CC BY
103
УДК 538.122:579.86.2+616-092.4
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ ВЫСОКОЙ ЧАСТОТЫ НА РОСТ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Сергей Александрович ЕРОФЕЕВ1, Александр Витальевич ПРИТЫКИН1,
Наталья Владимировна ТЕМНИКОВА1, Татьяна Дмитриевна СОЛОВЬЕВА2, Борис Альбертович РЕЙС1
'ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Росздрава 644043, г. Омск, ул. Ленина, '2
2Клинический медико-хирургический центр МЗ Омской области 644007, г. Омск, ул. Булатова, '05
Целью нашей работы являлась оценка влияния переменного электромагнитного поля высокой частоты, генерируемого аппаратом «Ореол-2», на клетки Staphilococcus aureus. Исследования проводились in vitro и in vivo. В опытах in vitro использовались лабораторные штаммы бактерий и культуры стафилококка, выделенные от больных. В опытах in vivo исследование проводили на 48 здоровых беспородных половозрелых кроликах. Животные были разбиты на 2 группы по 24 кролика в каждой. У всех животных с соблюдением правил асептики создавали стандартный дефект костной ткани диафиза лучевой кости левой грудной конечности. В область дефекта животным обеих групп вводили суспензии культур St. aureus. В опытной группе эксперимента на оперированную конечность проводилось воздействие аппаратом стимуляции репаративных процессов «Ореол-2», генерирующим электромагнитное поле высокой частоты. Результаты опыта оценивались по клиническим и микробиологическим данным. Проведенное в лабораторных условиях in vitro исследование не выявило ни угнетающего, ни стимулирующего влияния на золотистый стафилококк переменного электромагнитного поля высокой частоты. Из анализа данных исследований, проведенных на животных, сделан вывод о положительном влиянии аппарата «Ореол-2» на процессы регенерации костной ткани, микроциркуляции и мобилизации резервных возможностей организма.
Ключевые слова: кролики, золотистый стафилококк, электромагнитное поле высокой частоты.
Лечение пациентов с повреждениями опорно-двигательного аппарата, осложненными гнойной раневой инфекцией, в настоящее время является одной из наиболее актуальных и нерешенных проблем современной травматологии [1]. Причиной тому являются изменение свойств и характера возбудителей гнойной инфекции, которые обнаруживают устойчивость ко многим применяемым антибактериальным средствам, недостаточная иммунологическая реактивность, возросшее количество сложных и длительных операций и т. д. В этих условиях многие общепринятые и признанные методы лечения часто оказываются малоэффективными, и возникает настоятельная необходимость в их усовершенствовании, разработке новых методов и средств с использованием новейших научно-технических достижений. Одним из них является так называемый «информационный» метод воздействия, реализующийся путем применения электромагнитного излучения (ЭМИ) [2].
Согласно данным литературы [3—5], лечебное действие ЭМИ связано с управлением восстанови-
тельными процессами и мобилизацией собственных резервных возможностей организма. Такое понимание механизма лечебного действия миллиметрового излучения делает целесообразным его применение в комплексном лечении больных с гнойной раневой инфекцией, однако число публикаций в данной области незначительно, и они в основном связаны с использованием ЭМИ на фиксированных частотах. Установлено [3], что антимикробное действие ЭМИ реализуется не за счет прямого влияния на патогенную микрофлору, а опосредованным путем — посредством усиления общей реактивности организма и улучшения жизнеспособности тканей в области раны. Положительные клинические результаты получены в работах [6, 7], где впервые были рассмотрены вопросы лечения длительно незаживающих ран, гнойных заболеваний пальцев кисти и гнойно-септических заболеваний у детей с использованием низкоинтенсивного ЭМИ крайне высокой частоты с шумовым спектром, генерируемого аппаратом «АМФИТ-0,2/10-01» [8].
Ерофеев С.А. — д.м.н., доцент кафедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; e-mail: esa_rncvto@mail.ru
Притыкин А.В. — аспирант кафедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; e-mail: esa_rncvto@mail.ru
Темникова Н.В. — к.м.н, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Соловьева Т.Д. — врач высшей категории, зав. лаборатории клинической микробиологии Рейс Б.А. — д.м.н., зав. лаборатории экспериментальной медицины
В травматологии и ортопедии применение ЭМИ в основном направлено на процессы стимуляции репаративной регенерации костной ткани [2, 9] и используется после полной санации очага.
В связи с вышеизложенным нами была поставлена цель — оценить влияние переменного электромагнитного поля высокой частоты, генерируемого аппаратом «Ореол-2», на микробные клетки St. aureus.
Материал и методы
При проведении исследования применялся аппарат стимуляции репаративных процессов (АСРП) «Ореол-2» [10] (заключение Комитета по новой медицинской техники МЗ РФ, протокол № 6 от 27.06.2001).
В опытах in vitro использовались 3 лабораторных тест-штамма бактерий, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тара-севича (лиофилизированные эталонные культуры St. aureus). Кроме того, исследовались 7 культур стафилококка, выделенных от больных с остеомиелитом и послеоперационными осложнениями. В целом в 30 опытах in vitro было выполнено облучение 10 различных штаммов стафилококка в 3-кратных повторах.
Взятие биоматериала проводилось до начала лечения антибиотиками при помощи стерильного ватного тампона или стерильного зонда из раневого канала на жидкую транспортную питательную среду, содержащую все необходимые питательные вещества для сохранения микрофлоры. Применяли стандартную микробиологическую методику, предотвращающую контаминацию другими микроорганизмами. Образцы отбирали, удалив излишек гноя и тканей. Доставка в лабораторию осуществлялась в сроки, составляющие не более 2 часов с момента взятия материала.
Комплексное обследование включало количественный посев на расширенный набор питательных сред (жидкие и плотные питательные среды) для стафилококков, предусматривающий выделение золотистого стафилококка с раститровкой материала.
Перед началом эксперимента по изучению воздействия АСРП делали соответствующие разведения микробной культуры стафилококка 10-4, 10-5 и 10-6 КОЕ/мл на физиологическом растворе, используя стандарт мутности по Мак-Фарленду, представляющий собой взвесь мельчайших частиц пирекс-стекла в дистиллированной воде. При помощи него производили оптическую стандартизацию микробных взвесей эталонных и клинических штаммов для испытания действия прибора. Значения мутностей взвесей эталонных микроорганизмов переводили в количество микробов в 1 мл (КОЕ/мл). Тест-штаммы St. aureus из ампул или клинические штаммы со среды хранения пересевали на чашку Петри по ГОСТу 25336-82Е с
питательным агаром и инкубировали в термостате сутки. Выросшую на питательной среде культуру каждого тест-штамма St. aureus проверяли на чистоту роста и пересевали в пробирку со скошенным агаром. Затем делали смывы 0,9%-ным раствором NaCl с односуточных посевов эталонных культур. Доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандарту мутности (ОСО 42-28-85П) соответствующего года выпуска. Полученные взвеси путем десятикратной расти-тровки (4,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10-3. В процессе разведения взвеси в следующую пробирку производили перенос новой стерильной пипеткой вместимостью 1 мл 2 класса точности по ГОСТу 20292-74Е, таким образом получая последовательные разведения от 10-3 до 10-6 КОЕ/мл.
В опытной группе проводили облучение культуры в пробирках с помощью прибора «Ореол-2», который генерирует электромагнитное поле, образованное синусоидальным сигналом с несущей частотой в диапазоне частот 0,3—1,0 мГц или амплитудно-модулированным низкочастотным сигналом в диапазоне частот 10—1000 Гц. Процедуры выполнялись 2 раза в день в течение 5 дней, длительность процедуры составляла 30 мин. Расстояние между обмоткой излучателя и объектом составляло 5 см и не изменялось в течение эксперимента. Более продолжительное воздействие на культуры стафилококка не являлось корректным вследствие гибели культуры.
Облученные микробные культуры стафилококка (в жидкой среде) в концентрации10-4, 10-5 и 10-6 КОЕ/мл засевали штрихами с использованием калиброванной петли на чашки Петри с кровяным и молочно-желточно-солевым агарами. Рост культуры на чашках происходил в термостате при +37 °С в течение 24 часов. Учитывали скорость роста и выход микробной массы путем подсчета видимых невооруженным глазом колоний на каждой питательной среде. Далее оценивали рост микробной культуры St. aureus количественным методом (подсчитывали количество выросших колоний в одном секторе, переводя данные в %).
В качестве контроля использовались те же культуры стафилококка и в тех же разведениях с последующими высевами на кровяные и молочно-желточно-солевые агары, но без предварительного облучения аппаратом.
В опытах in vivo исследование проводили на 48 здоровых беспородных половозрелых кроликах, подобранных по принципу аналогов: вес — 1,5—2,0 кг, возраст — 4—5 мес. Исследования выполнялись с соблюдением принципов гуманности (заключение локального этического комитета Омской государственной медицинской академии от 04.09.2009), изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), Хельсинкской декларации.
Животные были разбиты на 2 группы по 24 кролика в каждой. У всех животных с соблюдением правил асептики создавали стандартный дефект костной ткани диафиза лучевой кости левой грудной конечности. Перед операцией кроликов выдерживали на 12-часовой голодной диете. После обездвиживания 2%-ным раствором рометара в дозе 0,2 мл/кг живой массы животных фиксировали в боковом положении на операционном столе Виноградова. По месту разреза проводили инфильтрационную анестезию 0,5%-ным раствором новокаина. Оперативный доступ к диафизу лучевой кости определяли с краниомедиальной стороны предплечья. Разрез кожи и фасции осуществляли между передним краем круглого про-натора и задним краем лучевого разгибателя запястья. Отпрепаровав лучевую кость, создавали стандартный дефект длиной 5 мм с помощью разработанных щипцов хирургических для создания дефекта на лучевой кости у животных в эксперименте [11] (рис. 1). В область дефекта животным обеих групп вводили по 0,5 мл суспензии выделенных от больных культур St. aureus в концентрации 10-4 КОЕ/мл, полученных путем приготовления соответствующих разведений с использованием стандарта мутности бактериальной взвеси по Мак-Фар ленду. В качестве стандарта мутности был использован комплект БАК-5 (паспорт СОГ № 1-98 ЗАО «Ормет», Екатеринбург) с оптической плотностью, имитирующей взвесь St. aureus 5,5 х 109 КОЕ/мл, которую путем десятикратной раститровки доводили до 10-4 КОЕ/мл.
Оперированную рану зашивали, дренировали резиновым выпускником, накладывали асептическую повязку. Внешнюю иммобилизацию конечности не проводили. Раны у кроликов в послеоперационный период ежедневно обрабатывали раствором спиртового хлоргексидина.
Рис. 1. Рентгенограмма стандартного
послеоперационного дефекта лучевой кости кролика
После операции кроликам первой (опытной) группы производили воздействие прибором АСРП на оперированную конечность 2 раза в день в течение 15 суток, длительность процедуры составляла 30 минут (методика В.К. Носкова) [2]. У кроликов второй (контрольной) группы заживление дефекта происходило в естественных условиях.
Перед началом постановки и до завершения эксперимента осуществляли наблюдение за клиническим состоянием животных путем визуального осмотра, измерения температуры тела, измерения объема и опороспособности конечности. Измерение величины отека оперированной конечности проводили при помощи капроновой нити, с перенесением размера на сантиметровую линейку. Посевы из ран у животных брали ежедневно, до получения стерильного материала. По результатам антибиотикограмм животным обеих групп проводили антибиотикотерапию.
Статистический анализ осуществлялся с использованием пакетов «STATISTICA-6», «БИОСТАТИСТИКА», программы «Microsoft Excel». Средние выборочные значения количественных признаков приведены в тексте в виде M ± SE, где M — среднее выборочное, SE — стандартная ошибка среднего. Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
При воздействии ЭМИ на культуры золотистого стафилококка в течение 5 дней с пересевом их на кровяной агар и оценкой роста было установлено, что во всех облученных культурах St. aureus и во всех разведениях отмечался рост микроорганизмов. В то же время в контрольной серии опытов на культурах St. aureus в тех же разведениях, но не подвергавшихся облучению АСРП, отмечался такой же рост микробной биомассы. При этом количественные характеристики роста культур (количество выросших колоний в одном секторе и процент биомассы) практически не различались в опыте и в контроле (табл.).
Таким образом, не отмечено ни угнетающего, ни стимулирующего влияния электромагнитного поля высокой частоты на жизнедеятельность золотистого стафилококка.
В исследованиях in vivo при первичном клиническом осмотре в первые дни после операции у всех кроликов отмечалось проявление общей реакции организма на травму и введение суспензии St. aureus в виде повышения температуры тела до 39,0—39,5 °С, потери аппетита. На следующий день в области предплечья оперированной конечности наблюдали болезненный разлитой отек мягких тканей (рис. 2), патологическую подвижность отломков, повышение местной температуры, гиперемию, появление раневого экссудата. Кролики большую часть времени находились в положении лежа, при движении хромали и щадили больную
Таблица
Исследование влияния АСРП на скорость роста и количество микробной массы St. aureus
Штамм St. aureus Микробная нагрузка
1 х 10-4 КОЕ/мл 1 х 10-5 КОЕ/мл 1 х 10-6 КОЕ/мл
контроль опыт контроль опыт контроль опыт
Музейные штаммы кафедры 100 % 98 % 100 % 100 % 98 % 100 %
Клинический штамм № 389 73 % 65 % 72 % 70 % 95 % 94 %
Клинический штамм № 375 70 % 69 % 68 % 70 % 75 % 65-75 %
Клинический штамм № 390 93 % 85 % 92 % 90 % 98 % 96 %
Клинический штамм № 376 70 % 68 % 78 % 79 % 88 % 75 %
Клинический штамм № 1022 73 % 75 % 70 % 70 % 75 % 79 %
Клинический штамм № 54 93 % 95 % 92 % 90 % 95 % 95 %
Клинический штамм № 55 90 % 88 % 91 % 90 % 89 % 91 %
конечность. Первые трое суток гипертермия тела сохранялась до 39,0 °С, затем имела тенденцию к снижению. У кроликов второй группы на 14 сутки после операции был выраженный отек мягких тканей (8,42 ± 0,06 см). При движении животные полностью щадили поврежденную конечность, сохранялась патологическая подвижность. В ране развился гнойный воспалительный процесс. Кролики опытной группы частично опирались на поврежденную конечность, наблюдалась хромота опирающейся конечности, сохранялась болевая реакция и отечность в области перелома (8,22 ± 0,03 см), незначительное гнойное отделяемое. К 21 суткам кролики контрольной группы осторожно опирались на поврежденную конечность, поджимали конечность под себя, наблюдалась хромота опирающейся конечности, сохранялись болевая реакция, гнойное отделяемое из раны и отечность сегмента (7,73 ± 0,04 см) в области перелома. В 50 % случаев конечность принимала вынужденное положение — развивалась сгибательная контрактура в смежных суставах. Животные опытной группы на 21 сутки в 70—80 % случаев нагружали конечность, отмечались незначительная хромота, уменьшение отделяемого из раны и тенденция к снижению отека конечности (7,15 ± 0,04 см) (рис. 2). Полное заживление гнойной раны у кроликов опытной группы под струпом происходило на 28 день, на фоне существенного снижения отека (5,18 ± 0,03 см). ¡Полная опоро-способность оперированной конечности восстанавливалась на 35—40 сутки эксперимента. У кро-
ликов контрольной группы до 50 суток, несмотря на проводимую антибиотикотерапию, продолжалось выделение гнойного отделяемого, сохранялась отечность конечности (5,93 ± 0,05 см), в сравнении с опытной группой, где объем конечности приближался к исходным значениям (4,6 ± 0,05 см). Полное заживление гнойной раны в контрольной группе происходило под струпом на 50—60 день, а опороспособность конечности восстанавливалась на 60—70 сутки только у части животных.
Таким образом, клинически выздоровление животных при воздействии генерируемым АСРП электромагнитным полем высокой частоты проявилось на 28 сутки, полная опороспособность вос-
Рис. 2. Динамика выраженности отека, * — значения
в опыте, достоверно отличающиеся от значений в контроле
станавливалась к 35 дню. В контрольной группе состояние нормализовалось только к 50—60 дню, а купирование отека и опороспособность оперированной конечности — к 60—70 суткам эксперимента.
Выводы
1. Анализ полученных экспериментальных данных доказал, что электромагнитное поле высокой частоты положительно влияет на процессы регенерации костной ткани, микроциркуляции и мобилизации резервных возможностей организма.
2. Проведенное в лабораторных условиях in vitro исследование не выявило угнетающего и стимулирующего влияния на золотистый стафилококк переменного электромагнитного поля высокой частоты, образованного аппаратом «Ореол-2».
Список литературы
1. Каплан А.В., Лебедев В.И., Пажарнский В.Ф. Профилактика и проблема риска гнойных осложнений при открытых переломах // Профилактика и лечение гнойной инфекции при механических травмах различной локализации: Материалы Все-союз. конф. М., 1985. 73-79.
Kaplan A.V., Lebedev V.I., Pajarnskiy V.F. Preventive and risk of pus complication in open fractures cases // Pus infection preventive and treatment in mechanical injury of different localization cases: conference materials. M., 1985. 73-79.
2. Носков В.К. Стимуляция остеогенеза в комплексе хирургической реабилитации больных с хроническим остеомиелитом: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Омск, 2003.
Noskov V.K. Osteogenesis stimulation in complex surgical rehabilitation of chronical osteomyelitis patients: dis. abstract. Omsk, 2003.
3. Каменев Ю.Ф., Саркисян А.Г., Уразгильде-ев З.И. и др. Лечение осложненных гнойной инфекцией повреждений конечностей с использованием миллиметровых волн // Международный симпозиум «Миллиметровые волны нетепловой интенсивности в медицине»: сб. докл. М.: ИРЭ АН СССР, 1991. 21-25.
Kamenev Y.F., Sarkisyan A.G., Urzagil'deev Z.I. The injury with pus infection treatment and using of millimeter waves // Int. Symp. «Millimeter waves in medicine»: reports. M.: IRE AN SSSR, 1991. 21-25.
4. Матросов Н.И. Влияние миллиметровых волн на иммунологическую реактивность организма и заживление гнойных ран // 12 Рос. симп. с междунар. участием «Миллиметровые волны в медицине и биологии»: сб. докл. М.: ИРЭ РАН, 2000. 9-12.
Matrosov N.I. Millimeter waves influence on im-munological react and pus injures heal // 12 Rus. symp. with Int. Participation «Millimeter waves in medicine and biology»: reports. M.: IRE RAN, 2000. 9-12.
5. Струсов В.В., Уткин Д.В., Дремучев В.А. Хирургические аспекты применения КВЧ-терапии // Миллиметровые волны в биологии и медицине. 1995. (6). 48-49.
Strusov V.V., Utkin D.V., Dremchuev V.A. Surgical aspects of using EHF-therapy// Millimtrovye volny v biologii i meditsine. 1995. (6). 48-49.
6. Логинов В.И., Потеенко А.В., Кондратов Ю.М. Эффективность применения КВЧ-те-рапии у больных с длительно незаживающими ранами // Научно-практич. конф. «Актуальные проблемы современной клинической медицины»: тез. докл. Подольск, 2001. 131.
Loginov V.I., Poteenko A.V., Kondratov Y.M. Effectiveness of EHF-therapy in not heal wounds cases // Sci.-Pract. Conf. «Actual problems of clinical medicine»: reports. Podol'sk, 2001. 131
7. Потехин В.А., Потехина Н.Н., Балчугов В.А. КВЧ-терапия в лечении и профилактике гнойно-септических осложнений при операции кесарева сечения // Миллиметровые волны в биологии и медицине. 2002. (1). 54-56.
Potehin V.A., Potehina N.N., Balchugov V.A. EHF-therapy in treatment and preventive pus complication in Cesarean section operation // Millimtrovye volny v biologii i meditsine. 2002. (1). 54-56.
8. Малышев Е.С., Писаревский В.К., Баева О.Г. Применение КВЧ-терапии в комплексном лечении гнойно-септических заболеваний у детей // Вестн. Нижегородского университета им. Лобачевского. Сер. Биол. 2003. (1). 104-111.
Malishev E.S., Pisarevskiy V.K., Baeva O.G. EHF-therapy in children pus diseases treatment // Vestn. Nizhegorodskogo universiteta im. Lobachevsko-go. Ser. Biol. 2003. (1). 104-111.
9. Челноков А.Н. Применение импульсного сложномодулированного электромагнитного поля в лечении диафизарных переломов костей голени по Г.А. Илизарову: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Пермь, 1997.
Chelnokov A.N. Application of pulse modulated electromagnetic field in treatment of shin bone dia-physis fractures (G.A. Ilizarov method): dis. abstract. Perm', 1997.
10. Пат. № 2165272 РФ. Способ стимуляции ре-паративной регенерации костной ткани и устройство для его осуществления / Рябоконь Д.С., Носков В.К., Суханов А.В. и др.; опубл. 20.04.2001.
Patent № 2165272 RF. Regeneration of bones stimulation way and device for realization / Ryabo-kon' D.S., Noskov V.K., Suhanov A.V. et al.; publ. at 20.04.2001.
11. Пат. № 74796 РФ. Щипцы хирургические для создания дефекта на лучевой кости у животных в эксперименте / Притыкин А.В.; опубл. 20.07.2008.
Patent № 74796 RF. Surgical nipper for creation an experimental defect of animal bone / Pritikin A.V.; publ. at 20.07.2008.
INFLUENCE OF HIGH FREQUENCY ELECTROMAGNETIC FIELD
ON THE STAPHYLOCOCCUS AUREUS GROWTH (EXPERIMENTAL RESEARCH)
Sergey Alexandrovich EROFEEV1, Alexander Vital'evich PRITIKIN1, Natalya Vladimirovna TEMNIKOVA1, Tatyana Dmitrievna SOLOV'EVA2, Boris Al'bertovich REYS1
1Omsk State Medical Academy of Roszdrav 644043, Omsk, Lenin st., 12
2Clinical medical surgery center of Omsk Region DH 644007, Omsk, Bulatov st., 105
The purpose of this research is estimation of high frequency electromagnetic field influence (device «Oreol-2») on the microbe cells of Staphylococcus aureus. The research was performed in vitro and in vivo. It was used laboratory bacterial type and Staphylococcus aureus, which was taken from the patients, to perform an experiment in vitro. For the experiment in vivo it was used 48 healthy, adults rabbits. There were 2 groups with 24 rabbits in each of them. All of the rabbits were made a standard defect of the left thorax limb. The injection with Staphylococcus aureus culture was made in defect region to the both group. In 1 group was performed a treatment by the reparative process stimulation device with generation of high frequency electromagnetic field («Oreol-2»). Results of the experiment were estimated by clinical and microbiological data. Laboratory experiment in vitro did not give a depressive or stimulative effect of high frequency electromagnetic field on the Staphylococcus aureus. The data analysis of experiment in vivo gave positive influence results of device with generation of high frequency electromagnetic field («Oreol-2»), which stimulated bone reparative process, microcirculation and mobilization reserve organism functions.
Key words: rabbits, staphylococcus aureus, high frequency electromagnetic field.
Erofeev S.A. — doctor of medical sciences, assistant professor of traumatology, orthopedy and field surgery chair; e-mail: esa_rncvto@mail.ru
Pritikin A.V. — post-graduate student of traumatology, orthopedy and field surgery chair; e-mail: esa_rncvto@mail.ru
Temnikova N.V. — candidate of medical sciences, assistant of the department of microbiology, virusology and immunology
Solov'eva T.D. — high category physician, head of clinical microbiology laboratory Reys B.A. — doctor of medical sciences, head of experimental medicine laboratory
