Влияние доксорубицина на экспрессию генов и микроРНК EGFR-сигнального пути в культуре клеток линии HeLa Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

вал на него лигатуру, ушивал рану послойно и обрабатывал шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны подкожно вводили 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы B16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:10. Результаты. Средняя продолжительность жизни для мышей основной группы (ОГ, 64 штук) составила 19,17±1,35 дней, максимальная — 24 дня. В контрольной группе (КГ, без боли, 22 мыши) — первая смерть наступила на 24 сутки, средняя продолжительность их жизни составила 30,25±1,67 дня, максимальная — 36 дней.

У мышей ОГ, средний размер опухоли на 2 неделе эксперимента был в 1,9 раза больше, чем у мышей КГ в это же время, а на 3 неделе — достоверно не отличался от нее. Минимальный размер впервые зафиксированных подкожных опухолей у мышей ОГ на 1 неделе был в 2 раза больше, чем у КГ на 2 неделе, в то время как максимальный размер опухоли на 3 неделе эксперимента у мышей из КГ был в 2,3 раза больше, чем у мышей с болью. При этом у большинства мышей ОГ 3 неделя — предтерминальный период, а у мышей из КГ — нет. Несмотря на то, что у мышей ОГ объем опухоли нарастал менее активно, у значительного количества мышей на разных этапах исследования, начиная уже с 1 недели, отмечался ее 2-фокусный рост. Кроме того, поверхностный некроз опухоли появлялся на неделю раньше и у большего количества животных, чем в КГ.

У мышей ОГ меланома В16 вела себя более агрессивно, поскольку метастазировала чаще, иногда в несколько органов и имела нетипичные для себя зоны метастазирования. Метастазы у мышей основной группы регистрировались уже через неделю после перевивки, а у мышей КГ — через 4 недели. У мышей ОГ опухоль метастазировала, кроме типичных мест (печень, селезенку, легкие), в нетипичные — сердце, матку. Предтерминальное состояние у мышей ОГ регистрировалось на 1 неделе после перевивки, с развитием процесса количество животных увеличивалось. В КГ предтерминальное состояние мышей регистрировалось, начиная с 3 недели. Заключение. Хроническая боль уменьшает продолжительность жизни самок мышей и делает метастазирование мела-номы B16/F10 у них более агрессивным. Ключевые слова: хроническая боль, меланома, мыши, VEGF

Гипометилирование LINE-1 в аденокарциномах толстой кишки

Н. Н. Тимошкина', М. А. Кожушко', Ю. А. Геворкян', Д. И. Водолажский'

Место работы: 'ФГПУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону e-mail: molcancer@yandex.ru

Метилирование ДНК является распространенным механизмом эпигенетической регуляции экспрессии генов, который активно используется при разработке моделей канцерогенеза, рассматривающих аберрантное метилирование как причину подавления активности генов-супрессоров опухолей или активации онкогенов. Уровни метилирования повторяющихся мобильных элементов, в частности ретротранспо-зонов LINE-1 (Long interspersed nuclear element или длинные диспергированные повторы), играют важную роль в поддержании геномной стабильности и используются для оценки статуса метилирования генома в целом. Цель. Оценка статуса метилирования LINE-1 при колорек-тальном раке (КРР) в зависимости от клинико-патологических

характеристик, наличия мутаций гена KRAS, метилирования промоторных областей онкосупрессоров. Материалы и методы. Метод пиросеквенирования (система анализа PyroMark Q24, Qiagen, Germany) был использован для количественного определения уровня метилирования CpG-сайтов LINE-1 и 6-ти генов-онкосупрессоров (APC, CDH13, MLH1, MGMT, P16 и RASSF1A) в опухолях и нормальной ткани 50-ти пациентов с диагнозом КРР различных TNM-стадий. Статус гена KRAS оценивали методом прямого секвенирования по Сэнгеру (АВ 3500, Life Technologies, USA). Вычисления статистических показателей и достоверности различий проведены в пакете IBM SPSS Statistics v. 23.0. Результаты. Уровень метилирования LINE-1 в опухолях составил 66,8+0,89%, что достоверно ниже (р=0,0013) уровня, определяемого в условно нормальных тканях 72,5+0,45%. Изменение метилирования LINE-1 не было связано с возрастом пациентов (в отличие от гена MGMT), стадией заболевания, степенью дифференцировки и локализацией опухоли. Некоторое снижение метилирования мобильных элементов в опухолях с активирующими мутациями в гене KRAS (64,9% против 68,5%, соответственно) также не было статистически значимым. Отмечена достоверная отрицательная корреляция уровня метилирования локусов LINE-1 и CDH13 (r=-0,427, p<0,05). Использованная панель маркеров-онкосупрес-соров позволила дискриминировать опухоли дистального и проксимального отдела толстой кишки (р=0,041), при этом в последних достоверно чаще встречался статус гиперметилирования CDH13 (p=0,004). Деметилирование мобильного элемента коррелировало с прогрессией TNM-стадий опухоли (r=0,606, p<0,001). Кроме того, в выборке КРР с метастазами чаще отмечали случаи CpG-метилирования LINE-1 ниже 70% (%2=3,83 при р=0,045). Исследованные онкосупрессоры генов были гиперметилированы в 70% случаев аденокарцином толстой кишки, в 90% случаев отмечалось деметилирование LINE-1 в КРР-опухоли по сравнению с условно нормальным эпителием толстой кишки.

Заключение. Анализ CpG-метилирования позволяет идентифицировать различные подгруппы КРР. Настоящее исследование продемонстрировало ассоциацию метилирования LINE-1 с TNM-стадией опухоли, что вместе с оценкой гиперметилирования онкосупрессоров может быть полезным маркером для ранней диагностики и прогноза течения спорадического КРР.

Влияние доксорубицина на экспрессию генов и микроРНК EGFR-сигнального пути в культуре клеток линии HeLa

Д.И. Водолажский, А.А. Пушкин, Н.Г. Васильченко, С.Б. Пан-ченко, Н. Н. Тимошкина

Место работы: ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону e-mail: molcancer@yandex.ru

Химиопрепарат доксорубицин (Adriamycin, DXR) — известный ДНК-интеркалирующий цитостатик, используемый при лечении различных видов опухолей. Ключевым механизмом ответа опухолевых клеток на действие DXR является активация про-апоптотического пути [Tomankova et al., 2015]. Показано, что DXR стимулирует экспрессию генов некоторых сигнальных путей, например, транскрипционных факторов STAT1,2, N-myc, каспазы-1 в клетках цервикального рака HeLa [Hussner J et al., 2012].

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Цель. Исследование профилей экспрессии генов сигнального каскада EGFR, а также микроРНК, мишенями которых могут быть гены этого сигнального пути, в клетках линии HeLa, культивируемых при различных концентрациях DXR. Материалы и методы. В работе использовали культуру клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa CCL-2. Культивирование проводили в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) c добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific Hyclone, США) в присутствии гентамицина (50 мкг/мл; Биолот, Россия) в условиях 5% CO2 (инкубатор CB 150 Binder, Германия). Питательную среду заменяли при достижении 70% уровня покрытия культуральной поверхности клетками во всех флаконах. В экспериментальных флаконах среду заменяли на RPMI-1640, содержащую 2 или 4 мкг/мл доксорубицина. Экспозиция составила 1; 5 и 24 часа. Экстракцию суммарной РНК проводили с использованием реагента Trizol (Thermo Fisher Scientific, США). Препараты суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью набора «Реверта L» (Синтол, Россия) и получения библиотеки кДНК микроРНК после полиаденилирования в присутствии poly (A) поли-меразы E. coli (New England Biolabs, Великобритания). Экспрессию 11-ти генов (EGFR, GRB2, SOS1, KRAS, BRAF, MEK1, STAT1, PIK3CA, Akt, mTOR) и транскрипционный уровень 7-ми микроРНК (Let71, miR92a, miR143, miR126, miR266, miR513a, miR7110) определяли методом RT-PCR на ампли-фикаторе DTprime («ДНК-технологии», Россия) в 25 мкл ПЦР-смеси с красителем EvaGreen DYE (Biotium). Референс-ными локусами служили GADPH для анализа экспрессии генов, RNU6 — для микроРНК. Различия между группами оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с post hoc попарными сравнениями средних значений. Все статистические анализы проводили в пакете IBM SPSS Statistics v. 23.0.

Результаты. При часовой экспозиции клеток HeLa с доксо-рубицином (2 мкг/мл) отмечалась тенденция к снижению уровня экспрессии генов EGFR и mTOR (более чем на 30%), увеличение экспрессии гена BRAF в 1,5 раза по сравнению с уровнем контроля. При концентрации DXR в среде 4 мкг/мл фиксировали снижение уровня экспрессии генов STAT1 и PI3KCA на 50%, гена MEK1 на 88% и увеличение экспрессии гена BRAF в 3 раза. Одновременно отмечено статистически значимое (для p<0,05) увеличение экспрессии всех микроРНК во всех вариантах. Следует отметить, что DXR в концентрации 2 мкг/мл оказывал большее влияние на экспрессию микроРНК.

Культивирование в течение 5-ти часов клеток HeLa с док-сорубицином (2 мкг/мл) понижало транскрипционную активность гена EGFR на 56%. В отличие от 1-часовой экспозиции уровень мРНК гена BRAF падал на 34% по сравнению с контролем. Экспрессия Akt, mTOR снижалась на 34% и 43%, соответственно. Экспрессия гена MEK1 увеличивалась в 8,5 раз. При концентрации доксорубицина 4 мкг/мл фиксировали снижение уровня экспрессии следующих генов: EGFR — на 56%, BRAF — на 59%, STAT1 — на 77%, PI3KCA — на 46% и Akt — на 34%. Увеличение экспрессии гена MEK1 было более выражено и в 18,3 раз превышало значение контроля. Характер экспрессии микроРНК также изменялся по сравнению с часовой инкубацией: экспрессия miR-92a-1-5p в клетках HeLa уменьшалась в 1,2 и 8,28 раз при концентрации DXR 2 мкг/мл и 4 мкг/мл, соответственно; наоборот, увеличивался уровень экспрессии miR-7110-5p — в 2,22 и 8,28 раз; miR-143-3p — в 17,5 и 208 раз; miR-126 — в 1,3 и 1,7 раз; miR-513a-5p — в 2

и 6,3 раза; miR-26b-3p — в 3,14 и 12,5 раз, соответственно. Уровень транскрипционной активности hsa-let-7a изменялся незначительно. При 5-часовой экспозиции доксо-рубицин влиял на относительную экспрессию микроРНК эффективнее в концентрации 4 мкг/мл. Режим культивирования клеток HeLa в течение 24-х часов при концентрации DXR 2 мкг/мл в целом понижал уровень экспрессии генов: от 38% для MEK1 до 94% для PI3KCA. При концентрации DXR 4 мкг/мл в отличие от эффекта дозы 2 мкг/мл наблюдали увеличение экспрессии гена MEK1 в 2,5 раза относительно контроля. Относительная экспрессия микроРНК в клетках HeLa в указанной экспозиции увеличивалась в тысячи раз (кроме miR-143, miR-126 и let-7a), что, возможно, обусловлено запредельно стрессовым или апопто-тическим состоянием клеток.

Согласно результатам двухфакторного ANOVA, оба фактора и их сочетание (экспозиция и концентрация DXR) достоверно изменяют экспрессию всех проанализированных микроРНК. В отношении генной экспрессии значимый совокупный эффект времени культивирования и дозы доксорубицина был выявлен только для гена MEK1 (р=0,0001). В условиях эксперимента наблюдали обратную достоверную корреляцию между уровнем экспрессии miR-143 и генов EGFR, BRAF и Akt; уровнем экспрессии miR-126 и гена SOS1 (p<0,05).

Заключение. DXR в различных дозах (2 и 4 мкг/мл) повышает транскрипционную активность гена MEK1 после 1, 5, 24-х часов культивирования клеток HeLa и достоверно изменяет динамику экспрессии исследованных микроРНК. Данные эксперимента указывают на большую чувствительность, как с точки зрения латентного периода, так и амплитуды ответа изменения экспрессии исследованных микроРНК по сравнению с экспрессией генов сигнального пути EGFR.

Некоторые морфоиммунологические показатели в саркомах мягких тканей

Е.М. Непомнящая', И. А. Новикова', Л. Н. Ващенко', Т.А. Алиев', Е. П. Ульянова', Г. И. Закора'

Место работы: 'ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, Ростов-на-Дону, Россия

e-mail: iftrnioi@yandex.ru

Цель. Изучить некоторые морфоиммунологические особенности сарком мягких тканей: первичных и рецидивных. Материалы и методы. Материалом исследования послужили истории больных первичными и рецидивными саркомами, операционный материал удаленных опухолей. Группу первичных сарком составили 30 наблюдений, рецидивных — 29. Фрагменты удаленных опухолей вырезали, фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили по стандартной методике и заливали в парафин. В дальнейшем окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр гистологических препаратов осуществляли на светооптическом уровне. Имму-ногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков. Окрашивание проводили на авто-стейнере Thermo Scientific. Для визуализации иммуногисто-химической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Определяли следующие маркеры: пролиферативную активность (ki 67), факторы апоптоза и проапоптоза (bcl2, bax), ангиогенеза (CD34). Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoftInc., США).

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org