CC BY
8УДК 597.2/.5:592:591.132.05:547.56
ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ НА АКТИВНОСТЬ КАЗЕИНЛИТИЧЕСКИХ ПЕПТИДАЗ У ЛИЧИНОК ХИРОНОМИД -ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ РЫБ
'Кузьмина В.В., 2Заведенкова Л.В., 2Грачева Е.Л.
1 Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, п. Борок Ярославской обл.; 2Ярославский государственный университет им. П. Г. Демидова, Российская Федерация
При залповых сбросах стоков промышленных предприятий концентрация фенолов в воде может достигать 3800 мг/л, что резко ухудшает санитарное состояние водоемов и оказывает негативное влияние на гидробионтов. Ферментативную активность казеинлитических пептидаз определяли в гомогенатах личинок хирономид СЫгопошш 8р. по приросту тирозина при температуре 20°С и рН 7.4, в качестве субстрата использовали казеин (10 г/л), приготовленный на растворе Рингера. Фенол и его производные (2-хлорфенол, 4-хлорфенол, 2-нитрофенол и 2-аминофенол) в концентрациях 62.5-500 мг/л вызывают существенное увеличение активности казеинлитических пептидаз у личинок хирономид; 2,4-динитрофенол в тех же концентрациях не оказывает статистически значимых изменений в уровне ферментативной активности. Активность пептидаз снижается по мере увеличения концентрации 4-нитрофенола от 62.5 до 500 мг/л. Обсуждается влияние фенола и его производных на процессы аутодеградации белковых компонентов личинок хирономид - потенциальных объектов питания рыб-бентофагов и молоди всех видов рыб. Предполагается, что в условиях загрязнения среды фенолами активность пептидаз личинок хирономид может компенсировать низкую активность ферментов, синтезируемых кишечником консументов.
Ключевые слова: фенол, производные фенола, пищеварение, активность пептидаз Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 4: 37-45
В настоящее время не вызывает сомнения, что процессы пищеварения у консументов происходят при участии ферментов объектов питания и симбионтной микрофлоры. При этом в процессах аутодеградации объектов питания могут участвовать ферменты, синтезируемые их пищеварительной системой (желудочные, панкреатические и кишечные ферменты), а также лизосомальные гидролазы всех тканей. Последние реализуют индуцированный аутолиз. Особое значение имеет тот факт, что лизосомальные ферменты при кислых значениях рН способны разрушать практически все биополимеры, входящие в состав живых организмов (Уго-лев, 1985; Кузьмина, 2005, 2015; Высоцкая, Немова, 2008). Оптимум рН большинства лизосо-мальных ферментов, как правило, лежит в пределах 3.0-6.0, реже - при нейтральных значениях рН (Высоцкая, Немова, 2008; Кузьмина, 2015). Именно поэтому при изучении роли ферментов жертвы в процессах пищеварения рыб в последнее время наибольшее внимание уделялось гемоглобинлитическим пептидазам, обеспечивающим протеолиз при рН 3.0. Вместе с тем рН содержимого кишечника колеблется в значительных пределах, и чаще бывает близким к нейтральным значениям. В гастроэнтерологии при определении активности ферментов стандартным значением рН считается 7.4. В этом случае выявляется активность сериновых пептидаз панкреатического происхождения, а также активность лизосомальных пептидаз, оптимум рН которых лежит при нейтральных значениях.
Ранее подробно исследовалось влияние некоторых природных факторов на активность пептидаз рыб и их потенциальных объектов питания (Кузьмина и др., 2014, 2016; К^'шта й а1., 2011, 2015). Однако в естественных условиях на активность ферментов, помимо природ-
ных факторов, могут влиять многочисленные антропогенные факторы. В последние десятилетия усилилось внимание к влиянию антропогенных факторов на физиолого-биохимические характеристики различных гидробионтов (Алабастер, Ллойд, 1984; Немова, Высоцкая, 2004; Кузьмина, 2008). Значительное внимание уделяется воздействию фенолов на организм рыб (Веселов, 1959; Матей 1970; Лукьяненко, 1983; Флеров, 1989; Флерова, Заботкина, 2012; Кузьмина и др., 2015). Это связано с тем, что до последнего времени фенолы представляют одну из основных групп веществ, загрязняющих реки (Спицина и др., 2006; Сурсякова и др., 2011).
Фенолы образуются в водной среде в процессе метаболизма растительных и животных организмов, а также при распаде и трансформации органических веществ (Запрометов, 1974; Michalowicz, Duda, 2007). Однако эти фенолы, как правило, не представляют опасности для экосистем (Запрометов, 1974). Вместе с тем при увеличении в водной среде их концентрации они становятся опасными для гидробионтов. Фенолы поступают в воду со стоками предприятий нефтеперерабатывающей, сланцеперерабатывающей, коксохимической, лесохимической и анилинокрасочной промышленности. При залповых сбросах их концентрация может достигать 3800 мг/л, что резко ухудшает санитарное состояние водоемов и водотоков и, как правило, оказывает негативное влияние на гидробионтов (Лукьяненко, 1983; Флеров, 1989).
Фенол относится к группе нервно-паралитических ядов, вызывающих резкие нарушения функций центральной нервной системы и изменения в других системах организма рыб и других животных (Веселов, 1959; Лукьяненко, 1983; Флеров, 1989). Наиболее подробно изучено влияние фенолов на рыб. Хронические отравления рыб наблюдаются при более низких концентрациях фенола, по сравнению с острыми отравлениями. При хроническом действии фенола в концентрации 0.02-1 мг/л у рыб обнаруживаются выраженные патологические изменения в жабрах, печени и кишечнике. В частности, наблюдается некроз печеночной ткани, липидная и гидропическая дистрофии паренхимы органа, гиперемия кровеносных капилляров, инфильтрация лимфатическими клетками васкулярных зон (Матей, 1970). Сублетальная концентрация фенола (3 мкг/л) через 1-4 нед. воздействия вызывает патологические изменения в мезонефросе у серебряного карася Carassius auratus (Флерова, Заботкина, 2012), а концентрация 3.12 мг/л оказывает негативное влияние на условнорефлекторную деятельность у гуппи Lebistes reticulatus (Матей, 1970). Нами показано, что фенол и его производные в концентрации 1 ммоль/л значительно снижают активность ферментов химуса и слизистой оболочки кишечника рыб, реализующих протеолиз (Кузьмина и др., 2015). Сведения о влиянии фенола и его производных на активность пищеварительных ферментов у объектов питания рыб в доступной литературе отсутствуют.
Цель работы - изучение влияния фенола и его производных на активность казеинли-тических пептидаз в целом организме личинок хирономид, доминирующих в пище рыб-бентофагов и молоди всех видов рыб.
Материал и методы
Объект исследования: тип членистоногие Arthropoda, кл. насекомые Insecta, сем. Chironomidae, комары рода Chironomus, личинки комаров Chironomus sp. (суммарно). Масса одной личинки - 6-8 мг. Для определения активности и характеристик ферментов использовали метод смешанных проб (Егорова и др., 1974). В качестве ферментативно активных препаратов использовали гомогенаты предварительно размельченных и тщательно перемешанных нескольких десятков экземпляров целых личинок хирономид. Пробы гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с небольшим количеством раствора Рингера для холоднокровных животных (103 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 0.45 мМ CaCb, 1.2 мМ NHCO3, рН 7.4) при температуре 0-4°С. Для этого стеклянный гомогенизатор помещали в стакан со льдом. Затем полученный гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера до конечного разведения - 1:99. Ферментативную активность определяли по методу Ансона (Anson, 1938) на основе измерения прироста концентрации тирозина при температуре 20°С и рН 7.4. Каждая точка отражает
результаты 4-х измерений с учетом фона (количество тирозина в исходном гомогенате). В качестве субстрата использовали казеин (10 г/л), приготовленный на том же растворе Рингера. Для оценки влияния фенола и его производных (2-хлорфенола, 4-хлорфенола, 2-нитрофенола, 2-аминофенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола) на активность протеаз 0.25 мл раствора исследуемых веществ (62.5, 125, 250 и 500 мг/л) и 0.25 мл гомогената смешивали и предварительно инкубировали в течение 1 ч. Затем в каждую пробирку приливали 0.5 мл субстрата (при этом концентрация фенолов уменьшалась в два раза: 62,5, 125, 250 и 500 мг/л). Инкубацию смеси гомогената, фенолов и субстрата осуществляли при температуре 20°С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,3 н ТХУ. Через 10 мин инкубационную смесь фильтровали с помощью бумажного фильтра. Затем к 0,25 мл фильтрата добавляли 2 мл 0,5 н NaOH, 0,25 мл 0.025 н CuSO4 и 0,75 мл реактива Фо-лина, разбавленного в 3 раза ex tempore. Для того, чтобы определить первоначальное содержание тирозина в образцах (фон), перед добавлением субстрата в гомогенат вносили ТХУ. Остальные операции были идентичными описанным выше. Концентрацию тирозина в пробах определяли через 30 мин. Интенсивность окрашивания измеряли с помощью фотоколориметра КФК-2 при красном светофильтре, А,=597 нм. Активность фермента определяли в пяти по-вторностях для каждой точки с учётом фона (количество тирозина в исходном гомогенате) в расчёте на 1 г сырой ткани, мкмоль/(гмин).
Результаты и обсуждение
Влияние фенола и хлорфенолов на активность пептидаз гомогената личинок хироно-мид. Активность пептидаз гомогената личинок хирономид по казеину при рН 7,4 (20оС) в первой серии экспериментов была исследована в 3-х опытах. Уровень ферментативной активности у контрольных особей значительно варьировал и составил в опытах по фенолу, 2-хлорфенолу и 4-хлорфенолу 0,34±0,05, 1,03±0,09 и 0,59±0,08 мкмоль/(гмин) соответственно. Под действием этих соединений активность пептидаз увеличивалась по мере увеличения их концентрации (рис. 1).
мкмоль/(г-мин)
%
2000 1500 1000 500 0
□ 1
12
3
4
5
iii
iii
Рис. 1. Влияние фенола и хлорфенолов на активность пептидаз в гомогенатах целого организма личинок хирономид. По оси абсцисс: I - фенол; II -2-хлорфенол; III - 4-хлорфенол. По оси ординат: активность пептидаз на а - мкмоль/(гмин), на б - уровень ферментативной активности в процентах от контроля, принятого за 100. Концентрации фенолов: 1 - 0; 2 -62,5; 3 - 125; 4 - 250; 5 - 500 мг/л. *Р<0.05 по критерию при сравнении с контролем.
а
u
ii
Максимальный уровень ферментативной активности у особей из опытных групп составил 7,35±0,13, 6,22±0,39 и 1,12±0,31 мкмоль/(гмин) соответственно. Наиболее значительный эффект наблюдался под действием фенола - уровень ферментативной активности по сравнению с контролем увеличивается в 21.6 раза. В присутствии минимальной концентрации фенола активность пептидаз увеличивалась на 447%, максимальной - на 2062%. Отмечен рез-
кий подъем под действием минимальной концентрации фенола, постепенный рост под действием промежуточных концентраций и значительное увеличение под действием максимальной концентрации; по сравнению с эффектом фенола в концентрации 250 мг/л, ферментативная активность пептидаз при максимальной концентрации увеличилась почти в 2 раза. 2-хлорфенол и 4-хлорфенол оказывали меньший эффект по сравнению с фенолом. В присутствии минимальной концентрации этих веществ уровень ферментативной активности повысился на 123 и 83% соответственно. Затем наблюдалось плавное увеличение ферментативной активности и резкий подъем при максимальной концентрации хлорфенолов (на 507 и 597%).
Влияние нитрофенолов и 2-аминофенола на активность пептидаз гомогената тканей личинок хирономид. Активность пептидаз гомогената тканей личинок хирономид по казеину при рН 7,4 (20оС) во второй серии была исследована в 4-х опытах (рис. 2). Уровень ферментативной активности у контрольных особей слабо варьировал и составил в опытах по 2-нитрофенолу, 2-аминофенолу, 2,4-динитрофенолу и 4-нитрофенолу 0,49±0,06, 0,44±0,05, 0,54±0,05 и 0,51±0,06 мкмоль/(гмин) соответственно. Максимальный уровень ферментативной активности у особей из опытных групп под действием 2-нитрофенола и 2-аминофенола составил 4,21±0,26 и 2,30±0,20 мкмоль/(гмин). В обоих случаях активность пептидаз повышается по мере увеличения их концентрации. При этом степень повышения активности по мере возрастания концентрации фенолов была различной. В присутствии минимальной концентрации 2-нитрофенола активность пептидаз возрастала на 100, максимальной - на 760%, в присутствии 2-аминофенола - на 78 и 423% соответственно. В первом случае при минимальной концентрации препарата наблюдался более резкий подъем ферментативной активности, чем во втором, а также менее выраженное её увеличение при промежуточных концентрациях препарата - 250 и 500 мг/л; 2,4-динитрофенол не оказывал значимых изменений в уровне ферментативной активности.
мкмоль/(г • мин)
I II III IV I II III IV
Рис. 2. Влияние нитрофенолов и 2-аминофенола на активность пептидаз в гомогенатах личинок хирономид. По оси абсцисс: I - 2-нитрофенол; II - 2-аминофенол; III - 2,4-динитрофенол; IV - 4-нитрофенол. По оси ординат: активность пептидаз; а -мкмоль/(гмин), б - уровень ферментативной активности в процентах от контроля, принятого за 100. Концентрации фенолов: 1 - 0; 2 - 62,5; 3 - 125; 4 - 250; 5 - 500 мг/л.
В присутствии 4-нитрофенола активность пептидаз последовательно снижалась по мере увеличения его содержания в инкубате от 13 до 44%, статистически значимо ^<0.05) в присутствии максимальной концентрации препарата.
При обсуждении полученного материала, прежде всего, следует отметить принципиальное отличие данных по влиянию фенола и его производных на активность казеинлитиче-
ских пептидаз тканей личинок хирономид от результатов, полученных ранее при исследовании пептидаз кишечника рыб. Ранее при исследовании влияния фенола и его производных (4-хлорфенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола) в близких концентрациях (0.06-0.5 ммоль/л) на активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз у 5 видов рыб, различающихся по характеру питания, в большинстве случаев было зарегистрировано значительное снижение ферментативной активности. Лишь при низких концентрациях в ряде случаев было установлено незначительное увеличение уровня ферментативной активности. Кроме того, была выявлена разная степень их воздействия в зависимости от вида рыб, а также локализации фермента (слизистая оболочка или химус). Было показано, что активность казеинлитических пептидаз у судака Zander lucioperca и окуня Perca fluviatilis фактически не изменяется в присутствии этих токсических веществ. Этот факт позволил высказать предположение, что эффекты фенола и его производных в значительной мере зависят от структуры пептидаз: у представителей сем. окуневых Percidae ферменты относительно устойчивы к действию фенола и его производных, в то время как у представителей сем. карповых Cyprinidae и щуковых Esocidae пептидазы чувствительны к действию этих соединений (Кузьмина и др., неопубликованные данные).
Результаты опытов по влиянию фенола и его производных на активность гемоглобин-литических пептидаз химуса у исследуемых видов также свидетельствовали о разной степени их воздействия на ферменты рыб. При этом степень влияния фенола на активность гемоглобинлитических пептидаз химуса значительно отличалась от таковой слизистой оболочки кишечника. На этот факт обращалось особое внимание, поскольку действие фенолов на ферменты слизистой и химуса опосредовано рядом факторов, в том числе разным их набором. Отмечалось, что в слизистой оболочке кишечника рыб функционирует пептидазы, адсорбированные из полости, а также собственно кишечные пептидазы. В полости кишечника, помимо панкреатических по происхождению пептидаз, функционируют ферменты объектов питания рыб. При этом химус может содержать не только ферменты, но и продукты деградации до сотни различных объектов питания, которые могут усиливать или ослаблять влияние фенолов (Кузьмина и др., 2015).
При исследовании казеинлитических пептидаз, функционирующих в тканях личинок хирономид, было показано, что 2-хлорфенол, 4-хлорфенол, 2-нитро- и 2-аминофенол, напротив, оказывают значительный стимулирующий эффект, особенно в концентрации 500 мг/л. При этом чувствительность к фенолу казеинлитических пептидаз личинок хирономид была выше по сравнению с 2-хлорфенолом в 3.6, с 4-хлорфенолом в - 3.1, с 2-нитро- и 2-аминофенолом - в 2.5 и в 4.1 раза соответственно. При этом 2,4-динитрофенол не оказывал значимых изменений в уровне ферментативной активности, а в присутствии 4-нитрофенола активность пептидаз последовательно снижалась по мере увеличения его концентрации. Различная степень влияния фенола и его производных на казеинлитические пептидазы у представителей одного и того же рода Chironomus, по всей вероятности, связана с различиями в структуре и молекулярной массе разных фенолов. Так, фенол (С6Н5ОН) имеет молекулярную массу 94,1, а 2-хлор- и 4-хлорфенол (C6H5ClO / ClC^OH) - 128,6. При этом изомеры 2-хлор-и 4-хлорфенола различаются по положению в молекуле атомов Cl. Молекулярная масса 2-нитро- и 4-нитрофенола (C6H5NO3 / O2NC6H4OH), а также 2,4-динитрофенола (C6HN2O5 / (O2N)2C6H3OH выше - 139,1 и 184,1 соответственно. 2-аминофенол (C6H7NO / H2NC6H4OH) имеет молекулярную массу меньше таковой нирофенолов - 109,1.
Сопоставление этих данных свидетельствует о том, что в случае хлорфенолов снижение величины стимулирующего эффекта, по сравнению с таковым фенола, может быть обусловлено увеличением их молекулярной массы. При этом положение в молекуле изомеров атомов Cl не играет существенной роли. В случае нитрофенолов, напротив, важную роль играет строение изомеров. Если в случае 2-нитрофенола наблюдается значительная стимуляция активности пептидаз, то в случае 4-нитрофенола - торможение активности. Состав и молекулярная масса молекулы также имеет большое значение: 2,4-динитрофенол, имеющий наи-
большую молекулярную массу среди исследованных нитрофенолов, фактически не влияет на активность пептидаз. Однако 2-аминофенол, отличающийся по структуре от нитрофенолов, в том числе заменой нитрогруппы (NO2) на аминогруппу (NH2), имея меньшую молекулярную массу по сравнению с 2-нитрофенолом, оказывает менее выраженный стимулирующий эффект, по сравнению с последним. По всей вероятности, это связано с тем, что указанные вещества, влияя на регуляторные центры пептидаз, по-разному изменяют конформацию активных центров ферментов; поэтому эффективность взаимодействия ферментов и субстратов изменяется по-разному.
Полученные данные имеют принципиальное значение. Поскольку активность казеин-литических пептидаз в тканях личинок хирономид, рассчитанная на 1 г, в 5-10 раз ниже таковой у рыб (Уголев, Кузьмина, 1993), предполагалось, что их вклад в процессы пищеварения рыб невелик. Также важно, что активность пептидаз кишечника у рыб значительно подавляется в присутствии фенола, 4-хлорфенола, 4-нитрофенола и 2,4-динитрофенола (Кузьмина и др., 2015). Вместе с тем фенол, хлорфенолы и 2 нитро- и аминофенолы значительно увеличивают активность казеинлитических пептидаз в тканях личинок хирономид, приближая значения к таковым у рыб, не подвергнутых их действию. Следовательно, в условиях загрязнения среды обитания рыб указанными фенолами активность пептидаз личинок хирономид может компенсировать низкую активность ферментов, синтезируемых кишечником консументов.
Таким образом, в условиях in vitro фенол и его производные, как правило, значительно влияют на активность казеинлитических пептидаз в организме личинок хирономид Chironomus sp. Фенол, 2-хлорфенол, 4-хлорфенол, 2-нитрофенол и 2-аминофенол в концентрациях 62.5-500 мг/л вызывают значительное увеличение активности казеинлитических пептидаз в организме личинок хирономид. Предполагается, что в условиях загрязнения среды обитания рыб указанными фенолами активность пептидаз личинок хирономид может компенсировать низкую активность ферментов, синтезируемых кишечником консументов. 2,4-динитрофенол в тех же концентрациях не оказывает значимых изменений в уровне ферментативной активности. Активность пептидаз последовательно снижается по мере увеличения концентрации 4-нитрофенола в воде.
Авторы выражают глубокую благодарность Е.А. Куливацкой за техническую помощь в работе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алабастер Дж., Ллойд Р. Критерии качества воды для пресноводных рыб. - М.: Легкая и пищевая
промышленность, 1984. - 344 с.
2. Веселов Е.А. Биологические тесты при санитарно-биологическом изучении водоемов // В кн.:
Жизнь пресных вод СССР (ред. Е.Н. Павловский, В.И. Жадин). - М.: Изд. АН СССР, 1959. - Т.4. -Ч. 2. - С. 7-37.
3. Высоцкая Р.У., Немова Н.Н. Лизосомы и лизосомальные ферменты рыб. - М.: Наука. 2008. - 284 с.
4. Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Тимофеева Н.М., Туляганова Е.Х., Гурман Э.Г., Щербаков Г.Г., Уго-
лев А.М. Некоторые температурные характеристики и температурные адаптации ферментов, обеспечивающих мембранное пищеварение у пойкилотермных и гомойотермных животных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 1974. - Т. 10. - № 3. - С. 223-231.
5. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. - М.: Высшая школа, 1974. - 214 с.
6. Кузьмина В.В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб. - М. Наука. 2005. - 300 с.
7. Кузьмина В.В. Физиология питания рыб. Влияние внешних и внутренних факторов - Борок: ИБВВ РАН, 2008. - 276 с.
8. Кузьмина В.В. Процессы экзотрофии у рыб. Организация. Регуляция. Адаптации. - М.: Полиграф-Плюс, 2015. - 260 с.
9. Кузьмина В.В., Грачева Е.Л., Тарлева А.Ф. Влияние фенола и его производных на активность пептидаз слизистой оболочки и химуса у рыб // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2015. - № 3. - С. 59-67.
10. Кузьмина В. В., Золотарева Г.В., Шептицкий В.А. Влияние рН на активность протеиназ слизистой
оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у различающихся по экологии ихтиофагов // Вопросы ихтиологии. - 2016. - Т. 56. - № 1. - С. 102-108.
11. Кузьмина В.В. Скворцова Е.Г., Лузанова К.А., Лебедев Д.С., Николаичев К.А. Влияние температуры на активность пептидаз потенциальных объектов питания рыб разных экологических групп // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2014. - № 4. - С. 35-45.
12. Лукьяненко В.И. Общая ихтиотоксикология. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 320 с.
13. Матей В.Е. Влияние субтоксических концентраций фенола на условнорефлекторную деятельность
гуппи // Гидробиологический журнал. - 1970. - Т. 6. - № 3. - С. 100-103.
14. Немова Н.Н., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. - М.: Наука, 2004. - 210 с.
15. Спицына Т.П., Хохлова А.И., Степень Р.А. Система количественной оценки степени загрязнения поверхностных вод // Вестник Красноярского госуниверситета. Естественные науки. - 2006. - № 5. - С. 120-126.
16. Сурсякова В.В., Бондарева Л.Г., Бурмакина Г.В., Рубайло А.И. Новые подходы к выявлению источников поступления фенолов в поверхностные водоёмы // Доклады РАН. - 2011. - Т. 441. - № 6.
- С. 767-770.
17. Уголев А.М. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. - Л.: Наука. 1985. - 544 с.
18. Уголев А.М., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. - СПб.: Гидрометео-
издат, 1993. - 238 с.
19. Флеров Б.А. Эколого-физиологические аспекты токсикологии пресноводных животных. - СПб: Наука, 1989. -144 с.
20. Флерова (Назарова) Е.А., Заботкина Е.А. Токсическое действие сублетальных концентраций фенола и нафталина на мезонефрос серебряного карася // Токсикологический вестник. - 2012 - № 4. -С. 49-51.
21. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. -
1938. - Vol. 22. - P. 79-83.
22. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G., Zolotareva G.V., Sheptitskiy V.A. Influence of pH upon the activity of
glycosidases and proteinases of intestinal mucosa, chyme and microbiota in fish // Fish Physiol. Biochem.
- 2011. - Vol. 37. - No. 3. - P. 345-357.
23. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G., Shalygin M.V., Kovalenko E.E. Role of peptidases of the enteral
microbiota and preys in temperature adaptations of the digestive system in planktivorous and benthivorous fish // Fish Physiol. Biochem. - 2015. - Vol. 41. - No. 6. - P. 1359-1368.
24. Michalowicz J., Duda W. Phenols - Sources and Toxicity // Polish J. Environ. Stud. - 2007. - Vol. 16. -
No. 3. - P. 347-362.
REFERENCES
1. Alabaster Dzh., Lloid R. Kriterii kachestva vody dlya presnovodnykh ryb. (Water quality criteria for freshwater fish). Moscow: Legkaya i pishchevaya promyshlennost' Publ., 1984, 344 p.
2. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with haemoglobin. J. Gen. Physiol. 1938, 22: 79-83.
3. Egorova V.V., Iezuitova N.N., Timofeeva N.M., Tulyaganova E.H., Gurman E.G., Shcherbakov G.G., Ugolev A.M. Zhurnal evolyutsionnoi biokhimii Ifisiologii - J. Evol. Biochem. Physiol. 1974, 10(3): 223231.
4. Flerov B.A. Ekologo-fiziologicheskie aspekty toksikologiipresnovodnykh zhivotnykh (Ecological and physiological aspects of toxicology freshwater animals). St. Petersburg: Nauka Publ., 1989, 144 p.
5. Flerova (Nazarova) E.A., Zabotkina E.A. Toksikologicheskii vestnik - ToxicologicalHerald. 2012, 4: 49-51.
6. Kuz'mina V.V. Fiziologo-biokhimicheskie osnovy ekzotrofii ryb (Physiological and biochemical principles of exotrophy processes in fish). Moscow: Nauka Publ., 2005, 300 p.
7. Kuz'mina V.V. Fiziologiya pitaniya ryb. Vliyanie vneshnikh i vnutrennikh faktorov (Physiology of fish feeding. The influence of external and internal factors). Borok: IBIW RAS, 2008, 276 p.
8. Kuz'mina V.V. Protsessi ekzotrofii u ryb. Organizatsiya. Regulyatsiya. Adaptatsii (Processes of exotrophy in fish. Organisation. Regulation. Adaptations). Moscow: Polygraph Plus., 2015, 260 p.
9. Kuz'mina V.V., Gracheva E.L., Tarleva A.F. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2015, 3: 59-67.
10. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G., Shalygin M.V., Kovalenko E.E. Role of peptidases of the enteral microbiota and preys in temperature adaptations of the digestive system in planktivorous and benthivorous fish // Fish Physiol. Biochem. 2015, 41(6): 1359-1368.
11. Kuz'mina V. V., Skvortsova E.G., Luzanova K.A., LebedevD.S., Nikolaichev K.A. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2014, 4: 35-45.
12. Kuz'mina V. V., Skvortsova E.G., Zolotareva G.V., Sheptitskiy V.A. Influence of pH upon the activity of glycosidases and proteinases of intestinal mucosa, chyme and microbiota in fish. Fish Physiol. Biochem. 2011, 37(3): 345-357.
13. Kuz'mina V. V., Zolotareva G.V., Sheptitskiy V.A. Voprosy ikhtyologii - Problems of ichthiology. 2016, 56(1): 102-108.
14. Luk'yanenko V.I. Obshchaya ikhtiotoksikologiya (Total fish toxicology). Moscow: Legkaya i pishchevaya promyshlennost' Publ., 1983, 320 p.
15. Matey V.E. Gidrobiologicheskii zhurnal - Hydrobiol. J. 1970, 6(3): 100-103.
16. Michalowicz J., Duda W. Phenols - Sources and Toxicity. Polish J. Environ. Stud. 2007, 16(3): 347-362.
17. Nemova N.N., Vysotskaya R.U. Biokhimicheskaya indikatsiya sostoyaniya ryb (Biochemical indication of fish state). Moscow: Nauka Publ., 2004, 210 p.
18. Spitsyna T.P., Khokhlova A.I., Stepen' R.A. Vestnik Krasnoyarskogo gosuniversiteta. Estestvennye nauki -Bulletin of Krasnoyarsk State Univer. Ser. Natural Sci. 2006, 5: 120-126.
19. Sursyakova V.V., Bondareva L.G., Burmakina G.V., Rubailo A.I. Doklady Rossiiskoi Akademii Nauk - Reports of the Russian Academy of Sciences. 2011, 441(6): 667-770.
20. Ugolev A.M. Evolyutsiya pishchevareniya i printsipy evolyutsii funktsii (Evolution of digestion and principles of functions's evolution). Leningrad: Nauka Publ., 1985, 544 p.
21. Ugolev A.M., Kuz'mina V.V. Pishchevaritel'nye protsessy i adaptatsii u ryb (Digestion processes and adaptations in fishes). St. Petersburg: Gidrometeoizdat Publ., 1993, 238 p.
22. Veselov E.A. Zhizn'presnich vodSSSR (Life of freshwater in USSR). Moscow: AS USSR Publ. 1959, 4(2): 7-37.
23. Vysotskaya R.U., Nemova N.N. Lizosomy i lizosomal'nye fermenty ryb (Lysosomal enzymes of fishes). Moscow: Nauka Publ., 2008, 284 p.
24. Zaprometov M.N. Osnovy biokhimii fenol'nykh soedinenii (Foundation of phenolic compounds biochemistry). Moscow: Visshaya shkola Publ, 1974, 214 p.
Effect of phenol and its derivatives on the activity of casein-lytic peptidases in chironomid larvae - potential prey of fish
1 Kuz'mina V.V., 2 Zavedenkova L.V., 2 Gracheva E.L.
'Papanin Institute for Biology of Inland Waters, 152742 Borok Yaroslavl oblast, 2Demidov Yaroslavl State University, Yaroslavl., Russian Federation
ABSTRACT. During the time when industrial waste water is speedily discharged, concentration of phenols in the water can reach 3800 mg/l, which worsens the sanitary condition of water and has a negative impact on aquatic organisms. The enzymatic activity of caseinlytic peptidases was evaluated in homogenates of chironomid larvae Chironomus sp. by the increase in tyrosine concentration at 20oC, pH 7.4, as a substrate, casein (10 g/L) was used prepared on Ringer's solution. Phenol and its derivatives (2-chlorophenol, 4-chlorophenol, 2-nitrophenol and 2-aminophenol) in concentrations 62.5-500 mg/L caused a significant increase in the activity of casein-lytic peptidases in chironomid larvae; 2,4-dinitrophenol at the same concentrations does not exert significant changes in the level of enzyme activity. Peptidase activity decreases as the concentration of 4-nitrophenol elevates from 62.5 to 500 mg/L. The influence of phenol and its derivatives on the processes of protein components autodegradation of chironomid larvae - potential preys of benthophage and a fry of all fish species is discussed. It is expected that in conditions of water pollution by phenols, the peptidase activity of chironomid larvae can compensate for the low activity of enzymes synthesized by the intestines of consumers.
Key words: chironomid larvae, phenol, phenol derivatives, fish digestion, peptidases
Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 4: 37-45
Поступило в редакцию: 15.09.2016 Получено после доработки: 30.10.2016
Кузьмина Виктория Вадимовна, д.б.н., проф., т. 8(920)149-25-21,
vkuzmina@ibiw.yaroslavl. ru;
Заведенкова Любовь Владимировна, студ.;
Грачева Екатерина Леонидовна, ст. преп., т. 8(910)977-37-59, 2 553 25 53; 6652553@mail.ru
