток приводила к выраженному усилению продукции всех указанных цитокинов.
Добавление Еро в концентрациях 0,1; 1; 10; 100 ме/мг в среду оказывало умеренный стимулирующий эффект на продукцию активированными Т-лимфоцитами ^-2, ^-4 и ГЬ-10. В пробах с Еро было отмечено выраженное ингибирование продукции интерферона-у (1БМ-у). Интересно, что наблюдаемые эффекты не ассоциировались с изменением активационной активности Т-клеток. Отсюда можно предполагать, что Еро способен регулировать продукцию цитокинов в Т-клетках на внутриклеточном трансляционном и/или транскрипционном уровне.
^-2 является основным ростовым фактором для Т-лимфоцитов в процессе адаптивного иммуногенеза [23; 31]. Результаты наших исследований указывают на способность Еро прямо усиливать продукцию ^-2 активированными Т-лимфоцитами. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными об увеличении концентрации ^-2 в крови пациентов с хронической почечной недостаточностью после Еро-терапии. Было показано, что мононуклеарные клетки крови таких больных способны усиливать продукцию ^-2 под воздействием Еро [26]. Правомерно предполагать, что через усиление клональной экспансии антиген-специфичных Т-клеток Еро способствует формированию иммунной памяти. Однако такое усиление пролиферативной активности лимфоцитов может сдерживаться повышенной активностью Т-клеток, продуцирующих ГЬ-10. Согласно представленным данным, выработка ^-10 Т-клетками может усиливаться под воздействием Еро. Эти результаты согласуются с имеющимися данными о способности Еро поддерживать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-клеток [2; 23; 27; 31], которая частично опосредуется через локальную секрецию трансформирующего ростового фактора-бета, 1И0 и ^-35. Очевидно, что такой эффект Еро может быть, по крайней мере частично, обусловлен индуцированным Еро усилением продукции ^-2, который, в свою очередь, может быть задействован в активации регуляторных Т-клеток. Согласно полученным нами данным, Еро может оказывать супрессорный эффект на продукцию ШМ-у. 1БМ-у играет ключевую роль в развитии иммунных реакций, опосредуемых Т-хелперами 1-го типа (ТМ) [4;, 25].
Полученные данные согласуются с представлением о том, что Еро оказывает негативный эффект на опосредуемые ТЬ1 провоспалитель-
67
68
ные иммунные процессы, и этим частично можно объяснить его антивоспалительную активность. В целом имеющиеся данные указывают на целесообразность клинического использования Еро не только как стимулятора эритропоэза, но и в качестве иммуномодулятора, например при лечении ревматоидного артрита. В этом случае Еро мог бы супрес-сировать активность аутоиммунных ТЬ1 и одновременно усиливать эритропоэз, который, как правило, страдает при этом заболевании. На наш взгляд, применение Еро может быть также клинически оправданным при лечении рассеянного склероза и других заболеваний, ключевую роль в развитии которых играют аутоиммунные ТЬ1.
Литературные источники указывают на возможную вовлеченность гемопоэтических факторов (СМ-СББ, ^-3 и Еро) в регуляцию адаптивных иммунных реакций [8; 21]. В действительности СМ-СББ способствует развитию воспалительных реакций, а Еро, по-видимому, обладает антивоспалительной активностью, тогда как ^-3 опосредованно, через влияние на антигенпрезентирующие клетки стимулирует лимфопоэз и адаптивный иммуногенез [13; 30; 34]. В нашей работе впервые представлены данные, характеризующие прямое влияние СМ-СББ и Еро на активацию и функциональную активность Т-лимфоцитов, находящихся в разной степени дифференцировки. Эти данные указывают на значимость прямого влияния данных гемопоэтинов на функциональную активность Т-клеток в общем механизме опосредуемой гемопоэтинами иммунорегуляции.
Выводы
1. Взаимодействие СМ-СББ со своим рецептором на поверхности Т-лимфоцитов практически не оказывало влияния на активацию основных субпопуляций Т-клеток, выявляемую по экспрессии молекулы CD25. Отмечено статистически значимое влияние СМ-СББ на активацию терминально дифференцированных CD4+ лимфоцитов. В то же время СМ-СББ значимо повышал активацию CD3+ Т-клеток, выявляемую по экспрессии молекулы CD38. Под влиянием СМ-СББ происходило увеличение содержания CD38+ клеток среди наивных CD8+ лимфоцитов и CD8+ Т-клеток памяти, прокультивированных с активирующими частицами. Среди CD4+ клеток СМ-СББ также повышал количество CD38+ наивных Т-лимфоцитов и центральных Т-клеток памяти. Таким образом, СМ-СББ способен усиливать активацию Т-лимфоцитов, которые либо локализованы в центральных лимфоидных органах, либо должны туда мигрировать.
2. СМ-СББ усиливал продукцию активированными Т-клетками ^-2 ^-4. При этом СМ-СББ снижал Т-клеточную продукции ГИ0 и ШБ-у. Таким образом, СМ-СББ, по-видимому, способен уменьшать провоспа-лительную активность Т-клеток. Этот факт указывает на возможное участие СМ-СББ в цитокиновой регуляции воспаления, функционирующей по механизму обратной связи.
3. Еро обладал умеренным стимулирующим эффектом на продукцию активированными Т-лимфоцитами Г^2, и ГИ0 и выраженным ингибирующим эффектом на Т-клеточную продукцию ШМ-у. Ин-
тересно, что наблюдаемые эффекты не ассоциировались с изменением активации Т-клеток. Отсюда можно предполагать, что Epo способен регулировать продукцию цитокинов в Т-клетках на внутриклеточном трансляционном и/ или транскрипционном уровне.
Список литературы
1. Гончаров А. Г., Шмаров В. А., Малащенко В. В. и др. Прямое влияние гемопо-этинов на функциональную активность Т-лимфоцитов // Российский иммунологический журнал. 2015. Т. 9, № 18. С. 49 — 51.
2. Жулай Г. А., Олейник Е. К. Регуляторные Т-лимфоциты CD4+CD25+FOXP3+. Перспективы применения в иммунотерапии // Труды Карельского научного центра РАН. 2012. № 2. С. 3—17.
3. Меркулов В. А., Солдатов А. А., Авдеева Ж. И. и др. Препараты рекомби-нантных эритропоэтинов и их характеристика // Биопрепараты. Профилактика. Диагностика. Лечение. 2013. № 3 (47). С. 5 — 12.
4. Сологуб Т. В., Цветков В. В., Деева Э. Г. Интерферон-гамма — цитокин с противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью / / Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2014. № 3. С. 56—60.
5. Ярилин А. А. Иммунология : уУчебник. М., 2010.
6. Larbi A., Fulop T. From «Truly Naïve» to «Exhausted Senescent» T Cells: When Markers Predict Functionality // Cytometry Part A. 2014. Vol. 85A. P. 25 — 35.
7. Briend E., Colle J. H., Fontan E. et al. Human glycoprotein HGP92 induces cytokine synthesis in mouse mononuclear phagocytes // Int Immunol. 1995. Vol. 7. P. 1753 — 1761.
8. Brugger W., Mocklin W., Heirnfeld S. et al. Ex vivo expansion of enriched peripheral blood CD34+ progenitor cells by stem cell factor, interleukin-1a, IL-6, IL-3, interferon-a and erythropoietin // Blood. 1993. Vol. B1. P. 2579.
9. Bunn H. F. New agents that stimulate erythropoiesis // Blood. 2007. Vol. 109 (3).
10. Burgess A. W., Camakaris J., Metcalf D. Purification and properties of colony-stimulating factor from mouse lung-conditioned medium // J Biol Chem. 1977. Vol. 252. P. 1998 — 2003.
11. Burgess A. W., Metcalf D. The nature and action of granulocyte-macrophage colony stimulating factors // Blood. 1980. Vol. 56. P. 947 — 958.
12. Byts N., Sirm A. L. Erythropoietin: a multimodal neuroprotective agent // Experimental & Translational Stroke Medicine. 2009. Vol. 1. P. 4.
13. Caux C., Vanbervliet B., Massacrier C. et al. Interleukin-3 cooperates with tumor necrosis factor alpha for the development of human dendritic/Langerhans cells from cord blood CD34+ hematopoietic progenitor cells // Blood. 1996. Vol. B7. P. 2376 — 2385.
14. Cleveland D. W., Yen T. J. Multiple determinants of eukaryotic mRNA stability / / New Biol. 1989. Vol. 1. P. 121 — 126.
15. Cousins D. J., Staynov D. Z., Lee T. H. Regulation of interleukin-5 and granulo-cyte-macrophage colony-stimulating factor expression // Am J Respir Crit Care Med. 1994. Vol. 150. P. 50 — 53.
16. Farrar W. L., Brini A. T., Harel-Bellan A. et al. Hematopoietic growth-factor signal transduction and regulation of gene expression // Immunol Ser. 1990. Vol. 49. P. 379 — 410.
69
17. Griffin J.D., Spertini O., Ernst T.J. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines regulate surface expression of the leukocyte adhesion molecule-1 on human neutrophils, monocytes, and their precursors // J. Immunol. 1990. Vol. 145. P. 576-84.
18. Heeger P. Erythropoietin inhibits proliferation of human T cells // Nature Reviews Nephrology. 2014. Vol. 10. P. 299.
19. Huleihel M., Douvdevani A., Segal S., Apte R. N. Different regulatory levels are involved in the generation of hemopoietic cytokines (CSFs and IL-6) in fibroblasts stimulated by inflammatory products // Cytokine. 1993. Vol. 5. P. 47 — 56.
20. Iscove N. N., Yan X. Q. Precursors (pre-CFCmulti) of multilineage hemopoietic colony-forming cells and correlatin with long-term reconstituting cells in vitro // J. Immunol. 1990. Vol. 145. P. 190 — 196.
21. Iscove N. N., Shaw A. R., Keller G. Net increase of pluripotential hematopoietic precursors in suspension culture in response to IL-1 and IL-3 // J. Immunol. 1989. Vol. 142. P. 2332 — 2337.
22. Jelkmann W. Molecular Biology of Erythropoietin // Internal Medicine. 2004. Vol. 43. N 8 (August). P. 649—659.
23. Kovanen P. E., Young L., Al-Shami A. et al. Global analysis of IL-2 target genes: identification of chromosomal clusters of expressed genes // Int. Immunol. 2005. Vol. 17, № 8. P. 1009—1021.
24. Lifshitz L., Prutchi-Sagiv S., Avneon M. et al. Non-erythroid activities of erythropoietin: Functional effects on murine dendritic cells // Mol Immunol. 2009. Vol. 46. P. 713 — 21.
25. Lisowska K. A. Recombinant phenotype and proliferation of CD4-positive T tymphocytes // Artif Organs. 2010. Vol. 34(3). P. 77 — 84.
26. Lisowska K. A., Bryl E., Witkowski J. M. Erythropoietin receptor is detectable on peripheral blood lymphocytes and its expression increases in activated T lymphocytes // Haematologica. 2011. Vol. 96. P. 13.
27. Lisowska K.A., Dgbska-Slizien A., Jasiulewicz A. et al. The Influence of Recombinant Human Erythropoietin on Apoptosis and Cytokine Production of CD4+ lymphocytes from Hemodialyzed Patients // J. Clin. Immunol. 2013. № 33. P. 661 — 665.
28. Lisowska K.A., Frackowiak J. E., Mikosik A., Witkowski J. M. Changes in the Expression of Transcription Factors Involved in Modulating the Expression of EPO-R in Activated Human CD4-Positive Lymphocytes // PLOS ONE. 2013. Vol. 8(4). P. 603 — 626.
29. Lisowska K. A. The Influence of Recombinant Human Erythropoietin on Apoptosis and Cytokine Production of CD4+ lymphocytes from Hemodialyzed Patients // J. Clin. Immunol. 2013. Vol. 33. P. 661—665.
30. Arcasoy M. O. The non-haematopoietic biological effects of erythropoietin // British Journal of Haematology. 2008. Vol. 141. P. 14 — 31.
31. Malek T. R. The main function of IL-2 is to promote the development of T regulatory cells / / Journal of Leukocyte Biology. 2003. Vol. 74. P. 961—965.
32. Nicola N. A. Granulocyte colony-stimulating factor and differentiation-induction in myeloid leukemic cells // Int J. Cell Cloning. 1987. Vol. 5. P. 1 —15.
33. Piper Ch., Pesenacker A. M., Bending D. et al. T-Cell Expression of Granulocyte—Macrophage Colony-Stimulating Factor in Juvenile Arthritis Is Contingent Upon Th17 Plasticity Arthritis // Rheumatol. 2014. Vol. 66(7). P. 1955 — 1960.
34. Schrader J. W., Clark-Lewis I., Crapper R. M. et al. The panspecific hemopoietin interleukin 3: physiology and pathology // J. W. Schrader (ed.). Lymphokines 15; Interleukin 3; The Panspecific Hemopoietin. San Diego, 1988. P. 181 — 311.
35. Schwager I., Jungi T. W. Effect of human recombinant cytokines on the induction of macrophage procoagulant activity // Blood. 1994. Vol. 83. P. 152 — 160.
Влияние гемопоэтических ростовых факторов на Т-лимфоциты человека -^
36. Ftilop T., Larbi A., Pawelec G. Human T-cell aging and the impact of persistent viral infections // Frontiers in immunology. 2013. Vol. 4. P. 1 — 9.
37. Wada H., Noguchi Y., Marino M. W. et al. T-cell functions in granulocyte/mac-rophage colony-stimulating factor deficient mice / / Proc Natl Acad Sci. 1997. Vol. 94. P. 12557—12561.
38. Yuanyuan Zhang, Li Wang, Soumyadeep Dey et al. Erythropoietin Action in Stress Response, Tissue Maintenance and Metabolism // International Journal of Molecular Sciences. 2014. Vol. 15. P. 10296 — 10333.
Об авторах
Виктор Иванович Селедцов — д-р мед. наук, проф., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: seledtsov@rambler.ru
Андрей Геннадьевич Гончаров — канд. мед. наук, ст. науч. сотр., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: agoncharov59@mail.ru
Вячеслав Анатольевич Шмаров — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: enant@list.ru
71
Владимир Владимирович Малащенко — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: vvslon@rambler.ru
Максим Евгеньевич Меняйло — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта,, Калининград.
E-mail: max89me@yandex.ru
Наталья Динисламовна Газатова — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: n_gazatova@mail.ru
Наталья Михайловна Тодосенко — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: tod_89@mail.ru
Артем Евгеньевич Мельников — асп., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград. E-mail: melgip39@gmail.com
Ольга Борисовна Мелащенко — науч. сотр., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград. E-mail: omelashchenko@kantiana.ru
Айшат Зиябутдиновна Мархайчук — инж.-исслед., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград. E-mail: ayshat.90@rambler.ru
Екатерина Швецова — клинич. ординатор, Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград. E-mail: jekaterina. svecova@gmail. com
About the authors
72
Prof. Victor Seledtsov, Director of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: seledtsov@rambler.ru
Dr Andrey Goncharov, Senior Researcher of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: agoncharov59@mail.ru
Viacheslav Shmarov, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: enant@list.ru
Vladimir Malashchenko, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: vvslon@rambler.ru
Maksim Meniailo, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: max89me@yandex.ru
Nataliya Gazatova, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: n_gazatova@mail.ru
Nataliya Todosenko, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: tod_89@mail.ru
Artem Melnikov, graduate student of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: melgip39@gmail.com
Olga Melaschenko, research officer of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: omelashchenko@kantiana.ru
Ayshat Markhaychuk, research engineer of the Center for Medical Biotechnology, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad. E-mail: ayshat.90@rambler.ru
Jekaterina Svecova, medical resident of the Medical Institute, I. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: jekaterina. svecova@gmail. com
