CC BY
10УДК 591.132:592:577.15:597.2/.5
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДАЗ У ЛИЧИНОК ХИРОНОМИД - ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ РЫБ-БЕНТОФАГОВ
^кворцова Е.Г., 1 Егорова А.А., 12 Кузьмина В.В.
1 Ярославская ГСХА, Ярославль, Российская Федерация; 2Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, п. Борок Некоузского р-на Ярославской обл., Российская Федерация
Исследовано влияние температуры в диапазоне 0-70°С при рН 3.0 и 7.4, а также рН в диапазоне 5-10 при температуре 20°С, на характеристики казеин- и гемоглобинлитических пептидаз, функционирующих в гомогенте личинок хирономид Chironomus sp. Показано, что активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз, функционирующих в организме личинок хирономид, а также их рН-зависимость близки к таковой у некоторых видов рыб. Оптимум рН казеинлитических пептидаз хирономид соответствует 9.0, гемоглобинлитических -10.0, относительная активность при рН 5.0 - 48.1 и 31.8% от максимальной активности соответственно. Температурный оптимум пептидаз хирономид — 40°С. Форма кривых температурной зависимости казеин- и гемоглобинлитических пептидаз различна; в зоне температур 30-50оС при рН 7,4 активность казеинлитических пептидаз выше, чем гемоглобинлитических пептидаз, при рН 3,0, она, напротив, ниже в широком диапазоне температур (10-70оС). Полученные данные свидетельствуют о важной роли пептидаз личинок хирономид в процессах пищеварения у бентофагов и у молоди рыб разных экологических групп.
Ключевые слова: объекты питания рыб-бентофагов, личинки хирономид, пептидазы, эффекты температуры и кислотности среды
Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 4: 46-55
Введение
После описания А.М. Уголевым механизма индуцированного аутолиза и симбионтно-го пищеварения (Уголев, 1985) стало ясно, что процессы пищеварения у консументов нельзя рассматривать без учета ферментов объектов питания и симбионтной микрофлоры. Важно отметить, что в процессах аутодеградации объектов питания могут участвовать ферменты, синтезируемые как пищеварительной системой (панкреатические и мембранные ферменты), так и лизосомальные гидролазы всех тканей. Индуцированный аутолиз реализуется при участии двух групп внутриклеточных гидролаз - цитозольных и, главным образом, лизосомаль-ных ферментов. Лизосомальные ферменты при кислых значениях рН способны разрушать практически все биополимеры, входящие в состав живых организмов (Покровский, Тутельян, 1976; Кузьмина, 2005, 2015; Высоцкая, Немова, 2008). Оптимум рН большинства лизосомаль-ных ферментов, как правило, лежит в пределах 3.0-6.0, реже - при нейтральных значениях рН (Покровский Тутельян, 1976; Высоцкая, Немова, 2008; Кузьмина, 2015). Наиболее подробно исследованы закономерности протеолиза и характеристики пептидаз, концентрация которых в лизосомах исключительно высока. Лизосомальные пептидазы большинства клеток относятся к аспартатным, цистеиновым и сериновым эндопептидазам, реже - к металлоэндопептидазам (Высоцкая, Немова, 2008). На начальной стадии протеолиза в лизосомах участвуют в основном катепсины L, H и B. Оптимум рН катепсинов у разных видов значительно варьирует. В зоне рН 3.0 максимум активности отмечен у катепсинов D, Е, N, при рН 5.0 - у катепсинов А, B, C, D, L, S, при рН 7.0 - у катепсинов G, L, H (Немова, 1978; Высоцкая, Немова, 2008;
Кузьмина, 2015). Особенно важная роль в реализации индуцированного аутолиза принадлежит ионам водорода. Это связано с тем, что покровы жертвы слабо проницаемы для ферментов консумента, а скорость диффузии ионов водорода внутрь тканей пищевого объекта примерно в 1000 раз выше, чем у пищеварительных ферментов (Нортроп и др., 1950). При исследовании в качестве потенциальной жертвы различных гидробионтов показано, что этот механизм у рыб может играть существенную роль в процессах пищеварения (Кузьмина, 2005; 2015). Действительно, в период наиболее интенсивного питания у рыб-ихтиофагов тотальная активность протеолитических ферментов кормовых объектов может превышать тотальную активность протеаз (пептидаз) слизистой оболочки желудка консумента в 5-10 раз (Кузьмина, 2000, Кузьмина, Скворцова 2003). Вклад ферментов, обеспечивающих гидролиз белковых компонентов тканей жертвы, в процессы желудочного пищеварения рыб-ихтиофагов, наиболее высок при рН 3.0 - значении, оптимальном для функционирования пептидаз лизосом (Покровский Тутельян, 1976; Немова, 1978; Высоцкая, Немова, 2008; Кузьмина, 2015). При этом роль ферментов объектов питания в процессах пищеварения в значительной мере зависит от вида консумента и жертвы, температуры и рН гастральной и энтеральной сред.
Наиболее подробно исследована активность трипсиноподобных и химотрипсинопо-добных ферментов у морских беспозвоночных (Dendinger, 1987; Van-Wormhoudt et al., 1995b; Pancer et al., 1996; Serviere-Zaragoza et al., 1997; Navarrete del Toro et al., 2006). Кроме того, есть сведения о наличии у ряда видов беспозвоночных активности таких экзопептидаз, как карбоксипептидазы А и В, а также лейцинаминопептидазы (Dendinger, 1987; Boetius, Felbeck, 1995; Glass, Stark, 1995). В различных тканях морских беспозвоночных также обнаружены ка-тепсины или экспрессия их мРНК (Li et al., 2010; Ma et al., 2010; Wang et al., 2012; Bak et al., 2013; Hu et al., 2014). Оптимум рН катепсина D тканей китайской креветки Fenneropenaeus chinensis - 3.5, температуры - 60°С (Li et al., 2010). Оптимум рН фермента с использованием гемоглобина в качестве субстрата у каракатицы Sepia officinalis — 3.0, температурный оптимум -50°С (Balti et al., 2010).
При изучении протеолитической активности в гомогенате у ряда видов пресноводных гидробионтов, относящихся к типам Mollusca, Annelida и Arthropoda, при рН 7.4 (Кузьмина, 1999) было показано, что она в 5-15 раз ниже таковой в слизистой оболочке кишечника рыб (Кузьмина, 1990). Однако при оценке роли протеаз и гликозидаз кормовых объектов в питании у леща Abramis brama, с учетом спектра питания и доли каждого вида жертвы в рационе, было показано, что активность ферментов в тканях кормовых объектов из разных водоемов при рН 5.0, 7.4 и 8.3 может составлять от 20 до 50% активности ферментов консумента. У синца A. ballerus эти значения при тех же значениях рН составляют лишь 15- 25% (Кузьмина и др., 1999).
Несмотря на то, что температурные характеристики пептидаз потенциальных объектов питания рыб изучены крайне слабо, их изучение представляет значительный интерес, так как они являются инструментом для изучения температурных адаптаций ферментов (Егорова и др., 1974). Однако сведения о температурной и рН-зависимости пептидаз, функционирующих в организме объектов питания у молоди рыб и у взрослых бентофагов, обитающих в пресноводных водоемах, единичны (Кузьмина, 1999; Золотарева и др., 2015). При исследовании ферментов в экстракте из мышц и гепатопанкреаса пресноводной креветки Macrobrachium rosenbergii выявлена высокая активность протеаз по гемоглобину и казеину — при рН 5.0 и температуре 50°С, рН 7.0 и температуре 60°C соответственно. Важно отметить, что в экстракте из мышц активность была обусловлена главным образом кальпаином и катепсином L, а в гепатопанкреасе — в основном трипсином и химотрипсином (Sriket et al., 2011).
Цель данной работы — изучение влияния температуры на активность, рН-зависимость, температурную зависимость, температурные коэффициенты и энергию активации пептидаз в гомогенате личинок хирономид - объектов питания молоди всех видов пресноводных рыб, а также взрослых рыб-бентофагов.
Материал и методы
Объект исследования — тип членистоногие Arthropoda, кл. насекомые Insecta, сем. Chironomidae, комары рода Chironomus, личинки комаров Chironomus sp. (суммарно). Средняя масса одной личинки - 7.5 мг. Для определения активности и характеристик ферментов использовали метод смешанных проб (Егорова и др., 1974). В качестве ферментативно активных препаратов использовали гомогенаты предварительно размельчённых и тщательно перемешанных 10 экз. целых личинок. Все операции проводили на холоде. Для приготовления го-могенатов использовали охлажденный до 3-4°С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 1.1 мМ CaCb, 1.2 мМ NaHCOs, рН 7.4). Ферментативную активность определяли по приросту тирозина методом Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации при температуре 20°С и рН в диапазоне от 5 до 10, а также при температуре в диапазоне 0-70°С с интервалом 10°С (при рН 3.0 и 7.4). В качестве субстратов использовали казеин и гемоглобин (10 г/л), приготовленные на том же растворе Рингера. Инкубацию ферментативно активного препарата и субстрата осуществляли в течение 30 мин в термостатируемых камерах при постоянном перемешивании. Активность выражали в мкмолях тирозина, образовавшегося за 1 мин инкубации в расчете на 1 г сырой массы ткани. Кроме того, вычисляли температурные коэффициенты (Qi0), а по данным температурной зависимости графическим способом Аррениуса определяли величины энергии активации.
Результаты и обсуждение
Активность пептидаз гомогената личинок хирономид по казеину и гемоглобину, рассчитанная стандартным способом, при рН 7,4 (20оС) составляла 2,20±0,08 и 1,85±0,15 мкмоль/(гмин) соответственно. При этом расчетная активность казеинлитических пептидаз во всех тканях одной особи составила 0,016, гемоглобинлитических - 0,013 мкмоль/мин.
/
120
80
40
10
3
а
2
2
0
0
5
6
7
8
9
0
5
6
7
8
9
Рис. 1. Влияние рН (ось абсцисс ) на активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз гомогената личинок хирономид. Обозначения: а - активность ферментов, мкмоль/(гмин), б - % от максимальной активности. Субстраты: 1 - казеин, 2 - гемоглобин. Каждая точка отражает результаты 4-х измерений с учетом фона (количество тирозина в исходном гомогенате).
В зоне рН 2,0-4,0 ферментативная активность низка. Исследование активности пептидаз в широком диапазоне рН позволило выявить некоторые различия в форме кривых рН-зависимости активности ферментов при использовании в качестве субстрата казеина и гемоглобина (рис. 1). Если оптимум рН у первых соответствует 9,0, то у вторых - 10, то относительная активность протеиназ по казеину и гемоглобину при рН 5,0 составляет 48,1 и 31,8 % от максимальной активности соответственно.
Температурная зависимость пептидаз гомогената личинок хирономид по гемоглобину, рН 7,4 и 3,0. Активность пептидаз всех тканей личинок хирономид по казеину и гемоглобину при рН 7,4, рассчитанная стандартным способом, при 20оС составляла 2,29±0,17 и 2,20±0,08, при рН 3,0 - 0,85±0,28 и 1,42±0,12 мкмоль/(гмин) соответственно. Исследование активности пептидаз в широком диапазоне температур позволило выявить некоторые различия в форме кривых температурной зависимости казеин- и гемоглобинлитических пептидаз (рис. 2).
Рис. 2. Влияние температуры (ось абсцисс, °С) на активность пептидаз (ось ординат) в гомогенате личинок хирономид. Обозначения: а и в - активность ферментов, мкмоль/(г'мин), б и г - % от максимальной активности; а и б - рН 7,4 и 3,0 соответственно. Субстраты: 1 - казеин, 2 - гемоглобин. Каждая точка отражает результаты 4-х измерений с учетом фона.
Особо следует отметить исключительно низкие значения экстинкции в зоне низких температур, что с учетом ошибки метода снижает доверие к расчетам ферментативной активности. В зоне температур 30-50оС при рН 7,4 активность казеинлитических пептидаз выше, чем гемоглобинлитических пептидаз; при рН 3,0 она, напротив, ниже в широком диапазоне температур (10-70оС). Относительная активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз в зоне низких и высоких температур достаточно близка, особенно при рН 7,4.
Температурные коэффициенты ^10) активности пептидаз гомогената личинок хирономид. Из-за крайне низких значений экстинкции и возможных ошибок в оценках активности пептидаз при 0оС, величины Q10 рассчитывали в диапазоне температур 10-70оС. Данные, касающиеся температурных коэффициентов активности пептидаз в гомогенате личинок хирономид в широком диапазоне температур, свидетельствуют о том, что величины Q10 в большинстве случаев ниже 2,0, причем в зоне постмаксимальных температур они ниже 1.0 (см. табл.), при этом наиболее высокие значения показателя выявлены в зоне 10-20°С. Важно отметить, что в зоне температур жизнедеятельности (10-30оС, оптимальная температура 17-18оС) для всех препаратов, за исключением гемоглобина 1 (рН 7,4), характерно незначительное варьирование величин Q10 казеин- и гемоглобинлитических пептидаз (1,2-1,8).
Энергия активации процесса гидролиза казеина и гемоглобина пептидазами всего организма личинок хирономид. Данные, касающиеся Еакт пептидаз, функционирующих в составе тканей личинок хирономид в диапазоне температур 10-30°С, свидетельствуют о зависимости величины показателя от субстрата и рН (в случае гемоглобинлитических пептидаз). При этом значения энергии активации процесса гидролиза казеина в диапазоне 10-30°С при рН 7,4 и 3.0 исключительно близки - 9,7 и 9,8 ккал/моль соответственно. Величины энергии активации процесса гидролиза гемоглобина пептидазами тканей личинок хирономид в том же диапазоне температур при рН 7,4 почти в 2 раза выше, чем при рН 3,0: 10,2 и 4,7 ккал/моль соответственно.
Значения Q10 активности пептидаз в гомогенате личинок хирономид
Субстрат, рН+ Рк>
10-20°С 20-30°С 30-40°С 40-50°С 50-60°С 60-70°С
Казеин, 1 1.8 1.8 1.2 0.8 0.5 0.4
Казеин, 2 1.8 1.8 1.2 0.9 0.5 0.3
Гемоглобин, 1 2.1 1.5 1.3 0.8 0.6 0.6
Гемоглобин, 2 1.4 1.2 1.3 0.9 0.6 0.6
Примечание^ 1 - рН 7,4, 2 - рН 3,0.
При анализе полученного материала следует отметить, что результаты данной работы подтверждают сведения о том, что активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз в тканях личинок хирономид при стандартной температуре (20°С) и при рН 3,0 в расчете на 1 г сырой массы тканей близка к таковой в кишечнике рыб, а при рН 7,4 она значительно ниже (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2015). При этом активность казеинлитических пептидаз при рН 7,4 отражает преимущественно активность трипсина, гемоглобинлитических пептидаз - химотрипсина, при рН 3,0 - различных катепсинов. Важно отметить, что при температуре 20°С и рН 7,4 активность в гомогенате личинок хирономид пептидаз, особенно казеинлитиче-ских, ниже таковой в слизистой оболочке кишечника рыб (Кузьмина, 1990; Уголев, Кузьмина, 1993; Ушакова, Кузьмина, 2010). При рН 3,0 активность исследованных пептидаз (преимущественно катепсин Б) во всех тканях личинок хирономид и рыб, как правило, не превышает 1,5 мкмоль/(гмин). Однако, несмотря на относительно низкую активность пептидаз при рН 3,0, их участие в гидролизе белковых компонентов собственных тканей для процессов пищеварения у рыб исключительно важно.
Поскольку пепсин, химотрипсин и катепсин Б гидролизуют белки по одним и тем же связям (Антонов, 1983), ранее было высказано предположение, что катепсины жертвы, гидро-лизующие гемоглобин, играют роль пептидаз желудка (Кузьмина и др., 2014б). Также следует отметить принципиальное сходство рН-зависимости пептидаз тканей исследованных видов гидробионтов с таковыми слизистой оболочки кишечника консументов (Кузьмина и др., 2014а, 2016). В обоих случаях оптимум рН пептидаз личинок хирономид соответствует или близок к рН-оптимуму трипсино- и химотрипсиноподобных пептидаз, функционирующих в кишечнике рыб - рН 8-10 (Уголев, Кузьмина, 1993). При этом их температурные характеристики в ряде случаев существенно отличаются от таковых у рыб. Так, температурный оптимум казеин- и гемоглобинлитических пептидаз слизистой оболочки кишечника у рыб разных видов (преимущественно трипсин и химотрипсин) — 50-60°С (Кузьмина, 1990; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина и др., 2008, 2012 а,б), а тканей личинок хирономид - 40°С.
Несмотря на то, что температурный оптимум ферментов при обоих значениях рН находится при 40°С, форма кривых температурной зависимости казеин- и гемоглобинлитиче-ских пептидаз в зоне низких и постмаксимальных температур различна. Относительная активность казеинлитических пептидаз в тканях личинок хирономид при 0°С и рН 7,4 ниже таковых в кишечнике рыб; при 0оС она составляет 2,6%, гемоглобинлитических пептидаз - выше (15.4% от максимальной активности). Относительная активность пептидаз по казеину при 0°С и рН 3,0 составляет 17,1%, по гемоглобину - 16,0% от максимальной активности. В зоне по-
стмаксимальных температур также наблюдаются различия относительных величин активности. Так, при 70°С (рН 7,4 и 3,0) относительная активность казеинлитических пептидаз составляет 16,5 и 14,3%, гемоглобинлитических - 25,6 и 34,3% от максимальной активности. Полученные результаты свидетельствуют о большей термостабильности гемоглобинлитиче-ских пептидаз по сравнению с казеинлитическими. Поскольку при рН 7,4 гемоглобинлитиче-ские пептидазы в основном отражают активность химотрипсина, а при рН 3,0 - активность катепсинов различных органов и тканей, эти данные дают возможность предположить, что термостабильность химотрипсина и катепсинов (преимущественно катепсина D), выше, чем трипсина и других катепсинов (предположительно, катепсинов B и L).
Данные, касающиеся температурных коэффициентов пептидаз тканей личинок хиро-номид, подтверждают классические представления об уменьшении величин Q10 по мере увеличения температуры и резком их снижении в зоне постмаксимальных температур в результате денатурации белковых глобул ферментов. Сопоставление величин Еакт свидетельствует о зависимости этого показателя от субстрата и рН (в случае гемоглобинлитических пептидаз). Особо следует отметить очень близкие значения энергии активации процесса гидролиза казеина в диапазоне 10-30°С при рН 7,4 и 3,0 (9,7 и 9,8 ккал/моль соответственно). Следовательно, в диапазоне температур жизнедеятельности личинок хирономид трипсин и катепсины с одинаковой эффективностью гидролизуют пептиды по связям лизина и аргинина.
Величины энергии активации гидролиза гемоглобина пептидазами тканей личинок хи-рономид в том же диапазоне температур при рН 7.4 почти в 2 раза выше, чем при рН 3,0: 10,2 и 4,7 ккал/моль соответственно. Следовательно, в диапазоне температур их жизнедеятельности катепсины эффективнее гидролизуют пептиды по связям ароматических аминокислот, в частности, фенилаланина по сравнению с химотрипсином. Этот факт подчеркивает важную роль катепсинов, гидролизующих ароматические аминокислоты, в процессах аутодеградации личинок хирономид. Также важно отметить, что эти данные близки результатам, полученным ранее при исследовании гемоглобинлитических пептидаз у живородки (3,3 ккал/моль), но значительно ниже, чем у перловицы и рачкового планктона: 11,3 и 10,1 ккал/моль соответственно (Кузьмина и др., 2014б). Последнее косвенно свидетельствует о разном аминокислотном составе тканей указанных гидробионтов.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности гидролиза белковых компонентов тканей личинок хирономид в диапазоне температур 10-30°С при рН 3,0 (по гемоглобину). При гидролизе гемоглобина ферментами слизистой оболочки кишечника у рыб, питающихся личинками хирономид, в большинстве случаев излом на графике Аррениуса отмечен при 10°С. При этом после точки перегиба значения Еакт пептидаз слизистой, как правило, приблизительно в 1,3 раза ниже, чем в зоне низких температур (Шалыгин, 2013). Поскольку бенто- и планктофаги практически не питаются при температурах ниже 10°С, эти данные подтверждает представления о достаточной адаптированности ферментов тех и других к функционированию при температурах активного питания рыб. Полученные данные важны для понимания роли объектов питания в процессах пищеварения у рыб и для разработки новых подходов к их кормлению в условиях аквакультуры.
Таким образом, активность пептидаз, функционирующих в тканях личинок хирономид - объектов питания взрослых бентофагов и молоди рыб разных экологических групп при рН 7,4 и температуре 20°С по казеину несколько выше, чем по гемоглобину (2,20±0,08 и 1,85±0,15 мкмоль/гмин соответственно). Оптимум рН пептидаз по казеину — 9, по гемоглобину - 10, относительная активность пептидаз и при рН 5,0 составляет 48,1 и 31,8% от максимальной активности соответственно. Температурный оптимум пептидаз личинок хирономид в обоих случаях соответствует 40°С. При рН 7,4 в зоне температур 30-50°С активность казеинлитических пептидаз выше, чем гемоглобинлитических пептидаз, при рН 3,0 она, напротив, ниже. Относительная активность казеин- и гемоглобинлитических пептидаз в зоне низких и высоких температур достаточно близка, особенно при рН 7,4. В зоне температур жизнедеятельности личинок хирономид (10-30°С) для всех препаратов, за исключением гемоглобина
(рН 7,4), характерна незначительная вариабельность величин Q10 казеин- и гемоглобинлитиче-ских пептидаз (1,2-1,8). Значения энергии активации гидролиза казеина в диапазоне температур 10-30°С при рН 7,4 и 3 составляют 9,7 и 9,8, гемоглобина - 10,2 и 4,7 ккал/моль соответственно. Сопоставление активности и температурных характеристик пептидаз в гомогенате личинок хирономид и в тканях пищеварительного тракта разных видов рыб подтверждает представление о важной роли ферментов объектов питания в процессах пищеварения у консумен-тов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов В.К. Химия протеолиза. - М.: Наука, 1983. - 367 с.
2. Высоцкая Р.У., Немова Н.Н. Лизосомы и лизосомальные ферменты рыб. - М.: Наука, 2008. - 284 с.
3. Егорова В.В., Иезуитова Н.Н. и др. Некоторые температурные характеристики и температурные адаптации ферментов, обеспечивающих мембранное пищеварение у пойкилотермных и гомойотермных животных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.- 1974. - Т. 10. - № 3. - С. 223-231.
4. Золотарева Г.В., Кузьмина В.В., Шептицкий В.А. Активность протеиназ объектов питания и сопутствующей микробиоты у рыб-ихтиофагов в широком диапазоне рН // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2015. - № 1. - С. 42-52.
5. Кузьмина В.В. Влияние температуры на уровень общей протеолитической активности пищеварительного тракта некоторых видов пресноводных костистых рыб // Вопросы ихтиологии. -1990. - Т. 30.- Вып. 4. - С. 668-677.
6. Кузьмина В.В. Влияние температуры на пищеварительные гидролазы беспозвоночных животных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 1999. - Т. 35. - № 1. - С. 15-19.
7. Кузьмина В.В. Вклад индуцированного аутолиза в процессы пищеварения вторичных консументов на примере гидробионтов // Доклады РАН. - 2000. - Т. 339.- № 1. - С. 172-174.
8. Кузьмина В.В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб. - М.: Наука, 2005. -300 с.
9. Кузьмина В.В. Процессы экзотрофии у рыб. Организация. Регуляция. Адаптации. - М.: Полиграф-Плюс, 2015. - 260 с.
10. Кузьмина В.В., Золотарева Г.В., Шептицкий В.А. Влияние рН на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб из Кучурганского водохранилища // Вопросы ихтиологии. - 2014а. - Т. 54. - № 5. - С. 599-606.
11. Кузьмина В.В., Золотарева Г.В., Шептицкий В.А. Влияние рН на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у различающихся по экологии ихтиофагов // Вопросы ихтиологии. - 2016. - Т. 56. - № 1. - С. 102-108.
12. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г. Вклад протеолитических ферментов объектов питания в процессы пищеварения хищных рыб // Вопросы ихтиологии. - 2003. - Т. 43. - № 2. - С. 209-214.
13. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г., Шалыгин М.В. Влияние температуры на активность протеиназ химуса и слизистой оболочки кишечника рыб разных экологических групп // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2008. - Т. 44. - № 5.- С. 482-487.
14. Кузьмина В.В., Шалыгин М.В., Скворцова Е.Г. Влияние температуры на активность протеиназ энте-ральной микробиоты и слизистой оболочки кишечника рыб разных экологических групп. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2012 а. -Т. 48. - № 2. - С. 120-125.
15. Кузьмина В.В., Шалыгин М.В., Скворцова Е.Г. Влияние температуры на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у налима и щуки // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2012б. - № 3. - С. 22-29.
16. Кузьмина В.В., Скворцова Е.Г., Лузанова К.А., Лебедев Д.С., Николаичев К.А. Влияние температуры на активность пептидаз потенциальных объектов питания рыб разных экологических групп // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2014б. - № 4. - С. 35-45.
17. Немова Н.Н. Катепсины животных тканей // В кн.: Экологическая биохимия животных. - Петрозаводск: КарНЦ АН СССР, 1978. - С. 76-88.
18. Нортроп Дж., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. - М.: ИЛ, 1950. - 347 с.
19. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. - М.: Наука, 1976. - 382 с.
20. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. - Л.: Наука, 1985. - 544 с.
21. Уголев А.М., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. - СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. - 238 с.
22. Ушакова Н.В., Кузьмина В.В. Активность протеиназ у рыб различных экологических групп и их потенциальных объектов питания // Вопросы ихтиологии. - 2010. - Т. 50. - № 4. - С. 554-560.
23. Шалыгин М.В. Роль протеиназ объектов питания и энтеральной микробиоты в температурных адапта-циях пищеварительной системы рыб разных экологических групп. автореф. дисс. ... к.б.н. - Борок, ИБВВ РАН, 2013. - 21 с.
24. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. - 1938.
- Vol. 22. - P. 79-83.
25. Bak H.J., Kim M.S., Kim N.Y., Go H. J., Han J.W., In Jo.H., Ahn S.J., Park N.G., Chung J.K., Lee H.H. Molecular cloning, expression, and enzymatic analysis of cathepsin X from starfish (Asterina pectinifera) // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2013. - Vol. 169. - No. 3. - P. 847-861.
26. Balti R., Hmidet N., Jellouli K., Nedjar-Arroume N., Guillochon D., Nasri M. Cathepsin D from the hepatopancreas of the cuttlefish (Sepia officinalis): purification and characterization // J. Agric. Food Chem. - 2010. - Vol. 58. - No. 19. - P. 10623-10630.
27. Boetius A., Felbeck H. Digestive enzymes in marine invertebrates from hydrothermal vents and other reducing environments // Marine Biol. Berlin, Heidelberg. - 1995. - Vol. 122. - No. 1. - P. 105-113.
28. Dendinger J.E. Digestive proteases in the midgut gland of the Atlantic blue crab, Callinectes sapidus // Compar. Biochem. Physiol. - 1987. - Vol. 88 B. - No. 2. - P. 503-516.
29. Glass H.J., Stark J. R. Carbohydrate digestion in the European lobster Homarus gammarus (L.) // J. Crustacean Biol. -1995. - Vol. 15 - No. 3. - P. 424-433.
30. Hu X., Hu X., Hu B., Wen C., Xie Y., Wu D., Tao Z., Li A., Gao Q. Molecular cloning and characterization of cathepsin L from freshwater mussel, Cristaria plicata // Fish Shellfish Immunol. - 2014. - Vol. 40. -No. 2. - P. 446-454.
31. Li C., Zhang H., Li L., Song L. Identification of a cathepsin D potentially involved in H2A cleavage from scallop Chlamys farreri // Mol. Biol. Rep. - 2010. - Vol. 37. - No. 3. - P. 1451-1460.
32. Ma J., Zhang D., Jiang J., Cui S., Pu H., Jiang S. Molecular characterization and expression analysis of cathepsin L1 cysteine protease from pearl oyster Pinctada fucata // Fish Shellfish Immunol. - 2010. - Vol. 29. - No. 3. - P. 501-507.
33. Navarrete del Toro M.A., Garria-Carreno F.L., Diaz L.M., Celis-Guerrero L., Saborowski R. Aspartic proteinases in the digestive tract of marine decapod crustaceans // J. Exp. Zool. - 2006. - Vol. 305A. - P. 645-654.
34. Pancer Z., Leuck J., Rinkevich B., Steffen R., Mueller I., Mueller W.E.G. Molecular cloning and sequence analysis of two cDNAs coding for putative anionic trypsinogens from the colonial urochordate Botryllus schlosseri (Ascidiacea) // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. - 1996. - Vol. 5. - No. 4. - P. 326-333.
35. Serviere-Zaragoza E., Navarrete del Toro M.A., Garcia-Carreno F.L. Protein hydrolyzing enzymes in the digestive systems of the adult Mexican blue abalone, Haliotis fulgens (Gastropoda) // Aquaculture. - 1997. -Vol. 157. - No. 3-4. - P. 323-332.
36. Sriket C., Benjakul S., Visessanguan W. Characterisation of proteolytic enzymes from muscle and hepatopancreas of fresh water prawn (Macrobrachium rosenbergii) // J. Sci. Food Agric. - 2011. - Vol. 91.
- No. 1. - P. 52-59.
37. Van Wormhoudt A., Sellos D., Donval A., Plaire-Goux S., Moullac Le G. Chymotrypsin gene expression during the intermolt cycle in the shrimp Penaeus vannamei (Crustacea; Decapoda) // Experientia. - 1995. - Vol. 51. - No. 2. - P. 159-163.
38. Wang S., Shi L.J., Liu N., Chen A.J., Zhao X.F., Wang J.X. Involvement of Fenneropenaeus chinensis Cathepsin C in antiviral immunity // Fish Shellfish Immunol. - 2012. - Vol. 33.
REFERENCES
1. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with haemoglobin. J. Gen. Physiol. 1938, 22: 79-83.
2. Antonov V.K. Khimiyaproteoliza (Chemistry of proteolysis). Moscow: Nauka Publ., 1983, 367 p.
3. Bak H.J., Kim M.S., Kim N.Y., Go H. J., Han J.W., In Jo.H., Ahn S.J., Park N.G., Chung J.K., Lee H.H. Molecular cloning, expression, and enzymatic analysis of cathepsin X from starfish (Asterina pectinifera). Appl. Biochem. Biotechnol. 2013, 169(3): 847-861.
4. Balti R., Hmidet N., Jellouli K., Nedjar-Arroume N., Guillochon D., Nasri M. Cathepsin D from the hepatopancreas of the cuttlefish (Sepia officinalis): purification and characterization. J. Agric. Food Chem. 2010, 58(1): 10623-10630.
5. Boetius A., Felbeck H. Digestive enzymes in marine invertebrates from hydrothermal vents and other reducing environments. Marine Biol. Berlin, Heidelberg. 1995, 122(1): 105-113.
6. Dendinger J.E. Digestive proteases in the midgut gland of the Atlantic blue crab, Callinectes sapidus. Compar. Biochem. Physiol. 1987, 88B(2): 503-516.
7. Egorova V.V., Iezuitova N.N., Tulyaganova E.Kh. , Gurman E.G., Shcherbakov G.G., Ugolev A.M. Zhurnal evolyutsionnoi biokhimii Ifisiologii - J. Evol. Biochem. Physiol. 1974, 10(3): 223-231.
8. Glass H.J., Stark J. R. Carbohydrate digestion in the European lobster Homarus gammarus (L.). J. Crustacean Biol. 1995, 15(3): 424-433.
9. Hu X., Hu X., Hu B., Wen C., Xie Y., Wu D., Tao Z., Li A., Gao Q. Molecular cloning and characterization of cathepsin L from freshwater mussel, Cristariaplicata. Fish Shellfish Immunol. 2014, 40(2): 446-454.
10. Kuz'mina V.V. Voprosy ikhtyologii - Journal of Ichthiology. 1990, 30(4): 668-677.
11. Kuz'mina V.V. Zhurnal evolyutsionnoi biokhimii I fisiologii - J. Evol. Biochem. Physiol. 1999, 35(1): 15-19.
12. Kuz'mina V.V. Doklady Rossiiskoi Akademii Nauk - Proc. Russ. Acad. Sci. 2000, 339(1): 172-174.
13. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G. Voprosy ikhtyologii - Journal of Ichthiology. 2003, 43(2): 209-214.
14. Kuz'mina V.V. Fiziologo-biochimicheskie osnovi eksotrofii rib (Physiological and biochemical principles of exotrothy processes in fish). Moscow: Nauka Publ, 2005, 300 p.
15. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G., Shalygin M.V. Zhurnal evolyutsionnoi biokhimii I fisiologii - J. Evol. Biochem. Physiol. 2008, 44(5): 482-487.
16. Kuz'mina V.V., Shalygin M.V., Skvortsova E.G. Zhurnal evolyutsionnoi biokhimii I fisiologii - J. Evol. Biochem. Physiol. 2012, 48(2): 120-125.
17. Kuz'mina V.V., Shalygin M.V., Skvortsova E.G. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2012, 3: 22-29.
18. Kuz'mina V.V., Skvortsova E.G., Luzanova K.A., Lebedev D.S., Nikolaitchev K.A. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2014, 4: 35-45.
19. Kuz'mina V.V., Zolotareva G.V., Sheptitskiy V.A. Voprosy ikhtyologii - Journal of Ichthiology. 2014, 54(5): 599-606.
20. Kuz'mina V.V. Protsessi eksotrofii u rib. Organizatsiya. Regulatsiya. Adaptatsiii (Exotrophic processes in fish. Organization. Regulation. Adaptations). Moscow: Polygraph Plus Publ., 2015, 259 p.
21. Kuz'mina V.V., Zolotareva G.V., Sheptitskiy V.A. Voprosy ikhtyologii - Journal of Ichthiology. 2016, 56(1): 147-153.
22. Li C., Zhang H., Li L., Song L. Identification of a cathepsin D potentially involved in H2A cleavage from scallop Chlamys farreri. Mol Biol Rep. 2010, 37(3): 1451-1460.
23. Ma J., Zhang D., Jiang J., Cui S., Pu H., Jiang S. Molecular characterization and expression analysis of cathepsin L1 cysteine protease from pearl oyster Pinctada fucata. Fish Shellfish Immunol. 2010, 29(3): 501-507.
24. Navarrete del Toro MA, Garcia-Carreno FL, Diaz LM, Celis-Guerrero L, Saborowski R. Aspartic proteinases in the digestive tract of marine decapod crustaceans. J. Exp. Zool. 2006, 305A: 645-654.
25. Nemova N.N. [Catepsins of animal tissues]. In: Ekologicheskaya biokhimiya zhivotnykh (Ecological animal biochemistry). Petrozavodsk, 1978, P. 76-88.
26. Nortrop Dzh., Kunitts M., Kherriott R. Kristallicheskie fermenty (Cristallic enzymes). Moscow, 1950, 347 p.
27. Pancer Z., Leuck J., Rinkevich B., Steffen R., Mueller I., Mueller W.E.G. Molecular cloning and sequence analysis of two cDNAs coding for putative anionic trypsinogens from the colonial urochordate Botryllus schlosseri (Ascidiacea). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1996, 5(4): 326-333.
28. Pokrovskii A.A., Tutel'yan V.A. Lizosomy (Lysosomes). Moscow: Nauka Publ., 1976, 382 p.
29. Serviere-Zaragoza E., Navarrete del Toro M.A., Garcia-Carreno F.L. Protein hydrolyzing enzymes in the digestive systems of the adult Mexican blue abalone, Haliotis fulgens (Gastropoda). Aquaculture. 1997, 157(3-4): 323-332.
30. Shalygin M.V. Rol' proteinaz ob'ektov pitaniya i enteral'noi mikrobioty v temperaturnykh adaptatsiyakh pishchevaritel'noi sistemy ryb raznykh ekologicheskikh grupp (Role of proteinases of nutrition objects and en-teral microbiota in temperature adaptations of digestion system in fishes of different ecological groups). Extended Abstract of Diss. Cand. Sci. Biol., Borok, 2013, 21 p.
31. Sriket C., Benjakul S., Visessanguan W. Characterisation of proteolytic enzymes from muscle and hepatopancreas of fresh water prawn (Macrobrachium rosenbergii). J. Sci. FoodAgric. 2011, 91(1): 52-59.
32. Ugolev A.M. Evolyutsiyapishchevareniya i printsipy evolyutsii funktsii (Evolution of digestion and principles of functions's evolution). Leningrad: Nauka Publ., 1985, 544 p.
33. Ugolev A.M., Kuz'mina V.V. Pishchevaritel'nyeprotsessy i adaptatsii u ryb (Digestion processes and adaptations in fishes). St. Petersburg: Gidrometeoizdat Publ., 1993, 238 p.
34. Ushakova N.V., Kuz'mina V.V. Voprosy ikhtyologii - Journal of Ichthiology. 2010, 50(4): 554-560.
35. Van Wormhoudt A., Sellos D., Donval A., Plaire-Goux S., Moullac Le G. Chymotrypsin gene expression during the intermolt cycle in the shrimp Penaeus vannamei (Crustacea; Decapoda). Experientia. 1995, 51(2): 159-163.
36. Vysotskaya R.U., Nemova N.N. Lizosomy i lizosomal'nye fermenty ryb (Lysosomal enzymes of fishes). Moscow: Nauka Publ., 2008, 284 p.
37. Wang S., Shi L.J., Liu N., Chen A.J., Zhao X.F., Wang J.X. Involvement of Fenneropenaeus chinensis cathepsin C in antiviral immunity. Fish Shellfish Immunol. 2012, 33(4): 821-828.
38. Zolotareva G.V., Kuzmina V.V., Sheptytskiy V.A. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2015, 1: 61-69.
Effects of temperature and medium acidity on the peptidase activity in chironomid larvae - potential food object of benthophages
1 Skvortsova E.G., 1 Egorova A.A., 1,2 Kuz'mina V.V.
1 Yaroslavl State Agricultural Academy, Yaroslavl, Russian Federation; 2 Papanin Institute of Inner Waterts RAAS, Borok Yaroslavl oblast, Russian Federation
ABSTRACT. The aim was to study the effect of temperature in the range 0-70°C at pH 3.0 and 7.4, as well as effect of temperature 20°C at pH in the range 5-10, on characteristics of casein-and hemoglobin-lytic peptidases functioning in homogenate of chironomid larvae Chironomus sp. It has been shown that the activity of casein- and hemoglobin-lytic peptidases in homogenate of chi-ronomid larvae, as well as the pH-dependence are similar to that in certain fish species. Optimum pH of casein-lytic peptidase of chironomid larvae corresponds to 9.0, hemoglobin-lytic - 10.0, relative activity at pH 5.0 - 48.1 and 31.8% of maximum activity, respectively. The temperature optimum of peptidase activity of chironomid larvae corresponds to 40°C. The shape of curves of the temperature dependence of two types of peptidases is different; at pH 7.4 in the temperature zone 30-50°C, casein-lytic peptidase activity is higher than hemoglobin-lytic activity; at pH 3.0, by contrast, casein-lytic peptidase activity is lower than hemoglobin-lytic activity in broad temperature range (10-70°C). The findings suggest an important role of chironomid larvae peptidases in the processes of digestion of benthophages and juvenile fish of different ecological groups.
Keywords: food objects of benthophages, chironomid larvaes, peptidases, effects of temperature and medium acidity
Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 4: 46-55
Поступило в редакцию: 25.08.2016 Получено после доработки: 19.10.2016
Скворцова Елена Гамеровна, к.б.н., доц., тел. 8-905-630-72-93; e.skvorcova@yarcx.ru; Егорова Алина Андреевна, студ.;
Кузьмина Виктория Вадимовна, д.б.н., проф.; vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru
