CC BY
80
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №10-3/2016 ISSN 2410-700Х_
Список использованной литературы:
¡.Государственная фармакопея СССР - 10-е изд. - М.: Медицина, 1968. - 1065с.
2.Иванова Л.А. Технология лекарственных форм: учебник в 2-х т. / Л.А. Иванова. - М.: Медицина, 1991. -Т.2 - 544с.
3.Кондратьева Т.С. Технология лекарственных форм в 2-х т. / Т.С. Кондратьева. - М.: Медицина, 1991. -Т.1. - 496с.
©Желтухина А.Ю., 2016
УДК 615+57.042:612.017
Лесникова Лариса Николаевна
канд. биол. наук, н.с. ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ
E-mail: [email protected] Кушнерова Наталья Федоровна доктор биол. наук, профессор ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ
E-mail: [email protected] Спрыгин Владимир Геннадьевич канд. биол. наук, вед.н.с. ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ
E-mail: [email protected] Фоменко Светлана Евгеньевна канд. биол. наук, вед.н.с. ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ
E-mail: [email protected] Другова Елена Сергеевна канд. биол. наук, м.н.с. ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ
E-mail: [email protected] Мерзляков Валерий Юрьевич н.с. ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ E-mail: [email protected] Момот Татьяна Викторовна канд.мед.наук, доцент ДВФУ, г. Владивосток РФ E-mail: [email protected]
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ МОРСКОЙ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ SACCHARINA JAPONICA НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕССЕ
Аннотация
В условиях экспериментальной модели стресса в эритроцитах крыс происходят нарушения в системе перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита, а также разбалансировка в соотношении индивидуальных фосфолипидов мембран эритроцитов. Показана эффективность применения экстракта из Saccharina japonica для сохранения липидной составляющей мембран эритроцитов и антиоксидантной защиты.
Ключевые слова
Стресс, эритроциты, фосфолипиды, перекисное окисление липидов, экстракт из Сахарины японской
В современных условиях организм человека постоянно подвергается действию стрессорных факторов различной природы (загрязнение окружающей среды, повышенная физическая нагрузка, психо-
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №10-3/2016 ISSN 2410-700Х_
эмоциональное напряжение, несбалансированное питание и т.д.). При регулярном и сильном стрессе происходит рассогласование, а значит нарушение в функционировании системы перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита (ПОЛ-АОЗ) с преобладанием процессов липопероксидации. Реакции ПОЛ начинаются с образования свободных радикалов или гидроперекисей, инициируемых другими органическими радикалами, ионами или комплексами металлов переменной валентности, активными формами кислорода и др. [5, c.27; 6, с. 224]. Обладая высокой реакционной способностью, свободные радикалы взаимодействуют с липидным матриксом внутриклеточных и цитоплазматических мембран, нарушая при этом их проницаемость и целостность.
Среди соединений, функции которых в организме сопряжены с поддержанием структурно-функционального статуса биологических мембран, важное значение имеют природные антиоксиданты [4, с. 56; 12, с. 12]. Известен ряд препаратов c антиоксидантной и стресс-протективной активностью (адаптогены), включающих широко известные средства традиционной народной медицины. К ним относятся корень женьшеня, элеутерококка, аралии, родиолы розовой, семена лимонника. Однако почти все они токсичны и при передозировке являются стимуляторами нервной системы.
Также известны препараты, в которых активным агентом является группа полифенольных флавоноидных соединений, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum G.) (например, силимарин) [3, с. 42]. Важнейшая особенность природных полифенольных соединений -способность к обратимому окислению и, как следствие этого, мощная антиокислительная активность. На основе силимарина разработан ряд лекарственных препаратов: «ЛИВ-52®» (Индия), «Карсил®» (Болгария), «Легалон®» (Германия), «Силегон®» (Венгрия), «Сиромин®» (Словения) и др. Однако данные препараты зарубежного производства, что обусловливает поиск и изучение новых источников сырья на территории Российской Федерации. Лишь в единичных работах обсуждается возможность применения в качестве антиоксидантов, мембрано- и стресспротекторов полифенольных комплексов из морских водорослей [8, с.
51].
Бурые водоросли содержат в своем составе широкий спектр биологически активных веществ различных классов: полисахариды, полифенолы, белки, полиненасыщенные жирные кислоты, углеводы, пищевая клетчатка и др. Одним из сырьевых источников для получения фармакологических препаратов с высокой концентрацией полифенольных соединений среди бурых водорослей является Сахарина японская (Ламинария японская).
Целью исследования явилась оценка влияния экстракта из Сахарины японской на активность системы «Перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» и содержание фосфолипидных фракций в мембранах эритроцитов крыс в условиях стресса.
Бурую водоросль Saccharina japónica собирали в б. Западная о. Попова (зал. Петра Великого, Японское море) и высушивали при температуре до 50оС. Для освобождения от альгинатов измельченное сырье экстрагировали методом реперколяции 70% этиловым спиртом (при соотношении сырья к экстрагенту 1:1 по объему). Выход экстракта из 1 кг сырья в процессе реперколяции составлял 1 л. Полученный экстракт упаривали в вакууме до сухого остатка и ресуспендировали в воде. Содержание общих полифенолов определяли с помощью реактива Фолина-Чокальтеу [10, с. 154]. Полифенолы составляли 35% от сухого остатка экстракта.
Исследования проводили на белых крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180-200 г. Животных содержались в стандартных условиях вивария. Крыс выводили из экспериментов декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986).
Водный раствор сухого остатка экстракта сахарины вводили в количестве 100 мг/кг массы тела крысы. Доза в 100 мг/кг соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепатопротекторов [2, с. 10].
Модель экспериментального стресса вызывали вертикальной фиксацией животных за дорзальную шейную складку в течение 24-х часов. Экстракт Сахарины японской крысам вводили внутрижелудочно через зонд по 0,4 мл 2 раза в сутки (до вертикальной фиксации и спустя 4 часа). Крысы были разделены на 3 группы
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №10-3/2016 ISSN 2410-700Х_
по 10 животных в каждой: 1 группа - контроль (интактные); 2-я группа - стресс; 2-я группа - стресс + экстракт сахарины.
Состояние системы «Перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» (ПОЛ-АОЗ) оценивалось по активности супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1), концентрации малонового диальдегида (МДА) и уровню восстановленного глутатиона (Г-SH) [7, с. 27]. Экстракты общих липидов из мембран эритроцитов готовили с использованием системы растворителей хлороформ:метанол (2:1, по объему) [9, с. 498]. Определение общих фосфолипидов (ОФЛ) в экстрактах проводили спектрофотометрически с помощью молибдатного реактива [13, с. 131]. Фракционное разделение фосфолипидных фракций осуществляли методом двумерной микротонкослойной хроматографии [11, с. 376], а их количественное определение - по методу В.Е. Васьковского [13, с. 134]. Содержание отдельных фракций фосфолипидов выражали в процентах от суммы всех фракций.
Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) с функцией проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Анализ показателей системы ПОЛ-АОЗ при стресс-вертикальной фиксации (2 группа) выявил наличие изменений относительно таковых величин в контроле. Так, уровень МДА был увеличен на 15% (р<0,05), уровень Г-SH снижен на 12% (р<0,001), активность СОД превышала контрольные значения на 41% (р<0,001) (табл.).
При сравнении величин отдельных фракций фосфолипидов в мембранах эритроцитов крыс с моделированным стрессом (2 группа) с таковыми показателями в группе контроля наблюдалось снижение уровня фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилсерина (ФС) и увеличение концентрации сфингомиелина (СМ), фосфатидилинозита (ФИ), фосфатидной кислоты (ФК) (табл.).
Применение экстракта из Сахарины японской в условиях стресс-вертикальной фиксации (3 группа) способствовало нормализации состояния системы ПОЛ-АОЗ у крыс. Наблюдалось повышение уровня восстановленного глутатиона на 20% (р<0,001), снижение количества МДА на 15% (р<0,01), активности СОД на 24% (р<0,001) по сравнению с группой животных, не получавших экстракт сахарины при стрессе.
Таблица
Влияние экстракта из Сахарины японской на показатели системы ПОЛ-АОЗ и содержание фосфолипидов в
мембранах эритроцитов крыс при стресс-вертикальной фиксации (M±m)
Показатель 1 группа Контроль (интактные) Опытные группы
2 группа Стресс 3 группа Стресс + экстракт из сахарины
СОД (ед/мг белка) 13,78±0,61 19,44±0,563 14,84±0,59в
Г-SH (нмоль/мг белка) 1,71±0,04 1,50±0,033 1,80±0,04в
МДА (мкмоль/мл) 6,70±0,34 7,71±0,29' 6,55±0,28б
Фосфолипиды (%)
ОФЛ 65,00+1,90 52,16+1,953 61,15+1,69б
ФХ 36,98±0,82 34,55±0,56' 36,74±0,6б
СМ 12,95±0,74 15,50±0,502 12,36±0,43в
ФЭ 18,20±0,70 15,40±0,532 18,10±0,68б
ФС 5,80±0,14 4,60±0,133 5,78±0,10в
ФИ 5,30±0,09 6,15±0,113 5,78±0,103,а
ФК 4,43±0,13 4,85±0,072 5,86±0,083,в
Примечание: различия статистически значимы при: 1 - р<0,05; 2- р<0,01; 3- р<0,001 по сравнению с контролем; а - р<0,05; б- р<0,01; в- р<0,001 - по сравнению со 3-й группой. СОД - супероксиддисмутаза, Г^Н - восстановленный глутатион, МДА - малоновый диальдегид, ОФЛ - общие фосфолипиды, ФХ -фосфатидилхолин, СМ - сфингомиелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФИ - фосфатидилинозит, ФС -фосфатидилсерин, ФК - фосфатидная кислота.
Введение крысам экстракта из сахарины на фоне развития стресса способствовало позитивной
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №10-3/2016 ISSN 2410-700Х_
модуляции фосфолипидного спектра мембран эритроцитов. Так, уровень содержания фосфолипидных фракций, являющихся основными структурными компонентами мембран (ФХ, СМ, ФЭ) максимально приближался или соответствовал контрольным значениям. А значения ФК и ФИ оставались повышенными на 32 % и 9 %, соответственно (р<0,001 для обоих показателей).
Увеличение содержания фосфатидной кислоты при введении животным экстракта из Сахарины японской следует считать позитивным моментом и может являться одним из механизмов репаративного действия экстракта, так как эта фракция является основой для синтеза всех фосфолипидов. Данная положительная динамика в соотношении отдельных фосфолипидных фракций несомненно улучшает эластические свойства эритроцитарной мембраны и повышает ее механическую устойчивость.
Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что под влиянием полифенольной составляющей экстракта из Сахарины японской нормализуются показатели системы «Перекисное окисление липидов- антиоксидантная защита», восстанавливается фосфолипидная составляющая мембран эритроцитов крыс, что указывает на выраженные антиоксидантные и мембранопротекторные свойства изучаемого препарата. Данный эффект обусловлен тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью мембран, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток, и, соответственно, снижать возможность атаки радикалами [1, с. 12].
Таким образом, показана возможность коррекции дефектов липидного бислоя эритроцитарных мембран, системы ПОЛ-АОЗ, вызванных стрессом, с помощью экстракта из Сахарины японской, что обосновывает его применение в качестве высокоэффективного стресс-протектора. Работа поддержана Российским научным фондом, проект № 14-50-00034
Список использованной литературы:
1. Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р., Спирихин Л.В., Насибуллин Р.С. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран // Хим.-фарм. журнал. 2007 - Т. 41, № 7
- С. 12-14.
2. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета - 1999 - № 2 - С. 9-12.
3. Катикова О.Ю., Костин Я.В., Тишкин В.С. Гепатопротекторное действие препаратов растительного происхождения // Экспериментальная и клиническая фармакология - 2002 - № 1 - С. 41-43.
4. Костюк В.А., Потапович А.А. Биорадикалы и биоантиоксиданты / Минск: БГУ - 2004 - 174 с.
5. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях // Пособие для врачей. Изд. 2-е, испр. и доп. М.: РКНПК МЗ РФ - 2001 - 78 с.
6. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / М.: Слово - 2006 - 556 с.
7. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы "Перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита" в биологических жидкостях / Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та - 2003 - 80 с.
8. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Сизова Л.А., Момот Т.В. Гепатопротекторные свойства экстракта из бурой водоросли Saccharina japonica // Биология моря - 2013 - Т. 39 - № 1- С. 50-54.
9. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue // Biol. Chem. - 1957 - Vol. 226 - P. 497-509.
10.Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent // Methods in Enzymology: Oxidants and antioxidants. Academic Press: San Diego - 1999 - Vol. 299 - Pt. A. - P. 152-178.
11.Svetachev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin layer microchromatography of lipids // J. Chromatogr. - 1972 - Vol. 67, № 2. P. 376-378.
12.Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. Free radicals and antioxidant in normal physiological functions and human disease // Int. J. Biochem. Cell B. - 2007 - Vol. 39 - P. 44-84.
13.Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. A universal reagent for phospholid analysis // J. Chromatography
- 1975 - Vol. 114, № 1 - P. 129-141.
© Л.Н. Лесникова, Н.Ф. Кушнерова, В.Г. Спрыгин, С.Е. Фоменко, Другова Е.С., Мерзляков В.Ю., Момот Т.В., 2016
