CC BY
45
2006
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОЮ УНИВЕРСИТЕТА_Сер. 3. Вып. 4
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
Е. Р. Тараховская, 10. И. Маслов
ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АССИМИЛЯЦИОННОГО АППАРАТА FUCUS VESICULOSUS L.
Проблема взаимодействия различных систем регуляции сложных физиолого-био-химических процессов, происходящих в растительных клетках, в настоящее время привлекает внимание многих исследователей [12,25,30]. Фотосинтез - один из самых сложных ассимиляционных процессов, и его эффективность согласованно регулируется многими экзо- и эндогенными факторами. Существенный вклад в обеспечение контроля ассимиляционного аппарата растений вносят метаболическая и гормональная системы регуляции. Система метаболического контроля, очевидно, эволюционно первична. Метаболизируемые органические субстраты, такие как сахара, спирты, жирные кислоты, органические кислоты, являются не только структурными компонентами клетки и источниками энергии. Эти вещества регулируют экспрессию генов, обеспечивающих важнейшие процессы метаболизма растений: дыхание, синтез и распад запасных питательных веществ, регуляцию клеточного цикла, ассимиляцию азота и, в первую очередь, фотосинтез [13, 16]. В подавляющем большинстве случаев экзогенные добавки органических субстратов в той или иной степени вызывают подавление деятельности фотосинтетических систем. Это явление получило название анаболической репрессии. Присутствие органических субстратов в среде культивирования микроводорослей приводит к подавлению формирования хлоропластов в клетках, падению содержания хлорофилла, хлорофилл-связывающих белков и ряда ферментов цикла Кальвина, таких как НАДФ-зависимая дегидрогеназа 3-фосфоглицеринового альдегида и др. [14, 20, 26]. В листьях высших растений добавка Сахаров также приводит к снижению содержания хлорофилла, содержания и активности рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско) и других фотосинтетических ферментов, интенсивности фотосинтеза [11, 21, 35].
Влияние трофических факторов на фотосинтетические процессы в настоящее время изучается большей частью на высших растениях. Исключениями являются только немногочисленные модельные объекты, такие как одноклеточные водоросли p. Chlamidomonas и Euglena. В то же время, представляется перспективным использование для подобных исследований представителей различных таксономических групп водорослей, включая макроводоросли, обладающие сложной тканевой структурой таллома, такие как Fucus vesiculosus.
Водоросли характеризуются большим разнообразием строения и функционирования ассимиляционных систем, в частности, фотосинтетического аппарата. F. vesiculosus -
© Е. Р. Тараховская, Ю. И. Маслов, 2006
широко распространенный представитель бурых водорослей (отд. Phaeophyta) имеет све-тособирающий комплекс, содержащий хлорофиллы «а» и «с», fi-каротин и ряд специфических ксантофиллов [10, 28]. Эта водоросль содержит Рубиско I «красного» типа [8, 34] и использует С02-концентрирующие механизмы [15] для повышения эффективности фотосинтеза. Основным продуктом фотосинтеза и субстратом дыхания фукуса является многоатомный спирт маннит. В качестве запасных питательных веществ накапливаются ламинарин, маннит и глицерин [9, 24].
Подобно подавляющему большинству водорослей F. vesiculosus является потенциально миксотрофным организмом, способным, по крайней мере, на ранних стадиях развития усваивать экзогенные органические субстраты. Добавление маннита или глицерина в среду культивирования эмбрионов фукуса приводит к существенному снижению содержания в клетках Рубиско и основных фотосинтетических пигментов [5]. Экзогенные фитогормоны также оказывают значительное влияние на ассимиляционный аппарат этой водоросли [5]. Цель настоящего исследования - изучить влияние фито-гормонов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и кинетина на состав и функционирование ассимиляционного аппарата 3-суточных эмбрионов F. vesiculosus в условиях анаболической репрессии.
В качестве объектов исследования использовали зиготы и 3-суточные эмбрионы фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.). Материал был собран в районе Морской биологической станции СПбГУ (Белое море) в августе-сентябре 2004-2005 гг. Получение гамет, оплодотворение и выращивание синхронной культуры эмбрионов осуществляли в основном по стандартной методике [4, 29].
Исследованы следующие характеристики ассимиляционного аппарата водоросли: содержание основных фотосинтетических пигментов (хлорофиллы «а», «с» и сумма каротиноидов), содержание Рубиско, интенсивность фотосинтеза и темнового дыхания, активность I и II Фотосистем (ФС). В ходе экспериментов в среду культивирования вносили: глицерин (0,5%), ИУК (10~5М) и кинетин (10~5М). Обработку производили следующим образом: сразу же после оплодотворения зиготы фукуса несколько раз промывали раствором соответствующего агента, затем заливали тем же раствором; в качестве контроля использовали зиготы и эмбрионы, развивающиеся в фильтрованной морской воде; снятие опытов производили через трое суток после внесения в среду соответствующих добавок.
Пигменты экстрагировали 90%-ным ацетоном: эмбрионы фукуса растирали в ацетоне со стеклянным песком (лабораторное стекло) с добавлением небольшого количества Na2S04 и NaHC03 [19]. Расчет количества хлорофилла «а», суммы хлорофиллов «Cj» + «с2» и суммы каротиноидов производили после спектрофотометрирования (СФ-26) по описанным в литературе формулам [17, 19].
Количество Рубиско определяли путем нативного электрофореза растворимых белков с последующей окраской гелей, сканированием и расчетом количества связанного с белком красителя [ 1,6]. В качестве градуировочного белка использовали гексокиназу (ICN Biomed.), которая наносилась на гели за 15-20 мин до конца электрофореза.
Интенсивность фотосинтеза, дыхания и работы ФС I и II определяли по выделению/поглощению кислорода с помощью кислородного электрода Кларка и полярографической установки. Все измерения проводили в камере объемом 13 мл при температуре 16 "С. Интенсивность фотосинтеза и дыхания и активность ФС II измеряли в суспензии интактных эмбрионов, средней плотностью 1-5 тыс./мл. Потенциальную
активность ФС II определяли с использованием в качестве акцептора электронов 1,4-п-бензохинона (БЫса) [7], активность ФС I - на препарате тилакоидных мембран по стандартной методике [1] с некоторыми модификациями.
Опыты проводились в 4-6 биологических повторностях. На рисунках представлены средние арифметические значения величин и доверительные интервалы для 95%-ной вероятности.
Полученные данные показывают, что глицерин вызывает значительное снижение содержания таких компонентов ассимиляционного аппарата эмбрионов Б. ъемсиктли, как фотосинтетические пигменты (рис. 1, А) и Рубиско (рис. 1, Б). Эти результаты полностью согласуются с литературными данными, описывающими влияние метаболизируе-мых органических субстратов на состав фотосинтетического аппарата высших расте-
10
ф то
Е £
S 0)
с Ю
s
с; о
6 -
4 -
2 -
К ГЦ ГЦ+ИУК ГЦ+КН
□ хлорофилл «a»; El хлорофилл «с»; И каротиноиды.
о
о <°
s S
« ®
£ ю
а> да
? 5
ТО Q.
X ¿7
û- 2
Ф "t
О г
О
0,1
0,08 -
0,06
0,04
0,02
ГЦ
ГЦ+ИУК
ГЦ+КН
Рис. 1. Влияние глицерина (0,5 %) в сочетании с фитогормонами (10_5М) на содержание основных фотосинтетических пигментов (Л) и содержание Рубиско (Б) в 3-суточных
эмбрионах Fucus vesiculosus L. К - контроль; ГЦ - глицерин; ИУК - индолил-3-уксусная кислота; КН - кинетин (то же для рис. 2).
ний и микроводорослей [11, 20-21, 35]. Содержание Рубиско в присутствии глицерина снижается почти на 50% (см. рис. 1, Б). Известно, что синтез малой субъединицы этого фермента, которая у высших растений и зеленых водорослей кодируется в ядерном геноме, контролируется метаболическими факторами. Однако для кодируемой в геноме хлоропластов большой субъединицы подобная зависимость не доказана [32]. У Рубиско «красного» типа, характерной для бурых водорослей, обе субъединицы кодируются в пластидном геноме. Существенное снижение количества фермента в эмбрионах фукуса при добавлении глицерина подтверждает, что экспрессия хлоропластных генов, обеспечивающих фотосинтетические процессы, также контролируется уровнем метаболитов.
Следствием снижения содержания компонентов фотосинтетического аппарата является уменьшение интенсивности фотосинтеза (рис. 2, А) и активности ФС (рис. 2, Б). Представляется интересным, что добавка в среду культивирования органического субстрата не приводит к усилению дыхания эмбрионов фукуса (рис. 2, А), подобно тому,
ск s
х Q)
3 о
Е о с
к s
X О)
с
ф <=г
-е-
о с о
с; х
¡2 2
XI
S
О х m s
0
1
О)
ь
I
s
2 1,5
1
0,5 0
-0,5 -1
35 -,
30 -
25 -
т
со 20 -
-е-
о а 15 -
о
10 -
5 -
0 -
-£
Пн,?.
Ш
¿Zr-
V? il
ГЦ ГЦ+ИУК
Б
гц+кн
ГЦ
ГЦ+ИУК
гц+кн
□ ФС I; О ФС
Рис. 2. Влияние глицерина (0,5 %) в сочетании с фитогормонами (10~5М) на интенсивность фотосинтеза и дыхания (А) и активность ФС I и II (Б) в 3-суточных эмбрионах
Fucus vesiculosus L.
как это происходит у одноклеточных водорослей [26]. Что касается Фотосистем световой фазы фотосинтеза, то в большей степени подавляется активность ФС I (рис. 2, Б), что приводит к снижению отношения активностей ФС I и II от 0,6 (контроль) до 0,16. Лимитирующая стадия фотосинтеза при достаточной освещенности обычно локализована на участке переноса электронов между двумя ФС [3]. Очевидно, снижение отношения активностей ФС I и II свидетельствует об уменьшении степени сопряжения Фотосистем и реально используемой доли потенциальной активности ФС II. Суммируя полученные результаты, можно констатировать, что добавление глицерина в среду культивирования эмбрионов F. vesiculosus вызывает полноценную анаболическую репрессию.
Из литературных данных известно, что помимо метаболических факторов важную роль в регуляции функционирования ассимиляционного аппарата растений играет система фитогормонов [18, 22, 23, 27]. Ранее нами показано, что кинетин вызывает значительное увеличение содержания хлорофиллов и Рубиско, а также интенсивности фотосинтеза у эмбрионов F. vesiculosus и микроводоросли Е. gracilis. Индолил-3-укс.усная кислота (ИУК), напротив, несколько ингибирует активность фотосинтетического аппарата [5]. По-видимому, пути передачи биорегуляторных сигналов различного происхождения не следует рассматривать как параллельные, не связанные между собой процессы. Для обеспечения баланса различных воздействий регуляция должна осуществляться более сложным путем: необходимо наличие связей и точек пересечения путей трансдукции сигналов [25]. Подобные взаимодействия часто можно наблюдать в клетках животных, экспрессия многих генов, которая регулируется с участием нескольких связанных между собой систем [31]. В данной работе исследовано совместное действие органического субстрата глицерина и фитогормонов ИУК и кинетина. Добавка ИУК либо не модифицирует действие глицерина (см. рис. 1; 2, А), либо наблюдается некоторый синергический эффект (см. рис. 2, Б). Кинетин во всех случаях действует как антагонист метаболического фактора: репрессия фотосинтетических процессов в присутствии этого гормона существенно снижается (см. рис. 1, 2). Подобные примеры совместного синергического и антагонистического действия гормональной и метаболической систем регуляции сложных физиолого-биохимических процессов в растительных организмах пока очень немногочисленны и касаются в основном высших растений. Одна из наиболее изученных систем - это совместный контроль действующими антагонистически гиббереллинами и сахарами экспрессии генов В-амилазы в клетках алейронового слоя прорастающих зерновок злаков [33]. Этилен и глюкоза также антагонистически регулируют фотоморфогенез семядольных листьев арабидопсиса [25]. Взаимодействие глицерина и полиаминов, а также и других фитогормонов показано при регуляции каллусообразования и органогенеза в культуре тканей красной водоросли Grateloupia doryphora [12]. В ряде случаев в путях передачи гормональных и метаболических сигналов обнаружены общие элементы [25, 30]. Полученные нами результаты позволяют предположить, что при контроле состава и функционирования фотосинтетического аппарата клеток водорослей также возможно согласованное действие различных систем регуляции. Эти данные подтверждают развивающееся в настоящее время положение о существовании в растительных клетках сложной, переплетающейся системы сигнальных путей.
Summary
Tarakhovskaya E. R., Maslov Y. I. The influence of phytohormones on the metabolic control of photosynthetic apparatus of Fucus vesiculosus L.
The influence of phytohormones (indole-3-acetic acid, kinetin, 10~5M) on principal photosynthetic pigments and ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase (Rubisco) content, photosynthesis rate and Photosystems (PS) activities is investigated in F. vesiculosus 3-day old embryos in the state of anabolic repression, caused by exogenous glycerol (0,5%). Glycerol causes the inhibition of all studied photosynthetic characteristics. Auxin enhances the inhibitory effect of glycerol on PS II activity. Kinetin weakens the anabolic repression approximately by 50%. It is supposed that the interaction of hormonal and trophic regulation systems plays an important role in the control of assimilation apparatus of algal cells.
Литература
1. Андреев В. П. Определение активностей фотосистем в мембранных препаратах из клеток синезеленых водорослей // Методы изучения мембран растительных клеток. Л., 1986. С. 133— 141.2. By сова Т. П., Иванова И. Л. Выделение и электрофорез белков в полиакриламидном геле // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. С. 37-51. 3. Литвин Ф. Ф., Синещеков В. А., Байченко В. А. Соотношение биофизических и физиологических закономерностей начальных стадий фотосинтеза // Физиология фотосинтеза. М., 1982. С. 34-54. 4Полевой В. В.|, Тараховская Е. Р., Маслов Ю. И., Полевой А. В. Роль ауксина в индукции полярности у зигот Fucus vesiculosus L. // Онтогенез. 2003. Т. 34. № 6. С. 432-437.5. Тараховская Е. Р., Маслов Ю. И. Влияние фитогормонов и трофических факторов на некоторые характеристики фотосинтетического аппарата Fucus vesiculosus и Euglena gracilis // Вестн. С-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2005. Вып. 3. С. 121— 128. 6. Тараховская Е, Р., Маслов Ю. И, К характеристике фотосинтетического аппарата Fucus vesiculosus L. на ранних стадиях эмбриогенеза // Известия РАН. Серия биологическая. 2005. № 5. С. 552-557. 7. Allakhverdiev S. I., Atsushi S., Yoshitaka N., Norio M. Inactivation of photosystems I and II in response to osmotic stress in Synechococcus. Contribution of water channels // Plant Physiol. 2000. Vol. 122. P. 1201-1208. 8. Badger M. R., Andrews T.J., Whitney S. M., LudwigM., YellowleesD. C., Leggat W., Price G. D. The diversity and coevolution of Rubisco, plastids, pyrenoids, and chloroplast-based C02-concentrating mechanisms in algae//Can. J. Bot. 1998. Vol. 76. P. 1052-1071.9. Craigie J. S. Storage products // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley; Los Angeles, 1974. P. 206-235. 10. De Martino A., Douady D,, Quinet-Szely M., Rousseau В., Crepineau F., Apt K., Caron L. The light-harvesting antenna of brown algae. Highly homologous proteins encoded by a multigene family// Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 5540-5549.11. Foyer С. H. Feedback inhibition of photosynthesis through source-sink regulation in leaves // Plant Physiol. Biochem. 1988. Vol. 26. P. 483-492. 12. Garcia-Jimenez P., Rodrigo M., Robaina R. R. Influence of plant growth regulators, polyamines and glycerol interaction on growth and morphogenesis of carposporelings of Grateloupia doryphora cultured in vitro //J. Appl. Phycol. 1998. Vol. 10. P. 95-100. 13. Halford N. G., Paul M.J. Carbon metabolite sensing and signaling // Plant Biotechnol. J. 2003. Vol. 1. P. 381-398. 14. Horrum M. A., Schwartzbach S. D. Nutritional regulation of organelle biogenesis in Euglena. Repression of chlorophyll and NADP-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase synthesis // Plant Physiol. 1980. Vol. 65. P. 382-386. 15. Israel A., Hophy M. Growth, photosynthetic properties and Rubisco activities and amounts of marine macroalgae grown under current and elevated seawater C02 concentrations // Global Change Biology. 2002. Vol. 8. P. 831-840. 16.JangJ.-C., Leon P., Zhou L„ Sheen J. Hexokinase as a sugar sensor in higher plants // The Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 5-19. il. Jeffrey S. W., Humphrey G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls «а», «Ь», «с,» and «с2» in higher plants, algae and natural phytoplankton // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1975. Vol. 167. N 1. P. 191-194. 18. Kasten В., Buck F., Nuske J., Reski R. Cytokinin affects nuclear- and plastome-encoded energy-converting plastid enzymes // Planta 1997. Vol. 201. P. 261-272.19. Katoh Т., Mimuro M., Takaichi S. Light-harvesting particles, isolated from a brown alga, Dictyota dichotoma. A
supramolecular assembly of fucoxanthin-chlorophyll-protein complexes // Biochim. et Biophys, Acta. 1989. Vol. 979. P. 233-240. 20. Kishore R., Schwartzbach S. D. Photo and nutritional regulation of the light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein of Photosystem II mRNA levels in Euglena // Plant Physiol. 1992. Vol. 98. P. 808-812. 21. Krapp A., Hofmann В., Schafer C., Stitt M. Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: a mechanism for the «sink regulation» of photosynthesis? // The Plant J. 1993. Vol. 3. N 6. P. 817-828. 22. Kusnetsov V. V., He?rmann R. G., Kulaeva O. N., Oelmuller R. Cytokinin stimulates and abscisic acid inhibits greening of etiolated Lupinus luteus cotyledons by affecting the expression of the light-sensitive protochlorophyllide oxidoreductase // Mol. Gen. Genet. 1998. Vol. 259. P. 21-28. 23. Lerbs S„ Lerbs W., Klyachko N. L„ Romanko E. G., Kulaeva 0. N., Wollgiehn R., ParthierB. Gene expression in cytokinin- and lightmediated plastogenesis of Cucurbita cotyledons: ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase // Planta. 1984. Vol. 162. P. 289-298. 24. McLachlan J. Photosynthesis of eggs, sperm, zygotes and embryos of Fucus serratus // Can. J. Bot. 1978. Vol. 56. N 4. P. 371-373. 25. Moller S. G., Chua N.-H. Interactions and intersections of plant signaling pathways //J. Mol. Biol. 1999. Vol. 293. P. 219-234. 26. Monroy A. F., Schwartzbach S. D. Catabolite repression of chloroplast development in Euglena // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2786-2790. 27. Nakano Т., Kimura Т., Kaneko I., Nagata N., Matsuyama Т., Asami Т., Yoshida S. Molecular mechanism of chloroplast development regulated by plant hormones // RIKEN Review. 2001. N 41. P. 86-87, 28. Passaquet C., Thomas J. C., Caron L„ Hauswirth N.. Fuel F., Berkaloff C. Light-harvesting complexes of brown algae. Biochemical characterization and immunological relationships // FEBS Lett. 1991.Vol. 280. N 1. P. 21-26. 29. Quatrano R. S. Developmental biology: development in marine organisms // Experimental marine biology / Ed. by R. N. Mariscal. New York; London, 1974. P. 303-346. 30. Rook F. Corke F., Card R., Munz G., Smith C„ Bevan M. V. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signaling // The Plant J. 2001. Vol. 26, N 4. P. 421-433. 31. Sharma R. Cross-talk in signal transduction // Curr. Sci. 1993. Vol. 65. P. 342-346. 32. Sheen J. Metabolic repression of transcription in higher plants // The Plant Cell. 1990. Vol. 2. P. 1027-1038. 33. Thomas B. R„ Rodriguez R. L. Metabolite signals regulate gene expression and source/sink relations in cereal seedlings // Plant Physiol. 1994. Vol. 106. P. 1235-1239. 34. Whitney S. M., Baldet P., Hudson G. S., Andrews T. J. Form I Rubiscos from non-green algae are expressed abundantly but not assembled in tobacco chloroplasts //The PlantJ. 2001. Vol. 26. N 5. P. 535-547. 35. Wingler A., von Schaewen A., Leegood R. C., Lea P. J., Quick W. P. Regulation of lea: senescence by cytokinin, sugars, and light. Effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 329-335.
Статья поступила в редакцию 6 апреля 2006 г.
