CC BY
300
УДК 631.41; 631.46
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВ АНТИБИОТИКАМИ ©2013 Ю.В. Акименко, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников, М.С. Мазанко
Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону Поступила 10.06.2013
В модельных экспериментах изучено влияние фармацевтических антибиотиков (бензилпенициллин, фармазин) разных доз 100 мг/кг, 600 мг/кг на численность микроорганизмов и ферментативную активность чернозема обыкновенного. Все исследуемые дозы антибиотиков оказывают достоверное подавляющее воздействие на численность почвенных микроорганизмов и ферменты. Между дозой антибиотиков и изменением биологических показателей почв установлена линейная зависимость. По устойчивости к фармацевтическим антибиотикам исследуемые группы почвенных микроорганизмов образовали ряд (высокие концентрации): амилолитические бактерии > микромицеты > аммонифицирующие бактерии, ферменты: каталаза > дегидрогеназа > фосфатаза.
Ключевые слова: антибиотики, загрязнение, почвенные микроорганизмы, ферментативная активность, чернозем обыкновенный.
В отличие от пестицидов, используемых в сельском хозяйстве, антибиотики до недавнего времени не вызывали особого внимания как потенциальные загрязнители. В российской литературе практически нет исследований по влиянию фармакологических препаратов на биологические свойства почв. Лишь в некоторых исследованиях антибиотики использовались для селективного ингибирования с целью определения соотношения грибов и бактерий в биомассе разных типов почв [2, 13]. На сегодняшний день научный интерес, с одной стороны, сосредоточился на изучении поведения антибиотиков и их «судьбы» в окружающей среде, с другой стороны, на их влиянии на другие организмы. Некоторые антибиотики сохраняются долгое время в окружающей среде, особенно в почве, а другие быстро деградируют [17].
Различные антибиотики часто обнаруживаются в грунтовой и питьевой воде, сточных водах и сельскохозяйственных почвах [21]. Например, фармацевтические антибиотики из класса тетра-циклинов ежегодно обнаруживаются в почвах локально в концентрациях до 300-500 мг/кг, из класса сульфонамидов - до 1000 мг/кг [16]. Антибиотики, широко распространенные в окружающей среде, затрагивают как водные, так и наземные организмы, изменяют активность и состав почвенных микроорганизмов [20] и приводят к развитию бактериальной устойчивости у микроорганизмов [19].
Проведено много исследований, посвященных использованию антибиотиков в растениеводстве и ветеринарии в качестве гербицидов, инсектицидов, стимуляторов роста растений, а также в качестве пищевой добавки для нагула молока, мяса у крупного рогатого скота и для улучшения роста молодняка. К настоящему времени проведен широкий
Акименко Юлия Викторовна, магистрант, старший лаборант, e-mail: akimenkojuliya(a)mail.ni; Казеев Камиль Шаги-дулпович, д.г.н., проф., e-mail: kamil_kazeev(a!mail.ru; Колесников Сергей Ильич, д.с.-х.н., заведующий кафедрой, e-mail: kolesmkov(a!sfedu.ra; Мазанко Мария Сергеевна, аспирант, инженер, e-mail: Mary.bio(a!list.ru
диапазон исследований с целью определения эффектов тяжелых металлов [8, 9], нефти и нефтепродуктов [11], радиоизлучений [6] и других загрязнителей на почвенную микробиоту.
Результаты исследований влияния фармацевтических антибиотиков на микроорганизмы почв изучены мало, а иногда и противоречивы. Например, было сообщено, что некоторые антибиотики подавляют активность почвенных микроорганизмов, установлена зависимость влияния антибиотиков от их концентрации: чем выше доза, тем сильнее эффект [14]. В других исследованиях, напротив, говорится о положительном влиянии антибиотиков на рост и развитие микроорганизмов [16]. Загрязнение почвы сульфахлорридазином приводит к ингибированию численности почвенной микробио-ты, и дальнейшее увеличение концентрации данного антибиотика вызывает развитие устойчивости у микроорганизмов [18].
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния различных фармацевтических антибиотиков на численность почвенных микроорганизмов и ферментативную активность чернозема обыкновенного. Представленная работа является частью цикла научных исследований по изучению влияния биологически активных веществ на эколо-го-биологические показатели почв Юга России.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся чернозем обыкновенный карбонатный мощный слабогуму-сированный тяжелосуглинистый на желто-бурых суглинках, отобранный на территории Ботанического сада Южного федерального университета. Данный тип почв был выбран в связи с тем, что черноземы составляют большую часть почвенного покрова Юга России и имеют особое значение в продовольственном обеспечении страны [4].
Почва для модельных экспериментов была отобрана из пахотного горизонта (0-25 см). Воздушно-сухие образцы почв обрабатывали растворами антибиотиков бензилпенициллина и фармазина в раз-
личных концентрациях: 100 мг/кг, 600 мг/кг почвы. Данные концентрации были выбраны исходя из литературных данных по встречаемости антибиотиков в окружающей среде [16], а также благодаря ранее проведенным исследованиям и получению достоверных влияний разных доз антибиотиков на биологические свойства почв [1]. Все образцы инкубировали в течении 10 сут при температуре 2025 С в темном месте, во избежание быстрого разложения антибиотиков, и оптимальном увлажнении (60% от полевой влагоемкости). Контролем служила почва, не подвергавшаяся обработке антибиотиками.
Для исследования влияния антибиотиков на почвенную микробиоту были выбраны бактерицидный (бензилпенициллин), бактериостатический (фармазин) антибиотики, которые широко используются в медицине и животноводстве. Бензилпенициллин - антибиотик группы биосинтетических пенициллинов, активен в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, анаэробных спорообразующих палочек. Фармазин - препарат, широко используемый в ветеринарии, содержащий в качестве активно действующего вещества тилозин - антибиотик из группы макролидов, активен в отношении большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий [3].
Комплексное исследование микробоценоза чернозема обыкновенного включало определение численности жизнеспособных микроорганизмов методом глубинного посева соответствующих разведений на твердые среды: аммонифицирующих бактерий - на мясо-пептонном агаре, амилолитических бактерий - на крахмало-аммиачном агаре, микро-мицетов - на подкисленной среде Чапека.
При получении аналитических данных, применялась разработанная и апробированная методология исследования биологической активности [7] с использованием общепринятых в почвоведении и биологии методов [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Аммонифицирующие бактерии обеспечивают процессы гниения, разлагая мертвую органику до простых веществ, и, тем самым, играют ключевую роль в круговороте веществ. Амилолитические бактерии составляют значительную долю от общего числа бактерий в почве. Основным отличительным признаком этой группы является способность разрушать крахмал и поставлять питательные элементы другим микроорганизмам почвы. Почвенные микромицеты обладают широкими адаптивными способностями и занимают разнообразные экологические ниши. Микромицеты, составляющие ассоциации на низших фазах трансформации органического вещества почвы, играют важную роль в создании почвенного плодородия [5]. Влияние антибиотиков на численность почвенных микроорганизмов чернозема обыкновенного показано на рис. 1.
Все исследуемые дозы фармацевтических антибиотиков оказали достоверное подавляющее воздействие на численность почвенных микроорганизмов. Наиболее устойчивыми к действию антибиотиков оказались амилолитические бактерии, наименее устойчивыми аммонифицирующие бактерии. При концентрации антибиотиков 100 мг/кг наблюдается значительное подавление численности аммонификаторов до 65% от контроля (р<0,001) (рис. 1А). Что касается амилолитических бактерий, то достоверных изменений их численности по сравнению с контролем не зафиксировано. Как и ожидалось, антибактериальные антибиотики (бензилпенициллин, фармазин) во всех исследуемых концентрациях не вызвали достоверных изменений численности микромицетов. И скорее всего, разница в численности по сравнению с контролем объясняется самим фактом стресса для микробиоты при внесении загрязнителей. Наибольшее подавляющее воздействие на все группы микроорганизмов оказал бензилпенициллин в максимально исследуемых концентрациях (600 мг/кг) (рис. 1В). Бензилпенициллин ингибирует численность аммонификаторов практически на 80% от контроля (р<0,001). Таким образом, бактерицидный препарат бензилпенициллин оказался наиболее эффективен в отношении аммонифицирующих бактерий, а бактериостатический фармазин - в отношении амилолитических бактерий.
Многолетними исследованиями показана максимальная эффективность диагностики и мониторинга почвенного покрова биохимическими методами, в частности, с помощью показателей ферментативной активности почв. Применению ферментативной активности в качестве диагностического показателя способствует низкая ошибка опытов, простота определения, высокая чувствительность к внешним воздействиям [6, 10].
Ранее было показано, что антибиотики из группы тетрациклинов в концентрации 300 мг/кг существенно снижают активность каталазы и фосфатазы в почвах, это снижение колеблется в пределах 3555% от контрольных образцов [15]. В рамках нашего исследования антибиотики во всех исследуемых концентрациях оказали значительное ингибирую-щее воздействие на ферментативную активность чернозема обыкновенного. Влияние антибиотиков на ферментативную активность чернозема обыкновенного показано на рис. 2.
Ферменты класса оксидоредуктаз (каталаза, де-гидрогеназа) оказались наиболее устойчивы к действию антибиотиков, нежели ферменты класса гид-ролаз (фосфатаза). Антибиотики в концентрации 100 мг/кг достоверно повлияли на активность всех исследуемых ферментов (рис. 2А). Наибольший ингибирующий эффект ферментативной активности наблюдается в концентрации антибиотиков 600 мг/кг, активность фосфатазы достоверно снижается на 70% от контроля (р<0,001) (рис. 2В).
Рис. 1. Изменение численности почвенных микроорганизмов при действии антибиотиков в концентрации 100 мг/кг почвы (А), 600 мг/кг почвы (В)
ВЫВОДЫ
1. Все исследуемые дозы фармацевтических антибиотиков оказывают достоверное подавляющее воздействие на численность почвенных микроорганизмов и ферментативную активность чернозема обыкновенного.
2. Степень влияния антибиотиков зависит от их природы и механизма действия. Бактерицидные препараты (бензилпенициллин) наиболее эффективны в отношении аммонифицирующих бактерий, а бактериостатические (фармазин) - в отношении амилолитических бактерий.
3. Между дозой антибиотиков и изменением численности микроорганизмов почв установлена линейная зависимость. Чем выше концентрации вносимых антибиотиков, тем сильнее ингибирую-щий эффект.
4. По устойчивости к фармацевтическим антибиотикам исследуемые группы почвенных микроорганизмов образовали ряд (высокие концентрации): амилолитические бактерии > микромицеты > аммонифицирующие бактерии.
5. По устойчивости к фармацевтическим антибиотикам исследуемые классы ферментов образовали ряд (высокие концентрации): каталаза> де-гидрогеназа > фосфатаза.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (14.А18.21.0187, 14.А18.21.1269) и в рамках
Рис. 2. Изменение ферментативной активности чернозема при действии антибиотиков в концентрации 100
мг/кг почвы (А), 600 мг/кг почвы (В)
реализации Программы развития Южного федерального университета.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш, Колесников СЛ. Динамика ферментативной активности чернозема обыкновенного при загрязнении антибиотиками // Научный журнал КубГАУ. 2013. № 01 (85). С. 578-587. http://ej.kubagro.rii/2013/01/pdf/46.pdf.
2. Ананьева Н.Д., Стольникова Е.В., Сусъян Е.А., Ходжаева А.К. Грибная и бактериальная микробная биомасса (селективное ингибирование) и продуцирование со2 и п2о дерново-подзолистыми почвами постагрогенных биогеоценозов // Почвоведение. 2010. № 11. С. 1387-1393.
3. Базы данных по лекарственным средствам. http://driigreg.rii/Bases/.
4. Вальков В.Ф., Казеев К.Ш., Колесников СЛ. Почвы Юга России. Ростов-на-Дону: Изд-во «Эверест», 2008. 276 с.
5. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. М.: Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.
6. Денисова Т.В., Казеев К.Ш., Колесников СЛ., Вапъков В.Ф. Влияние гамма излучения на биологические свойства почв // Почвоведение. 2005. № 7. С. 877-881.
7. Казеев К.Ш., Колесников СЛ. Биодиагностика почв: методология и методы исследований. Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета, 2012.260 с.
8. Колесников СЛ., Казеев К.Ш., Вапъков В.Ф. Влияние загрязнения тяжелыми металлами на микробную систему чернозема // Почвоведение. 1999. № 4. С. 505511.
9. Колесников СЛ., Казеев К.Ш., Вальков В.Ф. Влияние загрязнения тяжелыми металлами на щелочно-кислотные и окислительно-восстановительные условия в черноземе обыкновенном // Агрохимия. 2001. № 9. С. 54-59.
10. Колесников СЛ., Казеев К.Ш., Татосян М.Л., Вапъков В.Ф. Влияние загрязнения нефтью и нефтепродуктами на биологическое состояние чернозема обыкновенного //Почвоведение. 2006. № 5. С. 616-620.
11. Колесников СЛ., Спивакова Н.А., Везденеева Л.С., Кузнецова Ю.С., Казеев КШ. Моделирование влияния химического загрязнения на биологические свойства гидроморфных солончаков зоны сухих степей Юга России // Аридные экосистемы. 2011. Т. 17. № 2 (47). С. 18-22.
12. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-воМГУ. 1991. 304 с.
13. Сусъян Е.А., Ананьева Н.Д., Благодатская Е.В. Разделение грибного и бактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков в почвах разных экосистем // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 394-400.
14. Colinas С., Ingham Е., Molina R. Population responses of target and non-target forest soil-organisms to selected biocides // Soil Biol. Biochem. 1994. V. 26. P. 41-47.
15. Feng Liu, Guang-Guo Ying, Ran Tao, Jian-Liang Zhao, Ji-Feng Yang, Lan-Feng Zhao. Effects of six selected antibiotics on plant growth and soil microbial and
enzymatic activities // Environmental Pollution. 2009. V. 157. P. 1636-1642.
16. Hamscher G., Sczesny S., HoperH., Nau H. Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 1509-1518.
17. Rooklidge S.J. Environmental antimicrobial contamination from terraccumulation and diffuse pollution pathways // Science of the Total Environment. 2004. V. 325. P. 1-13.
18. Schmitt H., van Beelen P., Tolls J., van Leeuwen C.L. Pollution-induced community tolerance of soil microbial communities caused by the antibiotic sulfachloropyridazine //Environ. Sci. Technol. 2004. V. 38. P. 1148-1153.
19. Su H.-C., Ying G.-G., Tao R., Zhang R.-O., Zhao J.-L., Liu Y.-S. Class 1 and 2 integrons, sul resistance genes and antibiotic resistance in Escherichia coli isolated from Dongjiang River, South China // Environ Pollut. 2012. V. 169. P. 42-49.
20. Underwood J.C., Han>ey R. W., Metge D. W., Repert D.A., Baumgartner L.K., Smith R.L. et al. Effects of the antimicrobial sulfamethoxazole on groundwater bacterial enrichment // Env. Sci. Techn. 2011. V. 45. P. 3096-4101.
21. Zhou L.-J., Ying G.-G., Zhao J.-L., Yang J.-F., Wang L., Yang B. et al. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hai River and Liao River in northern China // Environ Pollut. 2011. V. 159. P. 1877-1885.
ECOLOGICAL CONSEQUENCES OF POLLUTION OF SOILS ANTIBIOTICS €2013 Yu.V. Akimenko, K.Sh. Kazeev, S.I. Kolesnikov, M.S. Mazanko
South Federal University, Rostov-na-Donu
hi model experiments influence of pharmaceutical antibiotics (benzylpenicillin, pharmazin) different doses of 100 mg/kg, 600 mg/kg on the number of microorganisms and enzymes activity of the chernozem is studied. All studied doses of antibiotics make reliable overwhelming impact on the number of soil microorganisms and enzymes. Between a dose of antibiotics and change of biological indicators of soils linear dependence is established. On resistance to pharmaceutical antibiotics studied groups of soil microorganisms formed a row (high concentration): amylolytic bacteria > micromycetes > ammonifying bacteria and enzymes: catalase > dehydrogenase > phosphatase.
Key words: antibiotics, pollution, soil microorganisms, enzymes activity, chernozem ordinary.
Julia Akimenko, postgraduate student, e-mail: akimenkojuliya(S)mail.ru; Camille Kazeev, Doctor of Geography, professor, e-mail: kamil_kazeev(S)mail.ru; Sergey Kolesnikov, Doctor of Agriculture, head of department, e-mail: kolesnikov(S)sfedu.ru; Maria Mazanko, postgraduate student, engineer, e-mail: Mary.bio(S)list.ru
