CC BY
80
УДК 57.044; 504.05; 631.46
ВЛИЯНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ АНТИБИОТИКОВ НА ДИНАМИКУ ЧИСЛЕННОСТИ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ*
© 2014 г. Ю.В. Акименко
Акименко Юлия Викторовна - аспирант, факультет биологических наук, младший научный сотрудник, лаборатория экологического мониторинга, НИИ биологии, Академия биологии и биотехнологии Южного федерального университета, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов-на-Дону, 344006, e-mail: akimenkojuliya@mail. ru.
Akimenko Yuliya Viktorovna - Post-Graduate Student, Faculty of Biological Sciences, Junior Researcher, Laboratory of Environmental Monitoring, Research Institute of Biology, Academy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, Russia, e-mail: akimenkojuliya@mail.ru.
В модельных экспериментах изучено влияние антибиотиков (бензилпенициллина, фармазина, нистатина) разных концентраций (100, 600 мг/кг) на изменение численности микроорганизмов в черноземе обыкновенном. По степени устойчивости к антибиотикам исследованные микроорганизмы чернозема образовали ряд: бактерии-амилолитики > > микромицеты > бактерии-аммонификаторы. Действие антибиотиков на численность почвенных микроорганизмов носит пролонгированный характер. Полное восстановление численности микроорганизмов не происходит и за 120 сут. По скорости восстановления микроорганизмы чернозема обыкновенного образовали ряд: бактерии-амилолитики > бактерии-аммонификаторы > микромицеты.
Ключевые слова: антибиотики, микроорганизмы, чернозем обыкновенный, загрязнение, биодиагностика.
In model experiments influence of antibiotics (benzylpenicillin, pharmazin, nystatin) different concentrations (100, 600 mg / kg) on change of number of microorganisms in the chernozem ordinary is studied. On degrees of stability to the antibiotics, the studied microorganisms of the chernozem formed a row: amylolytic bacteria > micromycetes > ammonifying bacteria. Action of antibiotics on the number of soil microorganisms has the prolonged character. The complete recovery of number of microorganisms doesn't occur and in 120 days. On restoration speed microorganisms of the chernozem ordinary formed a row: amylolytic bacteria > ammonifying bacteria> micromycetes.
Keywords: antibiotics, microorganisms, chernozem ordinary, pollution, biodiagnostics.
В настоящее время проблеме загрязнения окружающей среды фармацевтическими антибиотиками и приобретения к ним устойчивости патогенных микроорганизмов уделяется особое внимание. Все чаще остаточные концентрации антибиотиков, активно используемых в медицине, сельском хозяйстве и животноводстве, обнаруживаются в почвах. Их экотоксичность мало изучена. В основном антибиотики попадают в почву благодаря применению навоза и сточных вод на сельскохозяйственных землях в качестве удобрения. В настоящее время антибиотики все чаще обнаруживаются в грунтовой и питьевой воде, сточных водах и сельскохозяйственных почвах, антибиотики из класса тетрациклинов - в почвах в концентрациях 10^900 мг/кг, из класса макролидов - до 50^800 мг/кг [1].
Антибиотики, широко распространенные в окружающей среде, изменяют активность и состав почвенных микроорганизмов и приводят к развитию их устойчивости. Кроме того, различные антибиотики образуются естественным путем в почвах, однако их концентрации и типы сильно отличаются от естественного фона [2].
Данные по влиянию антибиотиков на биологические свойства почв в российской литературе нами не встречены. Однако имеются данные о влиянии фармацевтических препаратов на биоту водоемов, перечислены основные группы лекарственных средств, которые были выявлены в поверхностных и сточных водах [3].
Цель исследования - изучение влияния фармацевтических антибиотиков на динамику численности микроорганизмов в черноземе обыкновенном.
*Исследование выполнено в рамках государственного задания в сфере научной деятельности Министерства образования и науки РФ (проектная часть № 6.345.2014/К; базовая часть № 1894) и при государственной поддержке ведущей научной школы Российской Федерации (НШ-2449.2014.4).
Объекты и методы
Объект исследования - чернозем обыкновенный южноевропейской фации карбонатный Ботанического сада Южного федерального университета. Данный тип почв выбран в связи с тем, что черноземы составляют большую часть почвенного покрова юга России и имеют особое значение в продовольственном обеспечении страны [4]. Почва для модельных экспериментов отобрана из пахотного горизонта (0^25 см). Воздушно-сухие образцы почвы обрабатывали растворами антибиотиков бензилпенициллина, фармазина и их комплексами с нистатином в различных концентрациях: 100 и 600 мг/кг почвы. Данные концентрации выбраны на основании литературных данных по остаточным количествам антибиотиков в окружающей среде [5] и по результатам ранее проведенных рекогносцировочных исследований [6-8]. Все образцы инкубировали при температуре 20^25 С в темном месте для избежания быстрого разложения антибиотиков, при оптимальном увлажнении (60 % от полевой влагоемкости). Контролем служила почва, не подвергавшаяся обработке антибиотиками. Изменение численности микроорганизмов изучали через 10, 60, 120 сут. Аналитические определения биологических свойств почвы выполняли в 3-кратной повтор-ности.
Для исследования влияния антибиотиков на почвенную микробиоту были выбраны бактерицидный (бензилпенициллин), бактериостатиче-ский (фармазин) и фунгицидный (нистатин) антибиотики, которые широко используются в медицине и животноводстве. Бензилпенициллин - из группы биосинтетических пенициллинов, активен в отношении грамположительных и грамотрица-тельных бактерий, анаэробных спорообразующих палочек. Фармазин - препарат, содержащий в качестве активно действующего вещества тилозин -антибиотик из группы макролидов, активен в отношении большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. Нистатин -полиеновый противогрибковый антибиотик. Действует на патогенные и особенно на дрожжепо-добные грибы р. Candida, а также на аспергиллы, в отношении бактерий не активен. Комплексное исследование микробоценоза чернозема обыкновенного включало определение численности микроорганизмов методом глубинного посева соответствующих разведений на плотные питательные среды: аммонифицирующих бактерий - на МПА, амилолитических - на КАА, микромицетов - на подкисленной среде Чапека [9].
Результаты и их обсуждение
В рамках нашего исследования установлено (рис. 1-3), что все исследуемые концентрации фармацевтических антибиотиков оказывают достоверное подавляющее воздействие на численность почвенных микроорганизмов. Корреляционный анализ данных позволил сделать вывод о тесной связи между концентрацией антибиотиков и изменением численности почвенных микроорганизмов (г = -0,68-0,86). В аналогичном исследовании установлено, что загрязнение почвы сульфахлорридазином приводит к ингибированию численности почвенной микробио-ты; дальнейшее увеличение концентрации данного антибиотика вызывает развитие устойчивости у микроорганизмов [10].
Динамика численности аммонифицирующих бактерий чернозема обыкновенного под действием антибиотиков показана на рис. 1. Наибольший подавляющий эффект на численность аммонифи-каторов оказывает комплекс фармазина и нистатина в концентрации 100 мг/кг, минимальное воздействие - комплекс бензилпенициллина и нистатина (100 мг/кг) (рис. 1а). По-видимому, нистатин блокирует действие бактерицидных препаратов (бензилпенициллина) и снижает эффект их воздействия. Другие исследователи отмечали снижение эффекта подавления в присутствии фунгицид-ных препаратов и проявление синергетических эффектов смесей антибиотиков [11]. Причины таких эффектов все еще остаются невыясненными. Напротив, при более высоких концентрациях (600 мг/кг) антибактериальные антибиотики приводят к большему снижению численности аммонифицирующих бактерий, нежели комплексы с фунги-цидным препаратом (рис. 1б). Через 60 и 120 сут опыта во всех исследуемых концентрациях наблюдается восстановление численности бактерий; в минимальной концентрации происходит практически полное восстановление, в максимальной -до 75^85 % от контроля для комплексов антибиотиков (р<0,05) и 45^58 % (р<0,001) для антибактериальных антибиотиков соответственно. Аналогичные данные по динамике численности бакте-рий-аммонификаторов получены в модельных экспериментах с различными видами излучения [12]. При загрязнении тяжелыми металлами, нефтью и нефтепродуктами [13] относительно небольшими дозами (до 1 ПДК) и в первые сроки от момента загрязнения (до 1 мес.) численность микроорганизмов в почве в ряде случаев увеличивается, затем снижается и даже через 360 дней не восстанавливается полностью. Однако в сравнении с эффектом стерилизации высокими температурами [14] действие антибиотиков на почвенные микро-
организмы носит более пролонгированный харак- высокими температурами численность микроор-тер, так как, например, при стерилизации почв ганизмов восстанавливалась.
100
Ю
60
—
1 40
Ю
.0
40
00
80
100
су ГШ
ш
• bcwu ото* п о и м d i Е>сня писн о ■ 11 Ii im4 Hl н тл n d i
— <!'.t|>M.riiiM -'!> M'M-nlBI'HIM.lIIIH
100
80
1 ,0
¿0
10
40
60
80
100
CVIKH
uo
• barm inouBatiiiii E»cmi nnew «ld nm k-hi к тал и
—Фармашн -Фар»ии^1«гпши
Рис. 1. Динамика численности аммонифицирующих бактерий в черноземе под действием антибиотиков
в концентрациях 100 (а) и 600 мг/кг (б)
Динамика численности амилолитических бакте- антибиотики в концентрации 100 мг/кг не оказали рий чернозема обыкновенного под действием ан- достоверного подавляющего воздействия на чис-тибиотиков показана на рис. 2. Все исследуемые ленность амилолитических бактерий. На 10-е и
а
б
120-е сут опыта численность амилолитиков прак- эффективны комплексы антибиотиков. В целом,
тически одинакова (рис. 2а). При концентрации амилолитические бактерии оказались более ус-
антибиотиков 600 мг/кг наблюдается значитель- тойчивыми к действию антибиотиков. ное подавляющее воздействие, причем наиболее
100
&
1
I- о о а о
60
50 ' cynai
0 20 40 60 SO IVO 120
■ Г.енипждп принт — — Фярмгом БенпшпсянлгпинНак i ним -Фярмпшн*tau mjiih
|М
а
б
50 I » I I --,
О 20 40 60 Ю 100 120
■bcmimcHuniiii — — 'I-n'M.mei fiOiainkMiiuiiii'tiKTinii -Ф^шнсккпли
Рис. 2. Динамика численности амилолитических бактерий в черноземе под действием антибиотиков
в концентрациях 100 (а) и 600 мг/кг (б)
Благодаря ранее проведенным рекогносцировочным исследованиям [15] установлено, что фунги-цидный антибиотик нистатин не оказывает влияния на бактерии, однако закономерно подавляет численность микромицетов в прямой зависимости от концентрации (100^600 мг/кг). Как и ожидалось, антибактериальные антибиотики (бензилпенициллин, фармазин) во всех исследуемых концентрациях не вызвали достоверных изменений численности микромицетов, в отличие от комплексов с нистатином. И скорее всего, разница в численности по сравнению с контролем объясняется самим фактом стресса для микробиоты при внесении загрязнителей. На
10-е сут опыта численность микромицетов при действии комплекса антибиотиков снижается на 45-55 % (р<0,001), однако затем наблюдается тенденция восстановления - до 70^80 % от контроля на 120-е сут опыта, но полного восстановления численности не происходит (рис. 3а). Значительное подавляющее воздействие на численность микромицетов оказали комплексы антибиотиков в концентрации 600 мг/кг. Эффект ингибирования для комплексов нистатина с бензилпенициллином и фармазином практически одинаков. Наблюдается тенденция незначительного восстановления численности до 60^65 % от контроля (р<0,001).
100
wo
- 40
cvtmi wo
■ Ьага itnaa u n и и ' LciniiiiKtaaaiiiiiir iah. глпи
— Фармлгеа* -флрмляас >ак tanoi
100
20
100
СУПМ
wo
■ FariniKWiimin
EotniinciaaaiTuamak i.inai
- -'I'i^LTDIl
--1'.H'VMUif • tlK unii
Рис. 3. Динамика численности микромицетов в черноземе под действием антибиотиков в концентрациях 100 (а) и 600 мг/кг (б)
а
б
В вариантах с антибактериальными антибиотиками в концентрации 600 мг/кг зафиксировано постепенное увеличение численности микромицетов по сравнению с контролем; на 120-е сут опыта численность превышает контроль на 10-18 % (р<0,05). Это можно объяснить устранением конкуренции со стороны бактерий и активным заселением микро-мицетами экологической ниши.
Заключение
Все исследуемые дозы фармацевтических антибиотиков оказывают достоверное подавляющее воздействие на численность исследуемых групп почвенных микроорганизмов. Степень влияния антибиотиков определяется их природой, концентрацией и сроками действия. Бактерицидные препараты (бензилпенициллин) наиболее эффективны в отношении аммонифицирующих бактерий, бакте-риостатические (фармазин) - амилолитических. Комплексы антибиотиков наиболее эффективны в отношении всех исследуемых групп почвенных микроорганизмов. В комплексах антибактериальных антибиотиков с фунгицидным установлен меньший достоверный эффект воздействия на численность бактерий-аммонификаторов, чего нельзя сказать об амилолитических бактериях. Поэтому достоверное суждение о синергизме и антагонизме вносимых антибиотиков пока не предоставляется возможным. Для объяснения механизмов такого взаимодействия требуются дополнительные исследования. Действие фармацевтических антибиотиков на численность почвенных микроорганизмов носит пролонгированный характер. Полное восстановление численности микроорганизмов не происходит и за 120 сут.
Литература
1. Zhou L.J., Ying G.G., Zhao J.L., Yang J.F., Wang L.,
Yang B., Liu S. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hai River and Liao River in Northern China // Environ. Pollut. 2011. Vol. 159. P. 1877-1885.
2. Su H.C., Ying G.G., Tao R., Zhang R.Q., Zhao J.L., Liu
Y.S.. Class 1 and 2 integrons, sul resistance genes and antibiotic resistance in Escherichia coli isolated from Dongjiang River, South China // Environ. Pollut. 2012. Vol. 169. Р. 42-9.
3. Самойленко Н.Н., Ермакович И.А. Влияние фарма-
цевтических препаратов и их производных на окру-
Поступила в редакцию_
жающую среду // Вода и экология: проблемы и решения. 2014. № 2 (58). С. 78-87.
4. Вальков В.Ф., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Почвы
Юга России. Ростов н/Д, 2008. 276 с.
5. Thiele-Bruhn S., Seibicke T., Schulten H.R., Leinweber P.
Sorption of sulfonamide pharmaceutical antibiotics on whole soils and particle-size fractions // J. Environ. Qual. 2004. Vol. 33. P. 1331-1342.
6. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Эко-
логические последствия загрязнения чернозема антибиотиками. Ростов н/Д, 2013. 120 с.
7. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Влия-
ние антибиотиков (бензилпенициллина, фармазина, нистатина) на биологические свойства чернозема обыкновенного // Почвоведение. 2014. № 9. С. 10951101.
8. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Влия-
ние антибиотиков (бензилпенициллина, фармазина, нистатина) на численность микроорганизмов в черноземе обыкновенном // Сиб. экол. журн. 2014. № 2. С. 253-258.
9. Казеев К.Ш., Колесников С.И. Биодиагностика почв:
методология и методы исследований. Ростов н/Д, 2012. 260 с.
10. Schmit H., Van Beelen P., Toll J., Van Leeuwen C.L.
Pollution-induced community tolerance of soil microbial communities caused by the antibiotic sulfachloropyridazine // Environ. Sci. Technol. 2004. Vol. 38. Р. 1148-1153.
11. Wunder D.B., Tan D.T., LaPara T.M., Hozalski R.M. The
effects of antibiotic cocktails at environmentally relevant concentrations on the community composition and acetate biodegradation kinetics of bacterial biofilms // Chemosphere. 2013. Vol. 90. Р. 2261-2266.
12. Денисова Т.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И., Валь-
ков В.Ф. Интегральная оценка электромагнитных воздействий различной природы на биологические свойства почв юга России // Почвоведение. 2011. № 11. С. 1386-1390.
13. Колесников С.И., Ярославцев М.В., Спивакова Н.А.,
Казеев К.Ш. Сравнительная оценка устойчивости биологических свойств черноземов юга России к загрязнению Cr, Cu, Ni, Pb в модельном эксперименте // Почвоведение. 2013. № 2. С. 195.
14. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Влия-
ние разных способов стерилизации на биологические свойства чернозема обыкновенного // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6. С. 721.
15. Малыгина Ю.В., Казеев К.Ш. Восстановление микро-
флоры степных почв после стерилизации сухим жаром при различных температурах // Биологическая диагностика экологического состояния почв Юга России / отв. редактор К.Ш. Казеев. Ростов н/Д, 2010. С. 118-127.
5 сентября 2014 г.
