CC BY
38
УДК 612.741.001.6
© А.М. Фархутдинов, С.Н. Гришин, А.Ю. Теплов, 2009
А.М. Фархутдинов,1 С.Н. Гришин,2 А.Ю. Теплов1 ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ АТФ НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ И СОСТОЯНИЕ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ
СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ МЫШИ
Казанский государственный медицинский университет1,
Казанский государственный университет2, г.Казань.
В работе исследованы механизмы влияния экзогенной АТФ на сократительную функцию изолированных скелетных мышц (СМ) мыши: «медленной» - m. soleus, «смешанной» - diaphragma и «быстрой» - m. extensor digitorum longus (m.EDL). Показано, что у изучаемых СМ АТФ вызывает разнонаправленное изменение силы сокращения, вызванного холиномиме-тиком карбахолином. У «медленной» и «смешанной» этот показатель возрастает, у «быстрой» снижается. Показано также, что АТФ приводит к изменениям неквантовой секреции ацетилхолина в зоне концевой пластинки мышечных волокон (МВ) (Н-эффект). Н-эффект снижается у «медленной» и «смешанной» СМ и не изменяется у «быстрой» мышцы. Высказывается предположение о различиях механизмах влияния экзогенной АТФ на сократительную функцию различных СМ мыши. У «медленной» и «смешанной» увеличение силы обусловлено в первую очередь динамикой холиноопосредованных процессов возбуждения мембраны МВ. У «быстрой» же снижение силы сокращения является следствием иных причин.
Ключевые слова: скелетная мышца, сократительные свойства, неквантовая секреция, m. extensor digitorum longus, m.soleus, diaphragma, АТФ, аденозин, мышь.
A.M. Farkhutdinov, S.N. Grishin, A.Yu. Teplov INFLUENCE OF АТP ON THE CONTRACTILE FUNCTION AND CONDITION OF THE POSTSYNAPTIC MEMBRANE OF THE MOUSE ISOLATED SKELETAL MUSCLES
The mechanisms of ATP influence on the contractile function of the mouse isolated skeletal muscles (SM) are investigated: «Slow» - m. soleus, «mixed» - diaphragma and «fast» - m. extensor digitorum longus (m. EDL). It has been shown that ATP leads to inverse changes in the force of reduction caused by Carbachol. In the «slow» and «mixed» this parameter increases. It decreases in the «fast». It has also been shown that ATP brings about changes in non-quantum secretion of acetilcholine in the zone of trailer plate of muscular fibres (MF) (H-effect). The H-effect decreases in the «slow» and «mixed» SM and does not change in the «fast» muscle. We suppose that there are distinctions in the mechanisms of ATP effect on the contractile function of various SM of the mouse. In «slow» and «mixed» the increase in force is caused, first of all, by dynamics in cholinemediated processes of excitation of MF membrane. In the «fast» - a decrease in the reduction force is caused by other reasons.
Key words: Skeletal muscle, contractile properties, non-quantum secretion, m. extensor digitorum longus, m.soleus, diaphragma, ATP, adenosin, mouse.
Известно, что стрессовая реакция способна изменять модулирующее действие АТФ (адено-зин-5'-три-фосфорной кислоты) на параметры сокращения поперечно-полосатых мышц теплокровных животных [5,6]. Ранее нами изучалась возможность влияния пуринов на дыхательные мышцы. На полосках диафрагмы мыши было показано, что экзогенная АТФ способна обратимо изменять характеристики ее сокращения на холиномиметик карбахолин (Кх) [4,12]. В качестве возможного объяснения механизмов обнаруженного эффекта мы предположили влияние АТФ на холиноопосре-дованные процессы возбуждения мышечных волокон (МВ). Принимая во внимание сложное строение диафрагмы - она является «смешанной» мышцей, было предложено расширить это исследование, изучив влияние АТФ на функциональные характеристики «быстрой» и «медленной» скелетных мышц (СМ).
Целью настоящей работы явилось выявление роли холиноопосредованных процессов возбуждения в механизмах влияния АТФ на различные виды поперечно-полосатых мышц. Исследовалось влияние экзогенной АТФ на: 1) параметры сократительного ответа СМ, вызываемого холи-номиметиком карбахолином (Кх) и 2) уровень неквантовой секреции ацетилхолина (Ах) в зоне концевой пластинки. Эксперименты проводились на полосках диафрагмы, а также на изолирован-
ных СМ голени: «быстрой» мышце - длинном разгибателе пальцев (m. extensor digitorum longus -m.EDL) и «медленной» - камбаловидной мышце (m.soleus).
Материал и методы
Эксперименты проводились на мышах обоего пола массой тела 17-22 г. Изучение функционального состояния СМ проводилось двумя методами: при первом методе изучалось сокращение СМ, которое вызывалось агонистом - холино-миметиком Кх. Механомиографические исследования проводились на препарате изолированной мышцы в условиях изометрии. Изометрический режим достигался предваритльным растяжением препарата мышцы в ванночке в течение 20 минут с силой 0,5 г при постоянной перфузии раствором типа Кребса. Сокращение СМ регистрировалось фотоэлетрическим преобразователем [1]. Агонист Кх добавлялся в ванночку при остановленной перфузии с 30-минутными интервалами в субмак-симальной концентрации (2х10-4М для диафрагмы, 5х10-4М для m.soleus и 7х10-4М для m.EDL)., Условия регистрации сокращения «быстрой» и «медленной» мышц голени мыши на Кх iv vitro детально описаны нами ранее [3]. Между сокращениями СМ отмывалась чистым перфузионным раствором. Оценка сократительной реакции велась по комплексу сократительных параметров, включающему в себя временные характеристики - время разви-
тия максимального напряжения (СТ), время полу-расслабления (RT/2), время плато (Пл), силу (Рос) и скорость (Уос) сокращения, которая определялась отношением Рос/СТ. Влияние АТФ на СМ оценивали по различиям сократительных характеристик до и после 5 минутной инкубации ткани с этим агентом в концентрации 1х10-4М.
Вторая экспериментальная методика позволяла изучать влияние АТФ на состояние постси-наптической мембраны мышечного волокна (МВ) в области концевой пластинки [10]. Неквантовую секрецию Ах измеряли с помощью стеклянных микроэлектродов (сопротивлением 8-12 М^, заполненных 2,5 М KCl). Для определения ее уровня сначала армином устранялось действие ацетилхо-линэстеразы, после чего на мышцу в течении 8-12 минут апплицировался блокатор Н-
холинорецепторов d-тубокурарин (ТБК) (10-5М). Разница значений мембранного потенциала (МП) до и после аппликации d-тубокурарин соответствует величине неквантовой секреции Ах (Н-эффект). Влияние АТФ на состояние постсинапти-ческой мембраны МВ определяли по разнице значений Н-эффекта до и после 5-минутной перфузии мышцы с этим веществом в концентрации 1х10-4М.
Эксперименты проводились при температуре 20-21єС.
Статистическая обработка результатов исследования велась с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты
Параметры сокращения изолированных мышц на Кх в субмаксимальной концентрации до и после их инкубации с АТФ представлены в табл.
1, 2, 3.
Таблица 1
Параметры сокращения (Х ± 8х) изолированных полосок диафрагмальной мышцы мыши на Кх (2х10’4 М) до и после 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкМ) (n=10)
Показано, что у диафрагмальной мышцы мыши Кх в субмаксимальной концентрации (2х10-4М) вызывал сокращение силой 335,2±93,4 мг и скоростью 25,6±5,6 мг/с. Предварительная инку-
бация мышцы с АТФ увеличивала силу сокращения до 426,3±110,0 мг (p<0,001) и скорости до 47,8±8,0 мг/с (p<0,01).
Изучение неквантовой секреции Ах показало, что МП покоя, изначально составляющий 71,0±1,9 мВ (n=102), в присутствии ТБК возрастал до 75,9±0,7 мВ (n=102). Динамика МП указывает, что Н-эффект в контроле составляет 4,9±0,3 мВ. АТФ вызвала снижение этого показателя до 1,5±0,5 мВ (р<0.05).
В экспериментах, выполненных на m.EDL, обнаружено, что Кх в субмаксимальной концентрации (7х10-4М) вызывал сокращение силой 72,5±19,5 мг и скоростью 17,9±3,1 мг/с. Инкубация с АТФ уменьшала силу сокращения до 52,4±11,0 мг (р<0,05) и увеличивала скорость до 29,2 ± 4,0 мг/с (р<0,05).
Изучение неквантовой секреции Ах продемонстрировало, что МП покоя, изначально составляющий 72,3±0,6 мВ (n=85), в присутствии ТБК возрастал до 77,8±1,6 мВ (n=85). Следовательно, Н-эффект в контроле составлял 5,5 ± 0,6 мВ (n=85). После влияния АТФ этот показатель достоверно не изменялся, составляя в описанных условиях эксперимента 5,7±0,9 мВ (n=72).
На камбаловидной мышце было установлено, что Кх в субмаксимальной концентрации (5х10-4М) вызывал сокращение силой 180,5±6,8 мг и скоростью 16,6±1,3 мг/с. Инкубация с АТФ приводила к увеличению силы сократительного ответа до 224,3±12,9 мг (p<0,05) и его скорости до 28,3±1,8 мг/с (р<0,01).
Изучение неквантовой секреции Ах показало, что МП покоя, изначально составляющий 70,9 ± 1,7 мВ (n=160), в присутствии ТБК возрастал до 75,9 ± 1,3 мВ (n=160). Динамика МП указывает, что Н-эффект в контроле составляет 5,0 ± 0,7 мВ. АТФ вызвала снижение этого показателя до 1,0 ±
0,5 мВ (р<0.05).
Применение аденозина в той же концентрации, что и АТФ не изменяло сократительных свойств всех исследованных СМ и не влияло на неквантовую секрецию Ах.
Обсуждение
Анализ результатов исследования выявил механизмы, определяющие изменение сократительной функции поперечно-полосатых мышц in vitro при влиянии экзогенной АТФ. В характере изменений силового показателя для различных мышц наблюдаются принципиальные различия как количественные, так и по направленности. У “медленной” и «смешанной» сила сокращения возрастает, у “быстрой” - снижается. Сила сокращения в нашей экспериментальной модели зависит в первую очередь от чувствительности СМ к хо-линомиметику [2]. По этой причине для объяснения механизмов обнаруженных изменений было изучено влияние экзогенной АТФ на неквантовую секрецию Ах в области концевой пластинки. Показано, что у различных мышц АТФ по-разному изменяет этот показатель. У «медленной» и «смешанной» неквантовая секреция Ах снижается, у «быстрой» - остается без изменений.
СТ, с Рос, мг Уос, мг/с RT/2, с Пл, с
До инкубации 10,7+1,1 335.2+93.4 25,6+5,6 25.7+1,8 18,6+3,3
После инкубации 7,3+0,5 426,2+110,0 47,8+8,0 22,9+3,0 10,2+2,6
P Р<0.05 Р<0.001 Р<0.01 Р<0.01
% 68 126,8 187 55
Таблица 2
Параметры сокращения (Х ± Sx) изолированных m.EDL мыши на Кх (7х10-4 М) до и после 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкМ) (n=8)
СТ, с Рос, мг Уос, мг/с RT/2, с Пл, с
До инкубации 4,25±0,39 75,2±5,43 17,9±0,69 7,38±0,5 2,63+0,26
После инкубации 1,88±0,18 52,4±5,8 29,2±1,48 7,00±1,12 1,38±0,18
P Р<0.001 Р<0.001 Р<0.001 Р<0.001
% 44,2 69,7 163,1 52,5
Таблица 3
Параметры сокращения (Х ± Sx) изолированных m.soleus мыши на Кх (5х10-4 М) до и после 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкМ) (n=8)
СТ, с Рос, мг Уос, мг/с RT/2, с Пл, с
До инкубации 11,1±0,9 185,4+7,4 17,1+0,9 20,3+2,4 9,9+0,8
После инкубации 8,8±0,5 232,6±10,2 26,9+1,7 19,0+2,7 5,0+0,5
P Р<0.01 Р<0.001 Р<0.001 Р<0.01
% 77.9 125,5 157,3 50,6
Характер изменений обоих показателей у двух первых мышц позволяет утверждать, что увеличение силы сокращения на Кх является следствием повышения чувствительности постсинапти-ческой мембраны к холиномиметику. У «быстрой» же мышцы снижение силы сокращения не связано с изменением величины Н-эффекта.
Причина различий в функциональных сдвигах может определяться волоконным составом СМ. Как известно, m.soleus мыши содержит 5060% “медленных” МВ, m.EDL на 97-100% состоит из “быстрых” [9]. Диафрагма мыши, занимающая промежуточное положение, содержит 88,6% быстрого миозина [7]. Изменение силы предположительно является следствием изменения чувствительности МВ к Кх, что может находиться в прямой зависимости от площади синаптического образования. Протяженность концевой пластинки у m.soleus в 3 раза больше, чем у m.EDL [8]. На первый взгляд это и определяет чувствительность к экзогенной АТФ по уровню неквантовой секреции Ах у “медленной” и «смешанной» мышц и отсутствие таковой у «быстрой». Однако нам представляется маловероятным, что функциональные, к тому же обратимые сдвиги являются следствием исключительно морфологических, структурных констант СМ. Скорее, в основе обнаруженных изменений у мышц с различным фенотипом лежат функциональные свойства их холиновозбудимых мембран, определяемые, например, различиями в механизмах выделения кофакторов синаптической передачи (одним из которых и является АТФ).
В противоположность разнонаправленности изменений силы скорость сокращения у всех мышц возрастает: до 187% от контроля у диафрагмы (р<0,01), 163% у m.EDL (p<0,05) и 170% у m.soleus (p<0,01). Этот показатель определяется либо динамикой Са-зависимых процессов возбуждения СМ [11], либо функцией иных внутриклеточных посредников [4]. Вектор изменений скорости свидетельствует об отсутствии принципиальных различий у всех трех мышц в характере работы механизмов внутриклеточной передачи, вы-
званной пуринами.
Подводя итоги, можно заключить следующее. Во-первых, изменения контрактильных характеристик поперечно-полосатых мышц мыши после действия экзогенной АТФ обусловлены рядом причин. Во-вторых, обнаружены механизмы, определяющие различия реакции на АТФ у разных мышц. Если увеличение скорости, предположительно определяемое Са-зависимыми механизмами для всех исследованных мышц носит однонаправленный характер, то в холиноопосредованных процессах возбуждения у разных СМ имеются существенные различия. Для «медленной» и «смешанной» мышц вектор изменения силы ко-реллирует с изменением Н-эффекта. В данном случае вариабельность сократительной функции обусловлена в первую очередь динамикой холино-опосредованных процессов возбуждения мембраны МВ. Увеличение силы сокращения в нашей экспериментальной модели является следствием возрастания чувствительности постсинаптической мембраны к холиномиметику и обусловлено снижением неквантовой секреции Ах в зоне концевой пластинки - уменьшение механизмов десенсити-зации холинорецепторов. У «быстрой» мышцы, волокна которой обладают гораздо меньшей площадью синаптического соединения, снижение силы не связано с изменениями Н-эффекта. Раскрытие причин обнаруженного факта требует проведения дальнейших исследований.
Выводы
1. Экзогенная АТФ изменяет сократительную функцию изолированных поперечнополосатых мышц мыши. Сила сокращения на кар-бахолин у «медленной» и «смешанной» мышц возрастает, у быстрой» - снижается.
2. Увеличение силы сокращения полоски диафрагмы и изолированной т^окш мыши на карбахолин является результатом повышения чувствительности мышечной мембраны к холиноми-метику из-за снижения уровня неквантовой секреции ацетилхолина в зоне концевой пластинки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахметзянов Р.Х., Филлипов Е.Б. Изменение силовых характеристик мышечных волокон с помощью фотоэлектрического преобразователя. Физиологический журнал СССР. - 1986. - № 72(3). - С. 387-390.
2. Наследов Г.А. Тоническая мышечная система позвоночных. - Л: Наука, 1981. - 187 с.
3. Теплов А.Ю. Влияние белковой сенсибилизации на сократительные свойства “быстрых” и “медленных” мышц мыши in vitro // Нижегородский медицинский журнал. - 2006. -№ 3. - С. 20-23.
4. Теплов А.Ю., Гришин С.Н., Зефиров А.Л., Зиганшин А.У. Роль протеинкиназы С в механизмах влияния АТФ на сократительную функцию изолированной полоски диафрагмы мыши // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2006. - № 4. - С. 389-391.
5. Burnstock G. Introduction: P2 receptors. Curr. Top. Med. Chem. -2004. - №4. -P. 793-803.
6. Burnstock G. Cellular distribution and functions of P2 receptor subtypes in different systems. / Burnstock G., Knight G. // International Review of Cytology. -2004.-Vol.240.- 31-304.
7. Blank S. Biochemical characteristics of mammalian diaphragms /Blank S., Chen V., Ianuzzo C.D. // Respir Physiol. -1988.- Vol.74 -№1 -P. 115-125.
8. Fahim M.A. Topographic comparison of neuromuscular junctions in mouse slow and fast twitch muscles / Fahim M.A., Holley J.A., Robbins N. // Neuroscience. -1984.- Vol.13.- №1.- P.227-235.
9. Florendo J.A. Electrophysiologic differences between mouse extensor digitorum longus and soleus muscle / Florendo J.A., Reger J.F., Law P.K. // Exp. Neurol. - 1983.- V.82- № 2.-P.404-412.
10. Galkin A.V. ATP but not adenosine inhibits nonquantal acetylcholine release at the mouse neuromuscular junction / Galkin A.V., Giniatullin R.A., Mukhtarov M.R., Svandov6 I., Grishin S.N., Vyskocil F. // Eur J Neu-rosci. 2001.- V.13- № 11.- P.2047-2053.
11. Hood D.A. Coordination of metabolic plasticity in skeletal muscle / Hood D.A., Irrcher I., Ljubicic V., Joseph A.M. // J Exp Biol.- 2006.- V.209- № 12.- P.2265-2275.
12. Teplov A.Y. ATP influence on mechanisms of the contraction and reception of mediator in mouse diaphragm muscle / Teplov A.Y., Grishin S.N., Devjataev A.M., Zefirov. A.L. // J.Muscle Research and Cell Motility. 2003.- V.24- № 4-6.- P.332.
