CC BY
24БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 22 (61). 2009. № 2. С. 3-8.
УДК 581.193.582.594
ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОПТИМИЗАЦИЮ ПРОЦЕССА ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН CEPHALANTHERA DAMOSONIUM (MILL.) DRUCE (ORCHIDACEAE)
Астапенко Н.А.
Представлены результаты исследований по влиянию факторов оптимизации питательной среды на процессы прорастания семян Cephalanthera damosonium. Установлена зависимость скорости прорастания семян от концентрации сахарозы в среде. Показана необходимость детального изучения динамики накопления запасных метаболитов семени для повышения эффективности семенного асимбиотического размножения.
Ключевые слова: Cephalanthera damosonium, питательная среда, семенное асимбиотическое размножение.
ВВЕДЕНИЕ
В связи с проблемой сокращения видового разнообразия актуален вопрос семенного асимбиотического размножения орхидных. В настоящее время накоплен достаточно большой опыт выращивания тропических и субтропических орхидей [1 - 3]. Однако остаются нерешенными проблемы культивирования ряда орхидных умеренной зоны. Успешное культивирование семян орхидных в условиях in vitro во многом зависит от сбалансированного состава питательной среды, содержащей макро и микроэлементы, углеводы, витамины и регуляторы роста в нужном количестве. В связи с этим целью работы являлось изучение влияния факторов питательной среды на оптимизацию процесса прорастания семян Cephalanthera damosonium (Mill.) Druce.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследований служили семена из зрелых плодов Cephalanthera damosonium (Mill.) Druce. В работе применяли общепринятые методы культуры изолированных тканей и органов растений [4]. В качестве стерилизующего агента использовали 3 % перекись водорода, выдерживая в ней семена в течение 3 суток перед посадкой. После обработки семена промывали стерильной дистиллированной водой [5].
В исследованиях использовали три варианта среды Кнудсона [2] и модификацию среды FN [6] (табл. 1). Модифицированные среды Кнудсона содержали гумат натрия (50 мл/л), активированный уголь (1 г/л) и различались по концентрации сахарозы (Кнудсон С - 20 г/л, Кнудсон С-1 - 10 г/л, Кнудсон С-2 - 50 г/л). Культивирование семян проводили в культуральных сосудах в термостате с температурой +20 - +25°С, а затем в фитолюминистате ФСЛ-В с освещением 1-3 тыс. люкс при температуре +20 - +25 °С с фотопериодом 16 часов. Чтобы оценить влияние исследуемых факторов оптимизации питательной среды на скорость прорастания семян, каждые сутки, начиная с первых суток культивирования, семена отбирали для приготовления временных препаратов. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по общепринятым методам [7].
Таблица 1.
Компоненты используемых вариантов питательных сред
Компонент среды Питательная среда
Кнудсон С Кнудсон С-1 Кнудсон С-2 FN - мод.
Са(Шз)2 . 4H2O 1000 мг/л 44 мг/л
(NH4)2SO4 500 мг/л -
KH2PO4 250 мг/л 20 мг/л
MgSO4.7H2O 250 мг/л 20 мг/л
FeSO4. 7H2O 27,8 мг/л 14 мг/л
MnSO4. 4H2O 7,5 мг/л -
Гумат натрия - 50 мг/л -
Активированный уголь - 1000 мг/л
Сахароза 20000 мг/л 10000 мг/л 50000 мг/л 10000 мг/л
Агар 8000 мг/л
NH4NO3 - 40 мг/л
KCl - 20 мг/л
Трилон «Б» - 19 мг/л
Гидролизат казеина - 700 мг/л
Сухой дрожжевой экстракт - 800 мг/л
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно литературным источникам, успех культивирования семян орхидных зависит не только от состава питательных сред и условий культивирования, но и от стадии развития зародыша [1, 8, 9]. Формирование в семенах большинства орхидных недифференцированных на органы зародышей и подавление развития эндосперма обусловливает накопление основного количества запасных питательных веществ непосредственно в тканях самого зародыша. Проведенные гистохимические исследования позволили установить определенные закономерности накопления крахмала и липидов на отдельных этапах эмбриогенеза и постсеменного развития некоторых видов орхидей [10].
Так, на ранних этапах формирования семени основным метаболитом является крахмал, тогда как в полностью созревших семенах преобладают вещества липидной природы [10, 11]. Экспериментальные данные показывают, что запасной крахмал служит резервом субстратов и энергии для биосинтеза липидов. Ряд авторов [1, 5, 8, 9] в своих работах отмечают, что в период зрелости плода-коробочки семена уже находятся в состоянии глубокого покоя и поэтому не прорастают в течение длительного времени. При этом семена, взятые из зеленых коробочек, прорастают намного быстрее. Следовательно, липиды являются основным веществом периода покоя семян. В процессе прорастания наблюдается обратная динамика: уменьшение количества липидов и увеличение крахмальных зерен.
Если допустить, что для преодоления состояния покоя семян необходимо восстановить соотношение крахмал - липиды в пользу крахмала, то нужно подобрать оптимальную концентрацию внешнего источника углеводов. Углеводы в составе питательной среды выполняют две функции - являются источником энергии и строительным материалом для процессов жизнедеятельности зародышей в культуре, и, кроме того, обеспечивают необходимые осмотические свойства среды. Проведенные многими авторами исследования по изучению влияния сахаров на зародыши показали, что лучшим источником углерода для зародышей является сахароза [12]. В литературе также имеются данные о различном влиянии сахаров на зародыши в зависимости от их концентрации, в связи с чем основной акцент модификаций используемых нами питательных сред заключался в различном содержании сахарозы: Кнудсон С-1 и модифицированная среда КК - 10 г/л; Кнудсон С - 20 г/л; Кнудсон С-2 - 50 г/л.
В процессе культивирования семян на питательной среде можно выделить следующие этапы прорастания: набухание семян, начало протокормообразования, массовое протокормообразование и появление ювенильных растений. Полученные в результате эксперимента данные показывают, что концентрация сахарозы в питательной среде оказывает существенное влияние на скорость прорастания семян, то есть на время наступления определенного этапа прорастания и его протяженность (рис. 1; табл. 2).
к
я =
се н и се а о а в
н =
о И о а
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
2 5 10 15 20 25
Сроки культивирования, сутки
□ Кнудсон С
□ Кнудсон С-1
□ Кнудсон С-2
□ FN - мод
0
Рис. 1. Влияние сахарозы различной концентрации на скорость прорастания семян С. damosonium.
Таблица 2.
Влияние концентрации сахарозы на скорость прорастания семян С. damosonium (количество набухших семян от общего количества высеянных
на среду, в %)
Вариант питательной среды Сутки культивирования
2 5 10 15 20 25
Кнудсон С 10 % 25 % 35 % 50 % 70 % 100 %
Кнудсон С-1 10 % 25 % 50 % 100 %
Кнудсон С-2 2 % 5 % 7 % 10 % 15 % 15 %
БМ -мод. 10 % 25 % 50 % 70 % 100 %
При культивировании семян С. damosonium на четырех представленных вариантах сред были отмечены существенные различия скорости прорастания. Начиная с 5 суток культивирования, интенсивное набухание наблюдалось у семян на всех вариантах питательных сред, кроме среды Кнудсон С-2. На этом варианте среды слабое набухание (7 - 10 %) начиналось на 12 - 15 сутки культивирования, после чего процесс прорастания приостановился. На стандартной среде Кнудсон С интенсивное набухание длилось до 20 - 25 суток культивирования (70 - 100 %), затем формировались первичные протокормы. Наиболее быстрое прорастание
наблюдалось у семян, высаженных на среду Кнудсон С-1. Так, уже на 7 - 10 сутки культивирования набухало 50 % семян, а на 15 сутки происходило формирование протокормов. На среде FN модифицированной получены аналогичные результаты до 10 - 15 суток культивирования, затем скорость прорастания замедлялась по сравнению со средой Кнудсон С-1, причиной чему, возможно, послужил более сложный состав среды FN.
Эти результаты можно объяснить, сопоставив полученные данные с данными о динамике метаболитов в процессе формирования и прорастания семян орхидных. В таком случае, средняя скорость прорастания семян на стандартной среде Кнудсона С объясняется достаточным количеством углеводов для восстановления необходимого соотношения метаболитов. Максимальная интенсивность прорастания в варианте модификации Кнудсон С-1, возможно объясняется тем, что такое небольшое количество углеводов не только превышает необходимый порог, но и стимулирует превращение запасных липидов в крахмал, тем самым, обеспечивая быстрый выход из периода покоя. Замедленное прорастание на среде Кнудсон С-2 вероятно связано с превышающим норму количеством углеводов, для утилизации которых происходит их превращение в вещества липидной природы, что препятствует выведению семян из состояния покоя.
Таким образом, полученные результаты создают предпосылку для детального изучения динамики накопления запасных метаболитов в процессе формирования и прорастания семян орхидных и определения оптимальной стадии их развития для введения в культуру in vitro. Это позволит повысить эффективность метода семенного асимбиотического размножения.
ВЫВОДЫ
1. Показано влияние концентрации сахарозы в питательной среде на скорость прорастания семян C. damosonium.
2. Выдвинута гипотеза, объясняющая зависимость скорости прорастания семян C. damosonium от динамики запасных метаболитов семени.
3. Показана необходимость детального изучения динамики накопления запасных метаболитов в процессе формирования и прорастания семян орхидных и определения оптимальной стадии их развития для введения в культуру in vitm.
Список литературы
1. Поддубная-Арнольди В. А. Орхидеи и их культура / В. А. Поддубная-Арнольди, В. А. Селезнева. - М.: АН СССР, 1957. - 174 с.
2. Черевченко Т. М. Орхидеи в культуре / Т. М. Черевченко, Г. П. Кушнир. - К.: Наук. думка, 1986. - 200 с.
3. Шосер Г. Орхидеи. Выращивание в домашних условиях. Разведение и уход / Шосер Г. - М.: Интербук-бизнес, 1997. - 132 с.
4. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. - К.: Наук. думка, 1980. - 488 с.
5. Куликов П. В. Симбиотическое прорастание некоторых нетропических орхидных in vitro / Куликов П. В., Филиппов Е. Г. // Охорона i культивування орхщей: м1жнар. наук. конф., 15 - 18 сентября 1999 г. : тези доп. - К., 1999. - С. 57 - 58.
6. Батыгина Т. Б. Размножение растений / Батыгина Т. Б., Васильева В. Е. - СПб.: С.-Петерб. ун-т, 2002.- 232 с.
7. Лакин Г. Ф. Биометрия / Лакин Г. Ф. - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.
8. Андронова Е.В. Эмбриогенез и постсеменное развитие орхидных (на примере Dactylorhiza baltica, D. Incarnate, Thunia marschalliana, Bletilla striata): автореф. дисс. на соискание учен. степени канд. биол. наук : спец. 03.00.05 «Ботаника» / Е.В. Андронова. - Л., 1988. - 24 с.
9. Андронова Е. В. Эмбриогенез орхидных / Андронова Е. В. // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции / [ред. Батыгина Т. Б. ]. - СПб.: Мир и семья, 1997. - Т.3. - С. 544 - 556.
10. Шевцова Г. Г. Развитие репродуктивных структур Cymbidium hybridum Hort. и Dactylorhiza maculate L. (Soo) в культуре in vitro: автореф. дисс. на соискание учен. степени канд. биол. наук : спец. 03.00.05 «Ботаника» / Г. Г. Шевцова. - Кишинев, 1989. - 25 с.
11. Теплицкая Л. М. Гистохимические исследования запасных веществ в тканях зародыша орхидных в процессе созревания семени / Теплицкая Л. М., Бугара А. М. // Охрана и культивирование орхидей: междунар. науч. конф., 6 - 8 октября 2003 г. : тезисы докл. - Х., 2003. - С. 59 - 60.
12. Здруйковская-Рихтер А. И. Эмбриокультура изолированных зародышей, генеративных структур и получение новых форм растений / Здруйковская-Рихтер А. И. - Ялта: Никитский Бот. Сад, 2003 - 368 с.
Астапенко Н.А. Вплив чинниюв оптимшзацй живильного середовища на процеси проростання насшня Cephalanthera damosonium (Mill.) Druce (Orchidaceae) // Вчеш записки Тавршського национального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Серш „Бюлогш, х1мпя". - 2009. - Т. 22 (61). - № 2. - С. 3-8.
Представлен результата дослщжень по впливу чинниюв оптим1зацп живильного середовища на процеси проростання насшня Cephalanthera damosonium. Встановлена залежшсть швидкоста проростання насшня вщ концентрацй сахарози в середовищ^ Показана необх^дтсть детального вивчення динамжи накопичення запасних метаболтв насшня для тдвищення ефективноста насшневого асимбютичного розмноження.
Ключовi слова: Cephalanthera damosonium, живильне середовище, насшне асимбiотичне розмноження.
Astapenko N.A. Influence of optimization's factors of nutrient medium on the processes of Cephalanthera damosonium (Mill.) Druce (Orchidaceae) seed's germination // Uchenye zapiski Tavricheskogo Natsionalnogo Universiteta im. V. I. Vernadskogo. Series «Biology, chemistry». - 2009. -V.22 (61).- №2.- P. 3-8.
The results of researches on influence of optimization's factors of nutrient medium on the processes of Cephalanthera damosonium seed's germination are represented. Dependence of speed of seed's germination on the concentration of sucrose in a medium is set. It is shown the necessity of the detailed study of dynamics of seed's metabolites accumulation for the increase of efficiency of seed asymbiotic reproduction. Keywords: Cephalanthera damosonium, nutrient medium, the seed asymbiotic reproduction.
Поступила в редакцию 06.05.2009 г.
