Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синуклеина Ш45+-клеток крови при болезни Паркинсона Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 616.858:577.174.52

П. А. Андоскин, А. К. Емельянов, М. А. Николаев, К. А. Сенкевич, В. П. Шилин, А. А. Тимофеева, А. Ф. Якимовский, С. Н. Пчелина

ВЛИЯНИЕ ДОФАМИНА ПЛАЗМЫ НА УРОВЕНЬ АЛЬФА-СИ-НУКЛЕИНА СБ45 + -КЛЕТОК КРОВИ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАР-КИНСОНА

Петербургский институт ядерной физики имени Б. П. Константинова; НИЦ «Курчатовский институт»; Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Санкт-Петербургский академический университет — научно-образовательный центр нанотехнологий РАН

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) — нейродегенератив-ное заболевание, обусловленное гибельюдофаминер-гических нейронов черной субстанции головного мозга. Центральным звеном патогенеза БП считается нарушение метаболизма (повышение внутриклеточной концентрации, формирование нейротоксич-ных олигомерных форм) небольшого нейронального белка альфа-синуклеина, локализующегося преимущественно в пресинаптическихтерминалях [4, 13].

В ряде исследований последних лет рассматривалась возможность использования альфа-синук-леина периферических жидкостей (спинно-мозго-вая жидкость (СМЖ), кровь) в качестве биомаркера развития БП [3]. Полученные данные носят противоречивый характер, что может, в частности, объясняться примесью эритроцитов в исследуемых образцах [12].Результаты исследований последних лет показывают, что из всех клеток крови эритроциты являются основным источником альфа-синук-леина (более 98 %) [2, 12]. Предполагается, что гемолиз влияет на уровень альфа-синуклеина в плазме и СМЖ. Необходимо отметить, что при оценке возможности использования альфа-синуклеина лимфоцитов крови в качестве маркера БП использовали фракцию мононуклеаров, полученную методом градиентногоцентрифугирования на фико-ле, что также не исключает примеси эритроцитов.

Мы предположили, что в качестве биомаркера БП можно рассматривать альфа-синуклеин гомогенной фракции клеток крови, полученной методом магнитного сортинга, а именно — С045+-клеток,-экспрессирующих основные белки дофаминерги-ческойнейротрансмиссии и, таким образом, отражающих процессы метаболизма альфа-синуклеи-нав дофаминергических нейронах.

Для использования уровня альфа-синуклеина СЭ45 + -клеток в качестве маркера заболевания представляется также важным выявление факторов, влияющих на оцениваемый параметр. Результаты исследований, проведенных in vitro и на модельных животных, предполагают, что изменение уровня дофамина может влиять на уровеньальфа-синуклеина и приводить к формированию нейро-токсичных агрегатов белка в клетке [6, 9].

В настоящем исследовании мы оценили уровень альфа-синуклеина в СЭ45+-клетках крови и уровень дофамина плазмы крови у пациентов с БП, не получавших терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами и в контроле.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование вошли пациенты с вновь диагностированными случаями БП (N=14, средний возраст — 62,8±9,97 года (от 42 до 80 лет)), не получавшие лечения препаратами Л-ДОФА, а также обследуемые контрольной группы (N=17; средний возраст — 68,6 года, от 53 до 86 лет) с отсутствием неврологических расстройств. Исследование было одобрено этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова и проводилось при информировании пациента и получении его согласия.

Выделение СЭ45+-клеток было проведено методом магнитного сортинга с использованием магнитного ручного сепаратора MACS (MiltenyiBiotec, США) и колонок miniMACS типа MS (MiltenyiBiotec, США) изнезамороженной периферической крови. Лизис клеток осуществлялсяс использованием набора TotalProteinExtractionKit (Chemicon (Millipore), США). Измерение общего белка в клеточных лиза-тах было проведено с использованием набора Pierce BCA ProteinAssaykit (ThermoScientific, США). В дальнейших экспериментах были использованы образцы клеточных лизатов, выравненные по концентрации общего белка (по 6 мкг в образце).

Оценка альфа-синуклеина проводилась методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Humanalpha-synuclein ELISA kit (Invitrogen, США). Исследования каждого образца проводились в трех повторах. Оценку уровня дофамина плазмы крови проводили методом ИФА с набором для исследования дофамина в физиологических жидкостях (DopamineResearchELISAAE 5300, LaborDiagnostikaNordGmbh&Co.KG, США). Оптическую плотность оценивали на планшетном спектрофотометре ELx800.

Статистическая обработка данных была проведена с использованием программы «SPSS» версия 12.0. Соответствие полученных данных нормальному распределению проверялось одновыборочным критерием Шапиро — Уилка. Сравнение полученных значений между отдельными группами предполагало использование непараметрического

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ю ° <

и 2

к & я

& о ■& а

к >я н о

3 И < °

й % я &

I &

Л « -& &

Л ш - ё

си ^

з &

ю о

О ф ^ ^

я м

а

ЯШ-

аив-

юло-

.оо-

БП (N=14)

К

(N=17)

критерия Крускала — Уолеса для К-независимых выборок. В случае обнаружения статистически значимых различий проводилось последующее попарное сравнение вариационных рядов исследуемых групп с использованием непараметрического критерия Манна — Уитни для двух независимых выборок. Корреляции между вариационными рядами оценивали с использованием коэффициента корреляции Спирмана (г). Значения р<0,05 считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами был оценен уровень альфа-синуклеина СЭ45 + -клеток крови и уровень дофамина плазмы кровиу пациентов с БП и в контрольной группе. Статистически значимых различий в уровнях дофамина между группами выявлено не было(паци-енты с БП: медиана: 139,54 (мин. — 0,2; макс. — 363,16) пг/мл, контроль: медиана — 45,56 (мин. — 0,02; макс. - 219,8 пг/мл).

В то же время уровень общего альфа-синуклеина в СЭ45+-клетках был выше у пациентов с БП (N=14, медиана: 9,59 (мин. — 2,23; макс. — 36,80) нг/мл) по сравнению с контролем17, медиана — 4,81 (мин. — 1,21; макс. — 28,10) нг/мл) (р = 0,04) (рис. 1).

Корреляцию уровня дофамина плазмы крови и уровня общего альфа-синуклеина С045 + -клеток оценивали в группе пациентов с БП (N=13) и контрольной группе ^=13).Нами выявлена прямая корреляция уровня дофамина плазмы крови и уровня общего альфа-синуклеина СЭ45 + -клеток крови в контрольной группе (г = 0,71; р = 0,007) (рис. 2, а). При этом данная корреляция отсутствовала у пациентов с БП (рис. 2, б).

Нами впервые проведена оценка уровня альфа-синуклеина в однородной фракции СЭ45 + -клеток крови. Данный объект исследования (мононуклеа-ры крови) выбран как наиболее доступные клетки человека, в которых реализуются процессы синтеза дофамина, альфа-синуклеина, и на их мембране представлены рецепторы дофамина и дофаминовый транспортер [5], что позволяет предположить возможность влияния дофамина на внутриклеточные процессы. Применение в исследовании клеточного сортинга позволило избежать возможной примеси эритроцитов в клеточном лизате, что представляется важным, поскольку концентрация альфа-синуклеина в эритроцитах значительно превышает его содержание в мононуклеарах. Выявленное повышение уровня альфа-синуклеина в СЭ45+-клетках у пациентов, не принимающихЛ-ДОФА-содержащие препараты на ранних стадиях развития БП (1 — 11 по Хен и Яру), позволяет рассматривать возможность использования оценки уровня альфа-синуклеина в СЭ45 + -клетках в качестве потенциального маркера развития БП. В настоящее

Рис. 1. Уровеньальфа-синуклеинавС045 + -клетках периферической крови в группе пациентов с БП и в контрольной группе (К). Результаты представлены в виде ящичных диаграмм с указанием медианы, 25 — 75 %-х квартилей, минимальных и максимальных значений

время предполагается, что маркером развития БП может служить уровень олигомерных форм альфа-синуклеина в СМЖ [3].Следует отметить, что забор СМЖ-жидкости является инвазивной процедурой, проведение которой не всегда возможно. В этой связи исследование биомаркераБП в клетках крови представляется более перспективным при проведении скрининговых исследований.

Анализ уровня дофамина в плазме крови и уровня альфа-синуклеина в СЭ45 + -клетках крови показал положительную корреляцию в контрольной группе. Следует отметить, что ранее в исследованиях туг£гобыло показано, что степень метилирования регуляторных областей гена альфа-синукле-ина (БЫСЛ) снижается при воздействии дофамина, приводя к увеличению экспрессии гена [10], что может объяснять механизм влияния дофамина на уровень альфа-синуклеина путем повышения экспрессии гена БЫСЛ. С другой стороны, увеличение концентрации дофамина может приводить к появлению модифицированных форм альфа-синуклеина, что может усиливать агрегацию белка и нарушать его деградацию в клетке [1, 7].

Следует отметить, что ранее у пациентов с БП было продемонстрировано увеличение концентрации дофамина в периферических лимфоцитах и тромбоцитах крови при пероральном введении препаратов Л-ДОФА [8, 11]. В настоящее исследование были включены пациенты с БП, не принимавшие препараты Л-ДОФА. Отсутствие корреляции уровня дофамина плазмы с уровнем альфа-си-нуклеина СЭ45 +-клеток крови у пациентов с БП

10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

Уровень общего альфа-синуклеина, нг/мл

Уровень общего альфа-синуклеина, нг/мл

Рис. 2. Корреляция уровня дофамина плазмы крови с уровнем общего альфа-синуклеина в С045 + -клетках: а - в контроле (N=13; г = 0,71; р = 0,007); б - у пациентов с БП (N=13, г=- 0,049; р = 0,880)

а

б

может свидетельствовать о нарушении обменных механизмов дофамина и/или альфа-синуклеина при развитии заболевания.

Нами впервые показано повышение уровня аль-фа-синуклеина в СЭ45 + -клетках крови у пациентов с БП по сравнению с лицами с отсутствием неврологических заболеваний. Также впервые была выявлена положительная корреляция уровня дофамина с уровнем альфа-синуклеина у человека, что подтверждает полученные ранее с использованием клеточных культур и экспериментальных животных данные о возможном влиянии дофамина на внутриклеточный уровень альфа-синуклеина.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предположить, что уровень альфа-синук-леина СЭ45+-клеток крови может быть рассмотрен в качестве биомаркера развития БП.

ЛИТЕРАТУРА

1. Anderson J., Walker D. E., Goldstein J. M. et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease // J. Biol. Chem. - 2006. - № 281. - Р. 29739-29752.

2. Barbour R., Kling K., Anderson J. P. et al. Red blood cells are the major source of alpha-synuclein in blood // Neuro-degener. Dis. - 2008. - № 5. - Р. 55-59.

3. Chahine L. M., Stern M. B., Chen-Plotkin A. Blood-based biomarkers for Parkinson's disease // Parkinsonism Relat. Disord. -2014. - № 20. - Р. S99-S103.

4. Cookson M. R., van der BrugM. Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synuclein // Exp. Neurol. - 2008. -№ 209. - P. 5-11.

5. Cosentino M. et al. Human CD4 + CD25+ regulatory T cells selectively express tyrosine hydroxylase and contain endogenous catecholaminessubserving an autocrine/paracrine inhibitory functional loop // Blood. - 2007. - № 109. - Р. 632-642.

6. Feany M. B., Bender W. W. A drosophila model of Parkinson's disease // Nature. - 2000. - № 404. - Р. 394-398.

7. Fujiwara H, Hasegawa M, Dohmae N. et al. Alpha-Synucle in isphosphory lated in synucle inopathylesions // Nat. Cell. Biol. - 2002. - № 4(2). - Р. 160-164.

8. Martignoni et al. Peripheral markers of oxidative stress in Parkinson's disease. The role of L-DOPA // Free Rad. Biol. & Med. - 1999. - № 27. - Р. 428-437.

9. Masliah E., Rockenstein E., Veinbergs I. et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders // Science. -2000. - № 287. - Р. 1265-1269.

10. Matsumoto L., Takuma H., Tamaoka A. et al. CpGde-methylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease // Plos. ONE. - 2010. -№ 5. - P. e15522.

11. Rajda C. et al. Increased dopamine content in lymphocytes from high-dose L-Dopa-treated Parkinson's disease patients // Neuroimmunomodulation. - 2005. - № 12 (2). - Р. 81-84

12. Shi M., Zabetian C. P., Hancock A. M. et al. Significance and confouders of peripheral DJ-1 and alpha-synuclein in Parkinson's disease // Neurosci. Lett. - 2010. - № 480. - Р. 78-82.

13. Yasuda T., Nakata Y, MochizukiH. б-Synuclein and neuronal cell death // Mol. Neurobiol. - 2013. - № 47. - Р. 466-483.

РЕЗЮМЕ

П. А. Андоскин, А. К. Емельянов, М. А. Николаев, К. А. Сенкевич, В. П. Шилин, А. А. Тимофеева, А. Ф. Якимовский, С. Н. Пчелина

Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синукле-ина CD45+-клеток крови при болезни Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) - распространенное нейро-дегенеративное заболевание. Центральным звеном патогенеза БП считается нарушение метаболизма белка альфа-синуклеина. В ряде исследований последних лет рассматривалась возможность использования альфа-синуклеина периферических жидкостей в качестве биомаркера развития БП, однако предполагается, что гемолиз влияет на уровень альфа-синуклеина в плазме и СМЖ. С целью исключе-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ния фактора контаминации лимфоцитарной фракции эритроцитами нами был предложен алгоритм, основанный на измерении уровня альфа-синуклеина в однородной фракции С045 + -клеток крови. Для проведения исследования была сформирована группа пациентов с БП (N=14) и не имеющая неврологических расстройств контрольная группа (N=17). В ходе исследования было выявлено повышение уровня общего альфа-синуклеинаС045+-клеток крови в группе пациентов с БП по сравнению с контролем (р = 0,04), а также выявлена прямая корреляция уровня дофамина плазмы крови и уровня общего альфа-синуклеинаС045 + -клеток в контрольной группе (г = 0,71, р = 0,007). Можно предположить, что уровень альфа-синуклеинаС045+-клеток крови может быть рассмотрен в качестве биомаркера развития БП.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, альфа-синукле-ин, дофамин, С045+ клетки, биомаркер.

SUMMARY

Р. A. Andoskin, A. [<. Emelyanov, A. Nikolaev, ^ A. Senkevich, V. Р. Shilin, A. F. Yakimovskiy, A. A. Timofeeva, S. N. Pchelina

Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative disease

Metabolic impairment of alpha-synuclein protein is considered to be the central event in PDpathogenesis. Recent studies explored usage of alpha-synuclein in peripheral fluids as a biomarker of PD, however alpha-synuclein level in the CSF and plasma is considered to be affected by hemolysis. In order to avoid contamination of a lymphocyte fraction by erythrocytes, we have proposed an algorithm based on measurements of alpha-synuclein levels in the homogeneous CD45+ cell blood fraction. For this study we formed a group of PD patients (N=14) and a control group without the neurological disorders (N=17). We found an increase in the level of the total alpha-synuclein in CD45+ cells of PD patients compared to controls (p = 0,04), and revealed a direct correlation between the level of dopamine in plasma and level of total alpha-synuclein in CD45+ cells in the control group (r=0,71, p = 0,007).The level of alpha-synuclein in CD45+ cells could be suggested as possible PD biomarker.

Keywords: Parkinson's disease; alpha-synuclein; dopamine; CD45+ cells; biomarker.

© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 616-056.257:616.12

О. В. Листопад, Е. А. Баженова, В. А. Ионин, О. Д. Беляева, Е. И. Баранова

АПЕЛИН И РЕМОДЕЛИРОВА-НИЕ СЕРДЦА У БОЛЬНЫХ АБДОМИНАЛЬНЫМ ОЖИРЕНИЕМ

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр, Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

Распространенность ожирения во всем мире в последние десятилетия увеличивается. Установлено, что ожирение является независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, которые являются одной из основных причин смертности населения [9, 17].

Одним из механизмов, определяющих развитие сердечно-сосудистых осложнений при ожирении, является ремоделирование сердечно-сосудистой системы. Многочисленные исследования показали, что при ожирении возникают структурные и функциональные изменения сердца. Доказано, что ожирение приводит к развитию гипертрофии левого желудочка [2, 4], увеличению размеров левого желудочка и левого предсердия [7], нарушению диастолической функции левого желудочка [8]. При морбидном ожирении нарушается систо-

лическая функция левого желудочка, что приводит к развитию сердечной недостаточности [5].

Известно, что жировая ткань секретирует множество медиаторов, называемых адипоцитокинами [12]. Проведен ряд исследований, в которых изучалось влияние различных адипоцитокинов на структурные и функциональные параметры сердца. В частности, опубликованы результаты таких исследований с адипонектином, лептином, резистином [11, 13]. Одним из недостаточно изученных адипоцитокинов является апелин. Проведенные исследования продемонстрировали наличие у апелина кардиоп-ротективных свойств. Установлено, что уровень циркулирующего апелина снижен у больных со стабильной стенокардией и хронической сердечной недостаточностью [10]. В экспериментальных исследованиях выявлено уменьшение реперфузионного повреждения миокарда при внутривенной инфузии апелина [14], а также улучшение сократительной способности миокарда [3, 6]. Однако связь уровня апелина с ремоделированием сердца у больных ожирением остается неизученной.

Цель исследования — изучить уровень апелина в плазме крови и его связь со структурно-функциональными параметрами сердца у больных абдоминальным ожирением (АО).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 93 пациента с абдоминальным ожирением (IDF, 2005) и 21 человек с нормальной окружностью талии.

У всех пациентов измеряли антропометрические показатели, определяли уровень апелина в плазме