CC BY
42
ОБМЕН ОПЫТОМ
DOI: 10.15690/onco.v2.i3.1399
Н.М. Ростовцев1, А.Н. Котляров2, В.Г. Поляков3, В.С. Носов1
1 Областная детская клиническая больница, Челябинск, Российская Федерация 2 Южно-Уральский государственный медицинский университет, Челябинск, Российская Федерация 3 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Минздрава России,
Москва, Российская Федерация
Влияние фотодинамической терапии и лазерного излучения на васкуляризацию и ангиогенную активность экспериментальной карциномы Эрлиха
212
Цель. Изучение влияния различных режимов лазерного излучения и фотодинамической терапии на сосудистое русло и активность ангиогенеза карциномы Эрлиха в эксперименте. Материалы и методы. Исследование изменений сосудистого русла в экспериментальной карциноме Эрлиха при фотодинамической терапии в комбинации с лазерным излучением проведено на 144 белых беспородных мышах линий CBA, C57BI, C3HA, гибридах F (CBA* C57BI) с перевитой в подкожную клетчатку спины асцитической карциномой Эрлиха. В зависимости от дозы лазерного излучения животные разделены на 4 группы и группу контроля. Результаты. Величина плотности лазерного излучения определяла степень деструкции тканей. Стереотипные необратимые расстройства кровообращения во всех группах сопровождались уменьшением васкуляризации и экспрессии ростового фактора ангиогенеза в ткани опухоли. Заключение. Значительное уменьшение объема и площади ткани опухоли получено при сочетанном применении фотодинамической терапии и лазерного излучения в дозе 400 Дж/см2. Ключевые слова: экспериментальная саркома Эрлиха, фотодинамическая терапия, лазер, ангиогенез опухоли, сосудистый эндотелиальный фактор роста.
(Для цитирования: Ростовцев Н.М., Котляров А.Н., Поляков В.Г., Носов В.С. Влияние фотодинамической терапии и лазерного излучения на васкуляризацию и ангиогенную активность экспериментальной карциномы Эрлиха. Онкопедиатрия. 2015; 2 (3): 212-215. Doi: 10.15690/onco.v2.i3.1399)
N.M. Rostovtsev1, A.N. Kotlyarov2, V.G. Polyakov3, V.S. Nosov1
1 Regional Children's Hospital, Chelyabinsk, Russian Federation 2 South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation 3 Russian Cancer Research Center named NN Blokhin, Moscow, Russian Federation
The Influence of Photodynamic Therapy and Laser Radiation on the Vascularization and Angiogenic Activity of Expermental Ehrlich Carcinoma
Оbjective. The impact of different modes of laser radiation and photodynamic therapy on vascular bed and the activity of angiogenesis Ehrlich carcinoma in the experiment. Materials and methods. After the subcutaneous Ehrlich ascites carcinoma cells inoculation 144 albino mice lines CBA, С57BI, C3HA, hybrids F(CBA* C57BI) were studied to detect the changes of the vascular bed in experimental Ehrlich carcinoma under the photodynamic therapy in combination with laser radiation. Depending on the dose of laser radiation, the animals were divided into 4 experimental groups and the control group. Results. The value of laser fluence was determined by the degree of destruction of tissue. Stereotypical irreversible circulatory disorders in all groups were accompanied by a decrease in vascularization and expression of angiogenic growth factor in the tumor tissue. Conclusion. A significant decrease in the volume and area of the tumor tissue was achieved by combined application of photodynamic therapy and laser radiation in a dose of 400 j/cm.
Key words: experimental Ehrlich sarcoma, photodynamic therapy, laser, tumor angiogenesis, vascular endothelial growth factor.
(For citation: Rostovtsev N.M., Kotlyarov A.N., Polyakov V.G., Nosov V.S. The Influence of Photodynamic Therapy and Laser Radiation on the Vascularization and Angiogenic Activity of Experimental Ehrlich Carcinoma. Onkopediatria. 2015; 2 (3): 212-215. Doi: 10.15690/onco.v2.i3.1399)
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 3
ВВЕДЕНИЕ
Современная концепция лечения злокачественных опухолей, особенно с распространенным процессом, основана на комплексном подходе, включающем пред- и послеоперационную химиотерапию, хирургическое вмешательство и лучевое воздействие [1]. Однако результаты лечения больных с распространенным процессом порой малоутешительны. Это связано, с одной стороны, с недостаточной эффективностью традиционных методов лечения, с другой — большинство случаев заболевания обнаруживаются на поздней стадии [2].
В связи с этим приоритетным направлением развития науки в настоящее время является разработка и внедрение высокотехнологичных методов лечения, основанных на использовании последних достижений медицинских технологий. Одними из перспективных методов, которые пока не нашли широкого применения в детской онкологии, но уже показали перспективность данного направления, являются фотодинамическая терапия (ФДТ) и лазерное излучение [3].
Основной фактор прогрессии опухоли — ее способность к ангиогенезу, который регулируется различными проангиогенными и антиангиогенными факторами [4]. Известно, что существуют три механизма деструкции опухоли в процессе фотодинамической терапии: прямое цитотоксичное действие на опухолевые клетки, расстройства кровообращения в неопластической ткани и активация местного противоопухолевого иммунитета [5-7]. Как и при ФДТ, при лазерном облучении опухоли цитотоксическими факторами являются нагрев биоткани поглощенным в ней излучением. Поскольку способ облучения опухоли при этих методах одинаков, а механизм воздействия на ткань различен, весьма перспективным представляется сочетанное использование ФДТ и лазероиндуцированная термотерапия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Условия проведения
Эксперименты выполнены на белых беспородных линий CBA, C57BI, C3HA, гибридах F (CBA* C57BI) мышах с перевитой в подкожную клетчатку спины асцитической карциномой Эрлиха.
Животные были разделены на 5 групп:
1) интактная (контроль);
2) I группа: опухоль подвергалась ФДТ с плотностью энергии 100 Дж/см2;
3) II группа: ФДТ в дозе 200 Дж/см2;
4) III группа: ФДТ в дозе 400 Дж/см2;
5) IV группа: производилась резекция половины
объема опухоли с интраоперационной ФДТ в
дозе 400 Дж/см2.
Эвтаназию мышей опытных групп осуществляли дислокацией шейных позвонков на 7, 14, 21-е сут после ФДТ, что соответствовало 14, 21, 28-м сут после перевивки опухоли.
Методы регистрации исходов
Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином. Сосудистое русло опухоли выявляли маркером к CD34 эндотелиальных клеток (DAKO, QBEnd-10, 1:50). На условной единице площади стереометрической методикой производили выделение фаз, их измерение и расчет, в изображениях гистологических препаратов определяли площадь сосудистого русла опухоли с применением лицензионной программы анализа изображения микрообъектов «ВидеоТест-Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия). Относительный объем сосудистого русла опухоли определяли методом точкосчета [8]. Для оценки ангиогенной активности опухоли исследовали уровень экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF; DAKO, VG, 1:40) — стимулятора ангиогенеза. Результаты иммуногистохимических реакций для VEGF оценивали с помощью полуколичественного метода. Интерпретация экспрессии VEGF: отрицательная — окрашивание отсутствует или окрашено < 10% клеток опухоли, слабая — 10-20% опухолевых клеток, умеренная — 20-50% клеток опухоли, интенсивная — > 50% клеток опухоли.
Статистический анализ
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью критерия Манна-Уитни с вычислением хи-квадрата и использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft Inc.). Различия между сравниваемыми группами считались статистически значимыми при уровне р < 0,05 [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Основные результаты исследования
При иммуноморфологическом исследовании в интактной опухоли на 7-е сут после трансплантации обнаружена развитая сеть капилляров (рис. 1).
Объем сосудистого русла в опухоли контрольной группы достигал максимальных значений на 14-е сут с момента трансплантации опухоли. Площадь васкуляризации снижалась с увеличением объема
Рис. 1. Развитое сосудистое русло в интактной карциноме Эрлиха на 7-е сут. Экспрессия CD34 в эндотелиальных клетках Примечание. Иммуногистохимический метод. Ув. 400.
213
ОБМЕН ОПЫТОМ
214
Таблица. Относительный объем и площадь сосудистого русла в опытных группах
Сутки после лечения
Группы 7 14 21
Относительный объем сосудов, % Площадь сосудов, мкм2 Относительный объем сосудов, % Площадь сосудов, мкм2 Относительный объем сосудов, % Площадь сосудов, мкм2
I II III IV 12,2±0,87° 10,2±0,77° 0,6±0,13°12 0,3±0,09°123 8674,9± 1439,06 8251,0±1892,75 456,5±70,54°12 154,6±116,58°123 13,4±0,84 10,3±0,8о1 0,7±0,14°12 8951,9±1015,5 8430,8±1269,5 538,3±67,99°12 12,5±0,77 9,3±0,76°1 0,7±0,13°12 8793,4±1390,31 7842,0±932,0 376,2±75,44°12
Примечание. ° — р < 0,05 по сравнению с контрольной группой, 1 — р < 0,05 по сравнению с I группой, 2 — р < 0,05 по сравнению со II группой, 3 — р < 0,05 по сравнению с III группой.
опухоли по мере нарастания сроков эксперимента (р > 0,05).
После сеанса ФДТ в I группе относительный объем сосудистого русла опухоли уменьшался по сравнению с интактной карциномой только в течение первой недели воздействия. Более выраженные изменения выявлялись после ФДТ во II группе в виде участков паретически расширенных и запустевших сосудов. Вместе с тем показатели площади сосудов в I-II группе достоверных отличий с контрольной группой не имели. Это обусловлено преходящей вазоконстрикцией и освобождением сосудорасширяющих медиаторов [5]. Достоверное снижение площади васкуляризации, относительного объема сосудов отмечалось в группах III-IV при увеличении дозы ФДТ до 400 Дж/см2 (табл.).
При этом в сосудистом русле развивались стереотипные распространенные сосудистые расстройства в виде тромбозов, фибриноидного некроза и васкулитов, а также тромботические массы с облитерацией сосудов (рис. 2). На заключительном сроке эксперимента пролиферации эндотелия и новообразований сосудов в опухоли животных III группы не регистрировалось.
В IV группе на 14-е сут в зоне воздействия формировалась грануляционная ткань, которая на 21-е сут созревала в плотную волокнистую соединительную ткань.
В контрольной группе максимальная выраженность экспрессии VEGF обнаруживалась на 14-е сут с момента трансплантации опухоли. Экспрессировали VEGF преимущественно малодифференцированные клетки рыхлой соединительной ткани, расположенные группами.
В опухоли мышей I-II групп количество VEGF-позитивных клеток достоверно снижалось на 14-е и 21-е сут после ФДТ, но статистически значимых различий с контрольной группой не обнаружено.
Наиболее существенным снижение экспрессии VEGF было в III-IV группах — на 7-е сут регистрировалась только слабовыраженная реакция VEG в отличие от интактной, и I-II групп (р < 0,05). При этом экспрессия VEGF выявлялась в эндотелиальных клетках сосудов опухоли, в эпителии опухоли положительная иммуногистохимическая реакция отсутствовала (рис. 3).
Преобладание отрицательной реакции к VEGF в сохранившихся клетках опухоли в III группе было обнаружено на 14-е, 21-е сут после ФДТ (р < 0,05).
Таким образом, проведенное исследование регистрирует, что нарушение кровоснабжения в опухоли при ФДТ является одним из наиболее действенных эффектов ее фотодинамической деструкции [5, 6].
ВЫВОДЫ
1. Расстройства кровообращения в опухолевой ткани при ФДТ приводят как к последователь-
Рис. 2. Организация тромба в сосуде, в ткани опухоли — полнокровие и стазы после фотодинамической терапии в дозе 400 Дж/см2
Примечание. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
Рис. 3. Слабая экспрессия VEGF в эндотелии опухоли на 7-е сут после фотодинамической терапии в дозе 400 Дж/см2 Примечание. Иммуногистохимический метод. Ув. 400.
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 3
ным нарушениям реологии и скорости кровотока (тромбоз, васкулит, облитерация сосудов), так и к преходящим изменениям кровенаполнения (ангиоспазм) и парезу сосудов.
2. Выраженное снижение сосудистой перфузии опухоли: уменьшение объема и площади сосудистого русла обусловлено необратимыми нарушениями реологии крови при ФДТ в дозе 400 Дж/см2.
3. ФДТ сопровождается не только стереотипными нарушениями кровообращения, но подавляет экспрессию ростового фактора ангиогенеза в опухоли.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки / конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1. Котляров А.Н., Ростовцев Н.М., Ростовцев М.В. и соавт. Клинические проявления и оценка высокотехнологичных методов верификации нефробла-стомы у детей. Детская онкология. 2008/2009; 4-1: 37-40.
2. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T. et al. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy. Acta Biol Pol. 2005; 52 (2): 339-352
3. Ростовцев Н.М., Поляков В.Г., Котляров А.Н. Десятилетний опыт фотодинамической лазеротерапии (ФДТ) с радахлорином злокачественных опухолей у детей. II-я конференция детских онкологов Северо-Западного региона России. Современные проблемы и достижения детской онкологии. СПб. Сб. тез. 2014. С. 66-67.
4. Давиденко И.С., Пефти Е.Б., Фокин А.Н. Значение ангиогенеза в терапии метастатического рака
молочной железы. Российский биотерапевтический журнал. 2007; 4 (6): 8-12.
5. Кудинова Н.В., Березов Т.Т. Фотодинамическая терапия опухолей: иммунологический аспект лечения. Российский биотерапевтический журнал. 2010; 1 (9): 69-76.
6. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва: Практика. 1999. 459 с.
7. Juarranz A., Jaen P, Sanz-Rodriguez F. et al. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. din Transl Oncol. 2008; 10 (3): 148-154.
8. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Москва: Медицина. 1990. 383 с.
9. Mroz P, Hashmi J.T., Huang Y.Y. et al. Stimulation of anti-tumor immunity by photodynamic therapy. Expert Rev Clin Immunol. 2011; 7 (1): 75-91.
215
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Ростовцев Николай Михайлович, кандидат медицинских наук, заместитель главного врача ОДКБ г. Челябинска
Адрес: 454046, Челябинск, ул. Яблочкина, д. 21/56, e-mail: [email protected]
Котляров Александр Николаевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры детской хирургии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Адрес: 454092, Челябинск, ул. Воровского, д. 64, e-mail: [email protected]
Поляков Владимир Георгиевич, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23, e-mail: [email protected]
Носов Владимир Сергеевич, врач детский хирург ОДКБ г. Челябинска Адрес: 454077, Челябинск, ул. Ржевская, д. 29/83, e-mail: Nosov_vso mail.ru
