CC BY
3ВЛИЯНИЕ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И БИОСИНТЕЗ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ МУТАНТНЫМИ ШТАММАМИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ
ГРИБОВ
1Холмурадова Н.К., 2Пулатова О.М., 3Исматов Н.Б., 4Алимова Б.Х., 5Махсумханов
А.А., 6Давранов К.Д., 7Садиков И.И.
1,2,4,5,6Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан 3,7Институт ядерной физики Академии наук Республики Узбекистан E-mail: ozoda.pulatova67@ mail .com https://doi.org/10.5281/zenodo. 8372462
Аннотация. Показано, что степень радиочувствительности как природного штамма, так и мутантных штаммов продуцентов лимонной кислоты (ЛК), находится в прямой зависимости от количества конидий в инокуляте и дозы облучения. Низкие дозы облучения 2 кГр могут способствовать увеличению продукции ЛК некоторых штаммов. Это говорит о том, что только у некоторых конидий гриба в аналогичных условиях облучения, может проявляться радиорезистентность. Летальная доза как у природного штамма, так и мутантных штаммов наблюдалось при 15 кГр. Выявлено, что при культивировании мутантного штамма Aspergillus niger 8/67/2 в динамике роста максимальный биосинтез ЛК наблюдался в стационарной фазе роста и отмечался нестабильностью, максимальный биосинтез ЛК составил 56 г/л. Тогда как у мутантного штамма полученного после комбинированного действия УФ в течение 14 минут и двукратным у-облучением в дозе 2 кГр биосинтез ЛК наблюдался с начала экспоненциальной фазы роста культуры и стабильно продолжался в стационарной фазе роста до 168 часов культивирования. Однако, содержание ЛК в динамике роста мутантного штамма 8/67/2Г не превышало 26 г/л.
Ключевые слова: мутагенез, гамма-облучение, лимонная кислота Aspergillus niger, выживаемость.
Abstract. It has been shown that the degree of radiosensitivity of both the natural strain and mutant strains of citric acid (CA) producers is directly dependent on the number of conidia in the inoculum and the irradiation dose. Low radiation doses of 2 kGy may increase CA production in some strains. This suggests that only some conidia of the fungus under similar irradiation conditions may exhibit radioresistance. The lethal dose for both the natural and the mutant strains was observed at 15 kGy. It was revealed that when the mutant strain Aspergillus niger 8/67/2 was cultivated in growth dynamics, the maximum biosynthesis of CA was observed in the stationary phase of growth and was marked by instability yielding 56 g/l. Whereas in the mutant strain obtained after combined exposure to UVfor 14 minutes and double y-irradiation at a dose of 2 kGy, CA biosynthesis was observed at the beginning of the exponential phase of culture growth and stably continued up to 168 hours of cultivation. However, the CA content in the growth dynamics of the mutant strain 8/67/2G did not exceed 26 g/l.
Keywords: mutagenesis, gamma irradiation, Aspergillus niger, citric acid, survival.
В настоящее время лимонная кислота (ЛК) и её соли широко используется в пищевой, косметической, фармацевтической, биомедицине (нанолекарства, тканевая инженерия), в сельском хозяйстве и других областях [1-5].
В 2017 году мировое производство ЛК составляло 2 млн.т [6] и наблюдается постоянное увеличение уровня производство ЛК во всем мире. Только пищевая промышленность потребляет около 70% от общего объема производимой ЛК в мире, тогда как оставшиеся 30% используют другие отрасли промышленности [7, 8]. ЛК в настоящее время преимущественно производится в Китае, на долю которого приходится примерно 60% мирового производства [9]. Во всем мире ЛК признана как общепризнанное безопасное вещество "GRAS" (generally recognized as safe) и одобрено объединенным экспертом ФАО/ВОЗ Комитетом по пищевым добавкам. Представители рода Aspergillus, в частности, A.niger, A.oryzae, A.flavus, и A.terreus являются наиболее важными для коммерческого использования, так как они способны в больших количествах продуцировать широкий спектр низкомолекулярных органических кислот, в том числе ЛК [10-12]. Следует отметить, что Запасы ЛК ограничены, и потребность может быть удовлетворена только за счет биотехнологических процессов ферментации [13]. Улучшение штамма-продуцента микробов открывает широкие возможности для снижения себестоимости продукции без значительных капитальных затрат [14]. Методы мутагенеза с применением ультрафиолетового облучения, у-облучение или индуцированного N-метил-N-нитро-К-нитрозогуанидином (НГ), могут способствовать повышению выхода различных вторичных метаболитов A. niger [15, 16].
Реакции грибов на у-облучение изучали в отдельных культурах и инактивация жизнеспособности Alternaría alternata, Aspergillus flavus наблюдалось в диапазонах 1,0-2,0 кГр, для Trichoderma viride, Curvularia geniculata составило 0,5-1,0 кГр. Полное ингибирование роста и развитие их наблюдалось при <2,5 кГр [17]. Авторами Tiryaki и Maden показано, что низкие дозы облучения 1 кГр стимулировали развитие мицелиальных грибов Penicillium expansum как in vitro, так и in vivo на плодах груш сорта Анкары [18]. Также, Neweigy, N.A. и др. было обнаружено, что один мутант (A. niger F1), полученный при обработке 175 крад у-облучение, и другой мутант (A. niger F6), полученный в результате обработки 100 тыс. рад у-облучение увеличивали продукцию ЛК по сравнению с исходными штаммами [19]. Воздействие у-облучения на рост микроорганизмов показало, что дозы облучения выше 10,0 кГр полностью убивают Cryptococcus laurentii. Однако, высокая доза облучения 25,0 кГр не проявляла ингибирующего действия на рост дрожжей Candida sake [20]. Tauxe R.V. сообщил, что лучи высокой энергии облучения напрямую повреждают ДНК живых организмов, вызывая перекрёстное и другие изменения, которые делают организм неспособным расти или воспроизводиться. Когда эти лучи взаимодействуют с молекулами воды в организме, они генерируют временные свободные Taux - радикалы, которые могут вызвать дополнительное косвенное повреждение ДНК [21]. Также сообщалось, что многоклеточные споры или двухклеточные споры более устойчивы к у-облучению, чем одноклеточные споры. Это может быть одной из причин того, что одноклеточная спора штамма Cryptococcus laurentii показала большую чувствительность к у-облучению, чем многоклеточная спора штамма Candida. [22, 23]. Повреждение ядерной ДНК может вызвать мутагенез, и некоторые генетические материалы патогенов, вероятно, мутируют, приобретая более высокую или низкую вирулентность [24, 25]. Анализ литературных данных показывает, что реакция мицелиальных грибов на у-облучение различны, и на степень
радиочувствительности микроорганизмов влияет множество факторов. Мицелиальный гриб Aspergillus niger является наиболее часто используемым микроорганизмом для производства лимонной кислоты. Известно, что высокая продукция лимонной кислоты в значительной степени зависит от используемого штамма. В настоящем исследовании были поставлены задачи повышения эффективности местного штамма A. niger для производства ЛК путем случайного мутагенеза с использованием у-облучения.
В связи с этим, целью настоящего исследования являлось исследование влияния у -облучения в дозах 2; 3; 4; 5; 10; 15; 20 кГр на выживаемость мутантных штаммов -продуцентов ЛК и определение оптимальной дозы у-облучения влияющей на биосинтез ЛК продуцентами.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили мутантные штаммы мицелиального гриба полученные из местного природного штамма Aspergillus niger - 8. Мутантный штамм A.niger 8/19/6 был получен после УФ воздействия в течение 14 минут, мутантный штамм A.niger 8/67/2 был получен после комбинированного действия УФ воздействия в течение 14 минут и у-облучения в дозе 2 кГр, мутантный штамм A.niger 8/67/2Г получен после комбинированного действия УФ воздействия в течение 14 минут, у-облучения в дозе 2 кГр и повторного воздействия у-облучения в дозе 2 кГр.
Культуры выращивали на жидкой и плотной модифицированной среде Чапека -Докса (ЧМ) следующего состава (г/л): NH4NO3 - 2,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4*7№O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4*7H2O - 0,01; сахарозу - 100,0; агар - 15,0; вода, дистиллированная 1000 мл, микроэлементы по Бурхолдеру (мг/л): KJ - 0.1, B - 0.01, Mn2+ - 0.01, Zn2+ - 0.03, Cu2+ - 0.01, Mo2+ - 0.01, однако Fe2+ входившее в состав микроэлементов по Бурхолдеру было исключено, так как оно содержалось в основной среде. Конидии гриба, выращенного на плотной питательной среде, смывали физиологическим раствором через 7 суток культивирования при 30 оС. Подсчет конидий проводили как на камере Горяева, так и методом серийных десятикратных разведений для установления определенного количества инокулята [26]. Полученную суспензию конидий мицелия в количестве 6,0х105 конидий/мл разливали по 4 мл в стерильные флаконы объёмом 20 мл в трех повторностях (на каждую дозу) и подвергали облучению. Облучение микробного материала проводили в Институте ядерной физики АН РУз с использованием установки для облучения с изотопом 60Co. На суспензии конидий гриба воздействовали различными дозами у - облучения с мощностью экспозиционной дозы 0,05 Гр/с и междозовым интервалом 20, 15, 10, 5, 4, 3 и 2 кГр. Степень инактивации у - облученных конидий гриба определяли высевом их на жидкую и плотную питательные среды ЧМ с добавлением 1 г/л пептона, учет наличия или отсутствия роста и его интенсивность вели в течение 7 суток. Для определения кислотообразования, выросшие колонии мицелия высевали уколом на селективную твердую среду с CaCO3 [27]. Инкубацию природного штамма проводили в течение 3 суток, для штаммов после облучения (мутантных штаммов) в течение 6 суток в термостате при 28оС. Количественное содержание ЛК определяли химическим способом по методу Жаболовской Н.А. с соавторами [28]. Метод основан на окислении ЛК перманганатом в ацетон дикарбоновую кислоту, которая при бромировании превращается в пентабромацетон. Количество пентабромацетона оценивали спектрофотометрически. В процессе проведения определений использовались реактивы в следующих количествах: в мерную пробирку с
притертой пробкой вносили 1,0 мл исследуемого раствора. Затем добавляли 0,5 мл 40 % - го раствора H2SO4 и 0,25 мл 30% раствор КВг. После интенсивного перемешивания к смеси добавляли 1,0 мл 5% раствор КМпО 4 и оставляли на 10 мин, периодически перемешивая. После окончания реакции вносили 5,0 мл насыщенного раствора соли Мора (FeSO4-(NH4)2SO4-6H2O) для удаления избытка двуокиси марганца и брома, а затем 5,0 мл перегнанного хлороформа. Содержимое пробирки энергично встряхивали в течение одной минуты, при этом пентабромацетон экстрагировался хлороформом. Верхний водный слой после расслоения отбрасывали, нижний слой использовали для измерения экстинкции пентабромацетона при длине волны 300 нм на спектрофотометре UV-5100 (METASH, China). Количество ЛК в анализируемой пробе определяли по соответствующей калибровочной кривой. Определение содержания ЛК, биомассы, а также значения рН среды в динамике роста наблюдали в течение 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 часа культивирования.
Результаты исследования
В результате проведенных исследований показано, что радиочувствительность мутантных штаммов A.niger 8/19/6, A.niger 8/67/2, A.niger 8/67/2Г к у-облучению находится в прямой зависимости от исходного количества конидий. Зависимость радиочувствительности мутантного штамма 8/19/6 от дозы облучения и от плотности численности конидий представлено в таблице 1.
Представленные данные показывают, что у штамма 8/19/6 при исходном количестве конидий 1,5х105 в дозе облучения 5 кГр наблюдается полное ингибирование роста и развития. Однако, с увеличением количества конидий до 5,5х105 в аналогичных условиях облучения гибель штаммов не наблюдается, выживаемость составляет 0,01%. Ранее отмечалось что, при облучении 5 кГр у природного штамма 8 выживаемость составила 0,0004%, тогда как у мутантного штамма 8/19/6 было 25 раз выше и составляло 0,01% [29]. Летальная доза как у природного штамма 8, так и мутантного штамма 8/19/6 наблюдалось выше 10 кГр. После проведения у-облучения каждую выросшую колонию высевали на селективную твердую среду для предварительной оценки кислотообразования. Всего после воздействия у-облучением было выделено 2010 колоний мутантных изолятов. В таблице 2 представлена сравнительная характеристика размеров зон растворения CaCO3 вокруг колонии мутантным штаммом A.niger 8/19/6 и полученными мутантными вариантами. Показано, что после воздействия у-облучением в дозе 2 кГр только у одного штамма под номером 8/67/2 зона растворения CaCO3 вокруг колонии значительно превышала (1,75 раз) по сравнению с исходным штаммом 8/19/6, и составило 21 мм (Рис. 1 А и Б).
Следует отметить, что данный мутантный штамм 8/67/2 (получен из мутантного штамма A. niger 8/19/6) был выделен при использовании конидий гриба в количестве 5,5х105. Однако, у мутантных изолятов выделенных после воздействия у-облучением в дозе 3, 4, 5 и 10 кГр размеры зоны растворения CaCO3 вокруг колоний была ниже по сравнению с исходным штаммом. Обращает внимание тот факт, что низкие дозы облучения 2 кГр способствовали увеличению кислотообразования у некоторых выделенных изолятов.
Обнаружено, что у штаммов 8/67/2 при исходном количестве конидий 1,0х105 в дозе облучения 10 кГр наблюдается полное ингибирование роста и развития культур. С увеличением количество конидий до 3,0х105 в аналогичных условиях облучения не наблюдается гибель мицелия и выживаемость составляет 0,001%. Летальная доза как у
мутантного штамма 8/19/6, так и мутантного штамма 8/67/2 наблюдалось при 15 кГр (Таблица 3).
Таблица 1
Зависимость выживаемости мутантного штамма А. niger 8/19/6 от различной дозы у-облучения и количества конидий в инокуляте
Доза Исходное количество Численность конидий Выживаемость, %
облучения клеток/мл после облучения,
(кГр) КОЕ/мл
2 1,5 х 105 5 0,003
5,5 х 105 330 0,06
3 1,5 х 105 2 0,001
5,5 х 105 275 0,05
4 1,5 х 105 2 0,001
5,5 х 105 55 0,01
5 1,5 х 105 0 0
5,5 х 105 55 0,01
10 1,5 х 105 0 0
5,5 х 105 6 0,001
15 1,5 х 105 0 0
5,5 х 105 0 0
20 1,5 х 105 0 0
5,5 х 105 0 0
Известно, что у-облучение вызывает разрушение и, в конечном счете, летальный исход микроорганизмов происходит по двум механизмам действия: сначала прямым действием образование свободных радикалов за счет энергии ионизации, а во-вторых, вызывая прямое нарушение последовательность нити ДНК, которая приводит к повреждению нуклеотидной последовательности или их участков [30]. О полном ингибировании роста грибов также сообщили Smith и Pillai [31], которые обнаружили, что у-облучение разрушает структуру ДНК клеток, и клетки не могут продолжать свою функцию, в то время как неполное ингибирование может быть результатом незначительного повреждения клеток. После проведения у-облучения каждую выросшую колонию высевали на селективную твердую среду для предварительной оценки кислотообразования. Всего после воздействия у-облучением было выделено 2352 колоний мутантных вариантов. В таблице 4 представлена сравнительная характеристика размеры зоны растворения CaCO3 вокруг колонии мутантным штаммом A. niger 8/67/2 и полученными мутантными вариантами.
Таблица 2
Кислотообразующая способность мутантного штамма A.niger 8/19/6 и мутантных изолятов полученных от штамма 8/19/6 на твердой среде.
Доза у-облучения, кГр Количество мутантных изолятов после у-облучения Диаметр зоны растворения CaCO3, мм
0 Контроль, мутантный штамм A. niger 8/19/6 12
2 15 0 - 18
990 0 - 21
3 6 0 - 5
825 0 - 10
4 6 0 - 2
165 0 - 4
5 0 0
165 0 - 2
10 0 0
3 0
15 0 0
0 0
20 0 0
0 0
А Б В
Рис. 1. Кислотообразующая способность мутантных штаммов на твердой среде содержащей СаСОз. А - Л^вт 8/19/6, Б - Л^вт 8/67/2, В - Л^вт 8/67/2Г.
Показано, что после воздействия у-облучением в дозе 2 кГр только у одного штамма под номерами 8/67/2Г зона растворения СаСОз вокруг колонии было аналогично с исходным штаммом 8/67/2 и составило 21 мм (Рис. 1 В). Следует отметить, что данный мутантный штамм (получен из мутантного штамма Л. nigвт 8/67/2) был выделен при использовании конидий гриба в количестве 3,0х105.
Таблица 3
Зависимость выживаемости мутантного штамма А. niger 8/67/2 от различной дозы у-облучения и количества конидий в инокуляте
Доза облучения Исходное Численность конидий Выживаемость, %
(кГр) количество клеток, мл после облучения, КОЕ/мл
2 1,0 х 105 6 0,006
3,0 х 105 270 0,09
3 1,0 х 105 5 0,005
3,0 х 105 240 0,08
4 1,0 х 105 10 0,01
3,0 х 105 210 0,07
5 1,0 х 105 10 0,01
3,0 х 105 30 0,01
10 1,0 х 105 0 0
3,0 х 105 3 0,001
15 1,0 х 105 0 0
3,0 х 105 0 0
20 1,0 х 105 0 0
3,0 х 105 0 0
Обнаружено, что у мутантных изолятов выделенных после воздействия у -облучением в дозе 3, 4, 5 и 10 кГр размеры зоны растворения СаСОз вокруг колоний была ниже по сравнению с исходным штаммом. Следует отметить, что колонии мутантного штамма А. niger 8/19/6, А. niger 8/67/2 и А. niger 8/67/2Г в отличии от природного штамма имели белую окраску и в процессе роста колонии на твердой питательной среде в течение 20 дней не меняли свою окраску.
Выявлено, что мутантные штаммы А. niger 8/19/6, А. niger 8/67/2 и А. niger 8/67/2Г в отличие от природного штамма 8 не теряли свою жизнеспособность при температуре 40оС, а также был обнаружен рост в минеральной среде с содержанием сахарозы 100, 150 и 200 г/л без предварительной адаптации.
По данным Конюхова Г.В. и др. устойчивость к радиационному облучению, или радиорезистентность, микроорганизмов формируется благодаря возможности клетки регенерировать полученные радиационные повреждения [32]. Полученные данные подтверждают, что радиорезистентность проявляется, благодаря возможности конидий регенерировать полученные радиационные повреждения.
С целью идентификации кислот, а также для проверки результатов, полученных методом селекции на твердой питательной среде, проводили культивирование отобранных мутантных штаммов в жидкой среде ЖС-2. Сравнительный анализ динамике роста мутантного штамма A.niger 8/67/2 и A.niger 8/67/2Г показал, что максимальный биосинтез ЛК у штамма 8/67/2 наблюдался в стационарной фазе роста (на 96 часы культивирования) и отмечался нестабильностью, биосинтез ЛК составил 56 г/л (Рис. 2 А). Однако, у полученного мутантного штамма, который был получен после комбинированного действия УФ в течение 14 минут, у-облучением в дозе 2 кГр и повторным воздействием у-облучения в дозе 2 кГр, биосинтез ЛК наблюдался с начала экспоненциальной фазы роста штамма и стабильно продолжался в течение стационарной фазы роста до 168 часов культивирования (Рис. 2 Б). Однако, содержания ЛК не превышал 26 г/л.
Таблица 4
Кислотообразующая способность мутантного штамма А. niger 8/67/2 и мутантных изолятов, полученных от штамма 8/67/2 на твердой питательной среде.
Доза у-облучения, кГр Количество мутантных изолятов после у-облучения Диаметр зоны растворения CaCO3, мм
0 Контроль, мутантный штамм A. Niger 8/67/2 21
2 18 0 - 15
810 0 - 21
3 15 0 - 5
720 0 - 13
4 30 0 - 2
630 0 - 2
5 30 0
90 0 - 2
10 0 0
9 0
15 0 0
0 0
20 0 0
А Б
Рис. 2. Биосинтез ЛК в динамике роста мутантных штаммов: 8/67/2 (А) и 8/67/2Г (Б) (ряд 1 - ЛК; ряд 2 - рН; ряд 3 - биомасса).
Показано, что биомасса мутантного штамма 8/67/2 в динамике роста в течение 120 часов культивирования составило 10,2 г/л. Тогда как, для штаммов, полученных в процессе вторичного мутагенеза в динамике роста в течение 120 часов, достигало до 13,6 г/л. Исследования показало, что в динамике роста культивирования при исходном значение рН 5,5 у мутантных штаммов наблюдалось снижение рН среды.
Таким образом, обнаружено, что степень радиочувствительности как природного штамма, так и мутантных штаммов продуцентов лимонной кислоты, находится в прямой зависимости от количества конидий в инокуляте и дозы облучения. Низкие дозы облучения 2 кГр могут способствовать увеличению продукции кислотообразования некоторых штаммов. Это говорит о том, что только у некоторых конидий гриба в аналогичных условиях облучения, может проявляться радиорезистентность. Летальная доза как у природного штамма, так и мутантных штаммов наблюдалось при 15 кГр.
Выявлено, что при культивировании мутантного штамма 8/67/2 в динамике роста максимальный биосинтез ЛК наблюдался в стационарной фазе роста и отмечался нестабильностью, при этом биосинтез ЛК составил 56 г/л. Тогда как у мутантного штамма полученного после комбинированного действия УФ в течение 14 минут и двукратным у-облучением в дозе 2 кГр биосинтез ЛК наблюдался с начала экспоненциальной фазы роста культуры и стабильно продолжался в стационарной фазе роста до 168 часов культивирования. Однако, содержание ЛК в динамике роста мутантного штамма A.niger 8/67/2Г не превышало 26 г/л.
REFERENCES
1. Soccol, C.R., Vandenberghe, L.P., Rodrigues, C., & Pandey, A. (2006). New perspectives for citric acid production and application. Food Technology and Biotechnology, 44, 141-149.
2. Ashkan, T. N., Adeli, M., & Vossoughi, M. (2010). Synthesis of gold nanoparticle necklaces using linear-dendritic copolymers. European Polymer Journal, 48(2), 165-170. www.elsevier. com/locate/europolj
0
0
3. Guillermo A., Jian Y., Ryan H. (2010). New biodegradable biocompatible citric acid nano polymers for cell culture growth and implantation engineered by Northwestern University Scientists. Nano patents and innovations, US Patent Application 20090325859.
4. Yang J., Webb A. R., Ameer G. A. (2004). Novel citric acid-based biodegradable elastomers for tissue engineering. Advanced Materials. 16(6),511—516. D0I:10.1002/adma.200306264
5. Шишканова Н.В. Получение мутантов дрожжей Candida lipolytica 704 (1979) Прикладная биохимия и микробиология. 15( 4), С. 555-559.
6. Cavallo, E., Charreau, H., Cerrutti, P., & Foresti, M. L. (2017). Yarrowia lipolytica: a model yeast for citric acid production. FEMS yeast research, 17(8), 10.1093/femsyr/fox084. https://doi.org/10.1093/femsyr/fox084
7. Yokoya, F., Fermentaçâo cítrica, (1992). Campinas - SP: Fundaçâo Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosello. 1(79).
8. Pandey A., Soccol C.R., Rodriguez-Leon J.A., Nigam, S. (2001) Production of organic acids by solid-state fermentation. In: Solid-state fermentation in biotechnology: fundamentals and applications. Asiatech Publishers, New Delhi, p. 113-126.
9. Show P L, Oladele K O, Siew Q Y, Aziz Zakry FA, LAN JC-W, Ling TC. (2015). Overview of citric acid production from Aspergillus niger. Frontiers in Life Science, 8(3), 271-283, http://dx.doi.org/10.1080/21553769.2015.1033653
10. Scazzocchio C. Aspergillus: A. multifaceted Genus: Encyclopedia of Microbiology. 2009 -Boston: Academic Press Inc. -. - P. 401- 421. D0I:10.1016/B978-012373944-5.00337-0
11. Plassard C., Fransson P. (2009). Regulation of low molecular weight organic acid production in fungi. Fungal Biol. Rev. Elsevier Ltd. 23 (1,2). 30-39. httpsy/doi.org/10.1016/j.fbr.2009.08.002
12. Aboud-Zeid, A., Ashy, M. A. (1984). Production of citric acid: A review. Agric. wastes, 9, 51-76. https//doi.org/10.1016/0141-4607(84)90075-1.
13. Anastassiadis, S., A. Aivasidis and C. Wandrey (2002). Citric acid production by Candida strains under intracellular nitrogen limitation. Appl. Microbiol. Biotechnol. (60) 81-87.
14. Stanbury, P., A. Whitaker and S. Hall (1995). Fermentation economics. In: Principles of Fermentation Technology, second ed. Pergamon Press, Oxford. UK, pp.331-341. J. Agric. Sci. Mansoura Univ., 34 (5), May 2009.
15. Gupta, S. and C.B. Sharma (1995). Citric acid fermentation by mutant strain Aspergillus niger resistant to manganese ions inhibition. Biotechnol. Lett., 17, 269-274.
16. Ikram-Ul, H.; S. Ali, M.A. Qadeer and J. Iqbal (2004). Citric acid production by selected mutants of Aspergillus niger from cane molasses. Biores. Technol., 93:125-130. doi: 10.1016/j.biortech.2003.10.018.
17. Maity, J.P., Kar, S., Banerjee, S., Sudershan, M., Chakraborty, A., Subhas C. Santra, S.C. (2011). Effects of gamma radiation on fungi infected rice (in vitro). Environmental Science, University of Kalyani, Nadia, 87(11). 2011. 1097-1102. doi:10.3109/09553002.2011.606288.
18. Tiryaki, O., Maden, S. Penicillium expansum, Botrytis cinerea ve Rhizopus nigricans ile Enfekteli Ankara Armutlarinda Gamma Radyasyonunu ile Standart Depolama Koçullannda Çûrûmenin Engellenmesi. VI. T. Fitopatoloji Kongresi. Ekim, Izmir. - 1991. - С. 7-11.
19. Neweigy, N. A.; H.E. Abou-Aly and Jihan A. Shaaban. (2009) Mutation of aspergillus niger with gamma radiation for improving citric acid production. (Botany Dept., Fac. of Agric., Benha Univ., Egypt) J. Agric. Sci. Mansoura Univ., 34 (5 ): 4301 - 4313.
20. M.S. Shathele. Effects of Gamma Irradiation on Fungal Growth and Associated Pathogens/ Research Journal of Environmental Toxicology. - 2009. 3: - С. 94-100. DOI: 10.3923/rjet.2009.94.100.
21. Tauxe, R.V., 2001. Food safety and irradiation: Protection the public from food borne infections. Emerg. Infect. Dis., 7: 516 - 521.
22. Sommer, N.F., E.C. Maxie and R.J. Fortlage, 1964. Quantitative dose response of prunes fruit decay to gamma irradiation. Radiat. Bot., 4: 309-316.
23. Satish, K.P., G. Benjamin, K.P. Sergei, K.W. Joseph, C.S. Matt, DR. Douglas and DM. Smith, 2005. Semen-specific genetic characteristics of human immunodeficiency virus type 1 env. J. Virol., 79: 1734-1742.
24. Kolattukudy, P.E., 1985. Enzymatic penetration of the plant cuticle by fungal pathogens. Annu. Rev. Phytopathol., 23: 233-250.
25. Salmond, G.P.C., 1994. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annu. Rev. Phytophato., 32: 181-200.
26. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М.: МГУ. - 1995. - С.119.
27. Патент № IAP 07072. Пулатова О.М., Алимова Б.Х., Махсумханов А.А., Ташбаев Ш.А., Камбаралиева М.И., Холмурадова Н.К. Экспресс-способ для первичного отбора кислотообразующих мицелиальных грибов./ Заявитель и патентообладатель Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, UZ. Патентная заявка № IAP 20190069; дата подачи 21.02.2019, дата получения 22.08.2022. Расмий ахборотнома №9 30.09.2002.98. https://my. ima. uz/cert-v1/default/che ck-
patent?check id=635c9758e879ef62b0b07cf92e556645.
28. Жаболовская Н.А., Агеев Л.М., Петрова Л.Ф. (1968) Сравнительная оценка методов количественного определения лимонной кислоты // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 5. 22-24.
29. Холмурадова Н.К., Пулатова О.М., Алимова Б.Х., Махсумханов А.А., Давранов К.Д., Исматов Н.Б., Садиков И.И. (2022) Влияние гамма-облучения на выживаемость и количество инокулята Aspergillus niger Universum: химия и биология: электрон. научн. журн. 11(101). URL: https://7universum.com/ru/nature/archive/item/14486
30. Abdel-Kadar A. (1986) Potential applications of ionizing radiations in postharvest handling of fresh fruits and vegetables. / Food Technology. 40(6). 117-121.
31. Smith, J.C. and S. Pillai. (2004). Irradiation and food safety / Food Technol. 58: 48-54.
32. Конюхов, Г.В. Низамов Р.Н., Тарасова Р.Н., Вагин К.Н., Гайзатуллин Р.Р. (2011). Биотехнология и ее значение в создании радиозащитных препаратов / Г.В. Конюхов, Р.Н. Низамов, Н.Б. Тарасова, К.Н. Вагин, Р.Р. Гайзатуллин // Ветеринарный врач. 6. 24-28.
