CC BY
93
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
Е. Р. Тараховская, Ю. И. Маслов
СПЕЦИФИКА УСВОЕНИЯ МАННИТА У FUCUS VESICULOSUS L.
И ASCOPHYLLUM NODOSUM (L.) LE JOLIS (PHAEOPHYTA)
Введение
Многоатомные спирты или сахароспирты являются одними из наиболее распространенных органических веществ в растительных организмах. В естественных условиях в растениях обнаружено 17 сахароспиртов, самый распространенный из них — маннит [20, 21]. Маннит в значительных количествах найден в представителях 70 семейств высших растений (Scrophulariaceae, Oleaceae, Rubiaceae, Apiaceae и др.) и многих отделов водорослей (например, Phaeophyta, Rhodophyta). Перечень функций сахароспиртов в растениях очень велик и включает в себя запасание и генерацию восстановителей и органического углерода, осморегуляцию, защиту от окислительного стресса и регуляцию фотосинтетических процессов [22]. Особенность высших растений состоит в том, что они, как правило, синтезируют и включают в энергетический обмен многоатомные спирты одновременно с сахарами (например, у модельного объекта — сельдерея всегда происходит параллельный синтез сахарозы и маннита). В противоположность этому у красных, и особенно у бурых водорослей, именно маннит играет в метаболизме ключевую роль, являясь основным первичным стабильным продуктом фотосинтеза и субстратом дыхания. У этих водорослей маннит синтезируется из фруктозо-6-фосфата в друхстадийном процессе, ключевой фермент которого — маннит-1-фосфатдегидрогена-за [16]. Содержание маннита в бурых макрофитных водорослях (роды Fucus, Ascophyl-lum, Laminaria) особенно велико и составляет от 10 до 45 мг/г сыр. веса [7, 18]. Помимо этого сахароспирта, продуктами фотосинтеза у вышеуказанных водорослей являются аланин, аспартат, глутамат и малат. Маннит также накапливается в качестве запасного питательного вещества вместе с ламинарином и глицерином [4, 24].
Подавляющее большинство водорослей — миксотрофные организмы: в дополнение к фотосинтетическому питанию они способны усваивать многие органические субстраты, такие как сахара, органические кислоты, жирные кислоты, одно- и многоатомные спирты. Морская вода может содержать значительные количества низкомолекулярных органических веществ, включая сахароспирты. Эти вещества — продукты экскреции
© Е. Р. Тараховская, Ю. И. Маслов, 2010
гидробионтов и разложения более сложной органики [2]. Особенно высокая концентрация органических веществ наблюдается в зонах массового роста макрофитов. Несмотря на то что многоатомные спирты играют ключевую роль в метаболизме бурых макрофитов, особенности их поглощения и усвоения водорослями в настоящее время недостаточно изучены. В частности, до сих пор остается нерешенным вопрос, способны ли эти водоросли в принципе усваивать экзогенный маннит. Ранее нами было показано [3], что обработка 0,5%-ным маннитом вызывает метаболическую репрессию у эмбрионов F. vesiculosus, выражающуюся в снижении интенсивности ряда фотосинтетических процессов. Подобная реакция свидетельствует о том, что на ранних стадиях развития фукус способен включить в метаболизм экзогенный маннит. Однако эти результаты не совпадают с литературными данными, полученными на взрослых растениях р. Fucus [21]. Можно предположить, что экзогенные органические субстраты не могут проникнуть в полностью развитый организм с тканевой структурой и плотными клеточными стенками [8], но существуют данные [7], что взрослые талломы родов Ascophyllum и Pelvetia эффективно усваивают экзогенные глюкозу, маннозу и маннит.
Цель данного исследования — изучение влияния экзогенного маннита на содержание внутриклеточного маннита и фотосинтетических пигментов в тканях эмбрионов и взрослых талломов F. vesiculosus и A. nodosum.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования послужили взрослые талломы и эмбрионы двух видов литоральных бурых водорослей: фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.) и аскофил-лума узловатого (Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis). Материал был собран в районе Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета (Белое море) в июле-августе 2006-2008 гг. Получение гамет, оплодотворение и выращивание синхронной культуры эмбрионов осуществляли в основном по стандартной методике [26]. В ходе работы 1 см высечки из апикальных участков 40-50 см талломов фукуса и аскофиллума в течение трех суток выдерживали в чашах Петри в морской воде без добавок (контроль) или с добавлением 0,5% маннита (опыт) в темноте и на свету. Затем высечки отмывали, обсушивали, взвешивали и определяли в них содержание маннита, хлорофиллов «а» и «с» и суммарное содержание каротиноидов. Аналогичные процедуры проводились с эмбрионами водорослей, в этом случае экспозиция начиналась сразу же после оплодотворения, в каждой пробе было ^400-600 тыс. эмбрионов. Для экстракции сахароспиртов пробу эмбрионов или предварительно измельченные высечки талломов кипятили 2 раза по 20 мин в десятикратном объеме дистиллированной воды, экстракты объединяли. Содержание маннита в экстрактах определяли аквакупроматным методом [1]. Фотосинтетические пигменты экстрагировали 90%-ным ацетоном: пробы растирали в ацетоне со стеклянным песком (лабораторное стекло) с добавлением небольшого количества Na2SÜ4 и NaHCÜ3 [15]. Расчет количества хлорофилла «a», суммы хлорофиллов «с1» + «с2» и суммы каротиноидов производили после спектрофотометрирования (СФ-26) по описанным в литературе формулам [13, 15].
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы STA-TISTICA 5.5 (StatSoft Inc., США). На рисунках представлены средние арифметические значения величин и доверительные интервалы (а = 0,05).
Результаты исследований и их обсуждение
Полученные данные показывают, что содержание эндогенного маннита в тканях фукуса и аскофиллума не одинаково и составляет в среднем около 40 и 30 мг/г сыр. веса соответственно (рис. 1, контроль). Содержание маннита в трехсуточных эмбрионах водорослей не отличается от его содержания во взрослых талломах. Вероятно, высокое содержание этого сахароспирта в эмбрионах объясняется в первую очередь запасом питательных веществ, накопленных еще в период созревания яйцеклеток. Яйцеклетки фукусовых очень крупные (диаметр 80-100 мкм) и, несмотря на способность к самостоятельному фотосинтезу, имеют большой запас питательных веществ [9, 19]. Известно, что ранний эмбриогенез этих водорослей может успешно осуществляться исключительно за счет этих запасов при отсутствии фотосинтеза (в темноте) [23]. В наших экспериментах F. vesiculosus и A. nodosum продемонстрировали резко различную реакцию на экзогенный маннит (см. рис. 1). У взрослых талломов фукуса не отмечено увеличение содержания маннита в тканях за время инкубации. В то же время содержание маннита в эмбрионах этой водоросли после обработки увеличилось на 15% по сравнению с контролем. Что касается аскофиллума, в этом случае увеличение содержания маннита на 14-15% произошло как в тканях взрослых талломов, так и в эмбрионах. Столь относительно небольшой (хотя и статистически достоверный) прирост содержания маннита, вероятно, объясняется высоким содержанием эндогенного сахароспирта в тканях водоросли, на фоне которого сложно заметить изменения, вызванные экзогенным воздействием. Однако такого увеличения содержания маннита в тканях водорослей оказалось достаточно для возникновения у объектов анаболической репрессии.
Рис. 1. Влияние экзогенного маннита на содержание маннита в тканях апексов взрослых талломов и эмбрионов F. vesiculosus и A. nodosum
Метаболизируемые органические субстраты, такие как сахара, спирты, жирные кислоты, органические кислоты, являются не только структурными компонентами клетки и источниками энергии. Эти вещества регулируют экспрессию генов, обеспечивающих важнейшие процессы метаболизма растений: дыхание, синтез и распад запасных питательных веществ, регуляцию клеточного цикла, ассимиляцию азота и в первую очередь фотосинтез [10, 12]. В подавляющем большинстве случаев экзогенные добавки органических субстратов в той или иной степени вызывают подавление деятельности фотосинтетических систем. Это явление получило название анаболической репрессии. В листьях высших растений добавка сахаров приводит к снижению содержания
Контроль Маннит
Рис. 2. Влияние экзогенного маннита на содержание фотосинтетических пигментов в тканях апексов взрослых талломов и эмбрионов F. vesiculosus и A. nodosum:
А — хлорофилл «а»; Б — хлорофилл «с»; В — сумма каротиноидов
хлорофилла, содержания и активности рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы и других фотосинтетических ферментов, интенсивности фотосинтеза [17, 29]. Присутствие органических субстратов в среде культивирования микроводорослей приводит к подавлению формирования хлоропластов в клетках, падению содержания хлорофилла, хлорофилл-связывающих белков и ряда ферментов цикла Кальвина, таких как НАДФ-зависимая дегидрогеназа 3-фосфоглицеринового альдегида и др. [11]. Данное исследование (рис. 2) и наши предыдущие работы [3] показывают, что явление анаболической репрессии свойственно и макрофитным водорослям. Об этом свидетельствует снижение содержания хлорофиллов в тканях талломов A. nodosum и эмбрионов обеих исследованных водорослей (рис. 2, А, Б). Количество хлорофиллов «а» и «с» в высечках аскофиллума уменьшилось на 13-14%, а в эмбрионах аскофиллума и фукуса — на 16-20%. Не продемонстрировали снижения содержания хлорофиллов в тканях только взрослые растения F. vesiculosus.
Интересно, что в одном случае (талломы A. nodosum) достоверно снизилось и общее содержание каротиноидов (рис. 2, В). Основными каротиноидами бурых водорослей являются фукоксантин и виолаксантин. При этом функция основного вспомогательного пигмента — фукоксантина, в отличие от большинства других каротиноидов, состоит не
в защите ассимиляционного аппарата от фотоповреждения, а в передаче энергии света на молекулы хлорофилла «а», а возможно, даже непосредственно на реакционные центры Фотосистем [5]. Таким образом, логично предположить, что наличие метабо-лизируемого органического субстрата должно приводить к снижению содержания фу-коксантина, что отразится и на общем содержании каротиноидов в тканях водорослей. Отсутствие подобного эффекта у эмбрионов исследованных водорослей может объясняться следующим образом. Вследствие более мелких размеров и низкой оптической плотности эмбрионы в значительной степени подвержены повреждающему действию избыточной радиации. Одним из способов защиты от фотоповреждения является накопление большого количества каротиноидов, таких как виолаксантин. Действительно, из рис. 2 видно, что соотношение хлорофиллов и каротиноидов у взрослых растений и у эмбрионов неодинаково — содержание хлорофиллов у эмбрионов ниже, а содержание каротиноидов — практически такое же, как и в апексах талломов соответствующих водорослей. Очевидно, относительно высокое общее содержание каротиноидов в эмбрионах достигается за счет виолаксантина, который в значительно меньшей степени, чем фукоксантин, способен напрямую участвовать в передаче энергии на хлорофилл «а», поэтому добавление маннита в данном случае не приводит к снижению общего количества каротиноидов.
Различный световой режим не оказал значимого влияния на поглощение маннита водорослями или содержание пигментов (данные не приводятся). Как уже отмечалось выше, вследствие большого количества запасных питательных веществ в яйцеклетках фукусовых раннее развитие этих водорослей практически не лимитируется светом [23]. Возможно, для выявления роли этого фактора необходимо использовать более длительные экспозиции.
Полагаем, что разная реакция исследованных объектов на обработку экзогенным маннитом может быть связана с экологическими особенностями этих водорослей. В отличие от фукуса A. nodosum живет в постоянном симбиозе с эндофитным грибом My-cophycias ascophyllii [6]. Подобное явление неоднократно отмечалось у бурых водорослей — помимо аскофиллума такие симбиозы образуют также водоросли родов Pelvetia и Petroderma [27, 28]. Метаболические взаимосвязи в этих симбиотических системах в настоящее время почти не изучены. Предполагается, что микобионт обеспечивает относительную устойчивость этих водорослей к обсыханию и пониженной влажности и стимулирует поглощение ряда минеральных элементов, в частности фосфора [25, 27]. Поскольку грибы обладают хорошо развитой системой переносчиков шести углеродных органических соединений [14, 25], можно предположить, что аскофиллум поглощает и метаболизирует маннит при помощи микобионта. Косвенным подтверждением этой гипотезы могут служить данные E. A. Drew [7], согласно которым среди исследованных автором бурых макрофитов только аскофиллум и пельвеция, т. е. водоросли, живущие в симбиозе с грибом, оказались способными усваивать экзогенные органические субстраты. Поскольку на ранних стадиях эмбриогенеза даже водоросли, не имеющие микобионта (р. Fucus), поглощают маннит и демонстрируют анаболическую репрессию в ответ на экзогенную обработку этим агентом, можно предположить, что основным препятствием для проникновения органических субстратов в клетки взрослых растений является физический барьер, такой как плотные клеточные стенки и развитая тканевая структура.
1. Ковардаков С. А., Изместьева М. А., Шмелева В. Л. Содержание маннита, хлорофилла «а» сухого вещества в тканях Laminaria saccharina (L.) при выращивании на разной глубине // Экология моря. 2000. Вып. 50. С. 32-36.
2. Раймонт Д. Планктон и продуктивность океана. М., 1983. Т. 1. 568 с.
3. Тараховская Е.Р., Маслов Ю. И. Влияние фитогормонов и трофических факторов на некоторые характеристики фотосинтетического аппарата Fucus vesiculosus и Euglena gracilis // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2005. Вып. 3. С. 121-128.
4. Craigie J. S. Storage products // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley; Los Angeles, 1974. P. 206-235.
5. De Martino A., Douady D., Quinet-Szely M., Rousseau B., Crepineau F., Apt K., Caron L. The light-harvesting antenna of brown algae. Highly homologous proteins encoded by a multigene family // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 5540-5549.
6. Deckert R. J., Garbary D. J. Ascophyllum and its symbionts. VI. Microscopic characterization of the Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae), Mycophycias ascophylli (Ascomycetes) symbiotum // Algae. 2005. Vol. 20. P. 225-232.
7. Drew E. A. Uptake and metabolism of exogenously supplied sugars by brown algae // New Phytol. 1969. Vol. 68. P. 35-43.
8. Droop M. R. Heterotrophy of carbon // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley; Los Angeles, 1974. P. 530-559.
9. Evans L. V., Callow J. A., Callow M. E. The biology and biochemistry of reproduction and early development in Fucus // Progr. Phycol. Res. 1982. Vol. 1. P. 67-110.
10. Halford N. G., Paul M. J. Carbon metabolite sensing and signaling // Plant Biotechnol. J. 2003. Vol. 1. P. 381-398.
11. Horrum M. A., Schwartzbach S. D. Nutritional regulation of organelle biogenesis in Euglena. Repression of chlorophyll and NADP-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase synthesis // Plant Physiol. 1980. Vol. 65. P. 382-386.
12. Jang J.-C., Leon P., Zhou L., Sheen J. Hexokinase as a sugar sensor in higher plants // The Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 5-19.
13. Jeffrey S. W., Humphrey G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls «a», «b», «ci» and «c2» in higher plants, algae and natural phytoplankton // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1975. Vol. 167, N1. P.191-194.
14. Jennings D. H. Polyol metabolism in fungi // Adv. Microb. Physiol. 1984. Vol. 25. P. 149-193.
15. Katoh T., Mimuro M., Takaichi S. Light-harvesting particles, isolated from a brown alga Dictyota dichotoma. A supramolecular assembly of fucoxanthin-chlorophyll-protein complexes // Biochim. et Biophys. Acta. 1989. Vol. 979. P. 233-240.
16. Koji I., Hideaki K., Tomoyoshi I., Yoshihiro S. Characterization of salt-regulated man-nitol-1-phosphate dehydrogenase in the red alga Caloglossa continua // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 893-900.
17. Krapp A., Hofmann B., Schafer C., Stitt M. Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: a mechanism for the “sink regulation” of photosynthesis? // The Plant J. 1993. Vol. 3, N 6. P. 817-828.
18. Kiippers U., Kremer B. P. Longitudinal profiles of carbon dioxide fixation capacities in marine macroalgae // Plant Physiol. 1978. Vol. 62. P. 49-53.
19. Levring T. Remarks on the submicroscopical structure of eggs and spermatozoids of Fucus and related genera // Physiol. Plant. 1952. Vol. 5. P. 528-539.
20. Lewis D. H. Physiology and metabolism of alditols // Storage carbohydrates in vascular plants / Ed. by D. H. Lewis. Cambridge, 1984. P. 157-179.
21. Lewis D. H., Smith D. C. Sugar alcohols (polyols) in fungi and green plants. I. Distribution, physiology, and metabolism // New Phytol. 1967. Vol. 66. P. 143-184.
22. Loescher W. H. Physiology and metabolism of sugar alcohols in higher plants // Physiol. Plant. 1987. Vol. 70. P. 553-557.
23. Major K. M., Davison I. R. Influence of temperature and light on growth and photosynthetic physiology of Fucus evanescens (Phaeophyta) embryos // Eur. J. Phycol. 1998. Vol. 33. P. 129-138.
24. McLachlan J. Photosynthesis of eggs, sperm, zygotes and embryos of Fucus serratus // Can. J. Bot. 1978. Vol. 56, N4. P. 371-373.
25. Polidori E., Ceccaroli P., Saltarelli R., Guescini M., Menotta M., Agostini D., Palma F., Stocchi V. Hexose uptake in the plant symbiotic ascomycete Tuber borchii Vittadini: biochemical features and expression pattern of the transporter TBHXT1 // Fung. Gen. Biol. 2007. Vol. 44. P. 1-198.
26. Quatrano R. S. Developmental biology: development in marine organisms // Experimental marine biology / Ed. by R. N. Mariscal. New York; London, 1974. P. 303-346.
27. Sanders W. B., Moe R. L., Ascaso C. The intertidal marine lichen formed by the pyrene-mycete fungus Verrucaria tavaresiae (Ascomycotina) and the brown alga Petroderma maculiforme (Phaephyceae): thallus organization and symbiont interaction // Am. J. Bot. 2004. Vol. 91, N4. P. 511-522.
28. Smith A. L., Ramsbottom J. Is Pelvetia canaliculata a lichen? // New Phytol. 1915. Vol. 14. P. 295-298.
29. Wingler A., von Schaewen A., Leegood R. C., Lea P. J., Quick W. P. Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and light. Effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 329-335.
Статья поступила в редакцию 3 декабря 2009 г.
