CC BY
78
УДК 611.37.001.6:616.379-008.64
Л.А. Обухова, Ю.Г. Дружинина, Н.А. Пальчикова, А.И. Калмыкова, В.Г. Селятицкая
ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ПРИЕМА ПРОБИОТИКА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭНДОКРИННОЙ ЧАСТИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН ЗАО «Био-Веста», Новосибирск
Проведено морфометрическое исследование эндокринной части поджелудочной железы, определены концентрации глюкозы и С-пептида в крови у крыс с аллоксановым диабетом на фоне длительного приема пробиотика «Биовестин-Лакто». У здоровых животных под влиянием пробиотика наблюдали гипертрофию островков поджелудочной железы, не сопровождающуюся увеличением их количества. В условиях аллоксанового диабета прием пробиотика вызывал увеличение количества островков поджелудочной железы.
Ключевые слова: пробиотик, аллоксановый диабет, эндокринная часть поджелудочной железы, экспериментальные животные
Аллоксановый диабет у лабораторных животных является моделью инсулинзависимого сахарного диабета, в патогенезе которого ключевую роль играет прогрессирующая гибель р-кле-ток поджелудочной железы. Несмотря на значительный интерес исследователей к развитию клеточных технологий в лечении сахарного диабета, поиск средств, стимулирующих регенерацию собственных р-клеток, остается актуальной научной проблемой [15]. Ранее нами было показано, что использование комплексного пробиотика «Биовестин-Лакто» у крыс с аллоксановым диабетом сопровождается рядом эффектов как местного, так и системного характера. В частности, усиливаются барьерные свойства эпителия слизистой оболочки толстой кишки, ускоряются процессы нормализации углеводного обмена, уменьшается тяжесть течения сахарного диабета [2, 5].
В работе изучали влияние длительного приема пробиотика «Биовестин-Лакто» на морфофункциональное состояние эндокринной части поджелудочной железы у здоровых и больных сахарным диабетом животных.
Методика
Эксперименты были проведены на половозрелых крысах-самцах Вистар, полученных из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Содержание, уход за животными и выведение их из эксперимента осущест-
вляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. №755).
Экспериментальных животных (n=69) делили на 4 группы: «К» — крысы, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,5 мл молока (n=12); «БВ» — крысы, получавшие по той же схеме по 0,5 мл пробиотика (n=15); «Ал» — крысы с аллоксановым диабетом, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,5 мл молока (n=14); «Ал+БВ» — крысы с аллоксановым диабетом, получавшие по той же схеме по 0,5 мл пробиотика (n=28).
Экспериментальный сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением диабетогенной дозы аллоксана — 17 мг/100 г массы тела. Использовали жидкий комплексный пробиотик «Биовестин-Лакто» фирмы ЗАО «Биовеста», состоящий из 2 штаммов бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis), 1 штамма лактобактерий (Lactobacterium plantarum) и продуктов метаболизма представителей индигенной микрофлоры.
На 3-й, 5-й и 8-й неделях эксперимента в крови животных измеряли содержание глюкозы ферментативным колориметрическим методом с использованием набора «FLUTEST®GLU» (Biocon, Германия) и С-пептида — радиоиммунным мето-
дом с использованием набора C-PEPTIDE RIA CT (ZenTech, Бельгия).
Для морфологического исследования поджелудочную железу фиксировали в жидкости Теллесницкого, проводили через серию спиртов возрастающей концентрации, ацетон, ксилол, заливали в гистопласт. Срезы толщиной 5 и 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, азуром В и эозином, по Маллори. Проводили морфометрическое исследование поджелудочной железы [1]. Методом точечного счета определяли относительный объем (Vv, %) и индивидуальные размеры (площадь, мм2) островков поджелудочной железы. Подсчитывали количество островков на стандартной площади среза (N/100 мм2), определяли частоту встречаемости фокальных зон в поджелудочной железе в каждой группе животных.
Статистическую обработку материала проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 6 («StatSoft» США). Для сравнения экспериментальных групп по изученным признакам после проведения дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллису применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Данные в таблицах представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильных размахов (25-й и 75-й процен-тили). Достоверность отличий между группами по частоте встречаемости островков разного размера в поджелудочной железе экспериментальных животных оценивали с использованием критерия %-квадрат [4]. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при 5% уровне значимости.
Результаты
Морфометрическое исследование поджелудочной железы у здоровых животных, получав-
ших пробиотик «Биовестин-Лакто», выявило тенденцию к увеличению относительного объема островков поджелудочной железы к концу 8-й недели, что было связано с изменением характера их распределения в зависимости от размера: увеличением количества более крупных и уменьшением количества более мелких островков (Рис. 1). При этом их численная плотность оставалась в пределах контрольных значений (Таблица 1).
При микроскопическом исследовании поджелудочной железы в центральной зоне островков наблюдали гипертрофированные эндокринные клетки, расширенные кровеносные капилляры. Таким образом, морфологические данные указывают на повышение функциональной активности эндокринной части поджелудочной железы.
Анализ биохимических показателей у здоровых крыс, получавших пробиотик «Биовестин-Лакто», показал, что в динамике наблюдения увеличивались концентрации глюкозы и С-пептида в крови (Таблица 2). Возможные механизмы повышения уровня глюкозы в крови крыс, длительное время получавших пробиотик, обсуждались ранее [5]. Сопоставление результатов морфологического и биохимического исследований свидетельствуют об адекватной реакции эндокринной части поджелудочной железы в ответ на изменения обмена веществ под влиянием пробиотика «Биовестин-Лакто». Полученные данные согласуются с результатами исследований других авторов. По мнению S. Bonner-Weir [8], умеренная гипергликемия является одним из основных стимулов к повышению функциональной активности и размножению р-клеток островков Лангерганса. Структурная адаптация эндокринной части под-
Контроль БВ 5 нед Ал 3 нед Ал 8 нед Ал+БВ 5 нед
БВ 3 нед БВ 8 нед Ал 5 нед Ал+БВ 3 нед Ал+БВ 8 нед
Размеры островков: Н 2*10 Змм2 П 4*10
] (5-1 0)*10 Змм2
Рис. 1. Количество островков разного размера на стандартной площади среза поджелудочной железы экспериментальных животных
Отличия в характере распределения статистически значимы (р<0,05): а — по сравнению с контрольной группой; б — по сравнению с данными на 5-й неделе в соответствующих группах; в — по сравнению с группой Ал.
3 Z
мм
>10*10 мм
Таблица 1
Результаты морфометрического исследования эндокринной части поджелудочной железы
экспериментальных животных
Экспериментальная группа Общее количество островков поджелудочной железы на стандартной площади 100 мм2 Относительный объем островков поджелудочной железы (%)
3 недели 5 недель 8 недель 3 недели 5 недель 8 недель
Контроль 67,5 (55,5 — 80,5) 0,82 (0,58 — 0,92)
БВ 72,1 (64,1-72,6) 79,3 (65,9-85,3) 69,1 (65,7-99,1) 0,73 (0,57-1,20) 0,81 (0,70-0,89) 1,00 (0,77-1,16)
Ал 32,4 а (28,7-36,6) 48,2 а (37,9-53,5) 36,4 а (36,3-41,2) 0,31 а (0,23-0,38) 0,62 (0,25-0,66) 0,32 а (0,27-0,37)
Ал+БВ 38,3 а, б, в (33,4-53,2) 46,2 а, б (39,3-59,5) 54,7 а, б, г (50,3-58,4) 0,38 а,б (0,31-0,47) 0,38 (0,32-0,74) 0,54 б, г (0,46-0,74)
Примечания: а — статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05); б — статистически значимые отличия от группы БВ (р<0,05); в — статистически значимые отличия от группы Ал+БВ, 8 недель (р<0,05); г — статистически значимые отличия от группы Ал (р<0,05).
Таблица 2
Содержание С-пептида и глюкозы в крови экспериментальных животных
Экспериментальная группа С-пептид (нг/мл) Глюкоза (ммоль/л)
3 недели 5 недель 8 недель 3 недели 5 недель 8 недель
Контроль 0,57 (0,49-0,60) 6.6 (6.4-6,8)
0,60 0,57 0,69а 6,5 6,6 7,5а
(0,51-0,72) (0,51-0,60) (0,60-0,90) (6,1-6,9) (6,3-6,8) (7,2-7,5)
0,21а 0,18 0,41 23,5а 40,3а 23,2а
Ал (0,18-0,21) (0,12-0,75) (0,18-0,62) (18,2-26,1) (36,4-43,7) (15,3-38,7)
0,35а, б 0,29а 0,54 16,6а, б 27,7а. б 13,7а, б
(0,09-0,51) (0,09-0,45) (0,21-0,72) (8,1-24,9) (12,8-35,8) (10,5-19,2)
Примечания: а — статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05); б — статистически значимые отличия от группы БВ (р<0,05).
желудочной железы к возрастающей нагрузке в условиях повышенного углеводного обмена, как правило, происходит за счет увеличения объема существующих островков, обусловленного пролиферацией и гипертрофией р-клеток [7].
В литературе последних лет активно обсуждаются и другие пути увеличения объема эндокринной паренхимы поджелудочной железы у взрослых животных, в частности, неогенез р-клеток из камбиальных элементов — стволовых, полуство-ловых клеток и клеток-предшественников [11, 13, 15]. А. Lechner, _|.Е НаЬепег [12] различают неогенез отдельных р-клеток, образующихся из стволовых клеток, находящихся внутри существующих островков, и неогенез островков из стволовых клеток, локализующихся в стенке протоков. Первый из указанных процессов имеет место уже через 23 дня после стимуляции, а для реализации второго требуется около 40 дней. S. Bonner-Weir с соавторами [6] обнаружили в поджелудочной железе взрослых крыс после частичной панкреатэктомии так называемые фокальные зоны, представляющие собой участки ткани поджелудочной железы, состоящие из множества мелких протоков с высоким уровнем пролиферативной активности эпителиальных клеток. Фокальная зона является транзиторной структурой, которая может дифференцироваться как в островки Лангерганса, так и
в ацинусы с формированием новых долек поджелудочной железы, структурно не отличающихся от уже существующих. Авторы рассматривают этот путь регенерации у взрослых животных как рекапитуляцию эмбрионального развития поджелудочной железы. М. Lipsett, D.T. Еinegood [14] на модели пролонгированной гипергликемии, вызванной внутривенным введением 50% раствора глюкозы мышам, получили результаты, свидетельствующие о возможности формирования фокальных зон из малодифференцированных клеток ацинусов. В этом и других исследованиях [10, 14] обращают на себя внимание данные об инфильтрации ткани поджелудочной железы лимфоидными клетками, предшествующей образованию фокальных зон. Высказывается мнение, что цитокины и факторы роста, продуцируемые иммунокомпетентными клетками, могут влиять на направление дифференцировки фокальных зон — в сторону эндокринной или экзокринной паренхимы.
Результаты исследования показали, что у 4 из 12 (33%) контрольных животных в поджелудочной железе присутствовали фокальные зоны. Размеры их значительно варьировали — от 0,04 до 0,17 мм2. Характерной особенностью фокальных зон являлась инфильтрация их стромы лимфоцитами и нейтрофильными гранулоци-
тами, реже — эозинофильными гранулоцитами. Известно, что лактобактерии оказывают модулирующее действие на иммунные функции организма — повышают активность лимфоидной ткани, усиливают реакции клеточного и гуморального иммунитета, стимулируют продукцию цитокинов [3]. Структурные изменения, выявленные в нашем эксперименте, могли быть обусловлены регуляторными влияниями лимфоидных клеток на морфогенетические процессы в поджелудочной железе. Фокальные зоны имели разную степень дифференцировки: от недифференцированных, состоящих только из мелких протоков, до более продвинутых, включающих как эндокринные структуры в виде скоплений островковых клеток или сформировавшихся островков, так и ацину-сы; иногда и те, и другие вместе. Наличие фокальных зон в поджелудочной железе в нормальных условиях жизнедеятельности может быть связано с естественными процессами обновления ткани поджелудочной железы. По современным представлениям р-клетки поджелудочной железы не являются статичной популяцией, их общее количество и индивидуальные размеры могут возрастать и уменьшаться для поддержания уровня глюкозы в пределах узких физиологических границ [8, 9].
При анализе срезов поджелудочной железы у животных, получавших пробиотик в течение 3 и 8 недель, фокальные зоны не были обнаружены, а на 5-й неделе они присутствовали в поджелудочной железе у 3 из 5 (60%) крыс. Размеры их варьировали в тех же пределах, что и в контроле — от
0,04 до 0,14 мм2. Следует отметить, что образование фокальных зон у этих животных не сопровождалось увеличением количества островков, в том числе и новообразованных мелких. Наличие или отсутствие фокальных зон на разных сроках приема пробиотика, возможно, отражает структурно-функциональную динамичность поджелудочной железы в физиологических условиях жизнедеятельности.
У крыс с аллоксановым диабетом на всех сроках наблюдения в крови был повышен уровень глюкозы (Таблица2). Содержание С-пептида через
3 недели после введения аллоксана было достоверно снижено по сравнению с контролем, через 5 и 8 недель — медиана этого показателя была меньше, чем у контрольных животных, но в связи с большой вариабельностью данных различия не были статистически значимыми (Таблица 2).
В поджелудочной железе на всех сроках эксперимента была достоверно снижена численная плотность островков поджелудочной железы по сравнению с контролем, на 3-й и 8-й неделях снижен также и их относительный объем. Прослеживалась
фазность изменений морфометрических показателей (Таблица 1), совпадающая с колебаниями уровней глюкозы и С-пептида в крови (Таблица 2).
У крыс с аллоксановым диабетом в поджелудочной железе присутствовали фокальные зоны: через 3 недели после введения аллоксана — у 2 из
4 крыс (50%), через 5 недель — у 2 из 5 (40%), через 8 недель — у 1 из 5 (20%). Снижение частоты встречаемости фокальных зон у животных данной экспериментальной группы к концу эксперимента может свидетельствовать о включении механизма регенерации поджелудочной железы через формирование фокальных зон на ранних этапах развития заболевания. Отсутствие увеличения количества островков, вероятно, указывает на то, что эти зоны дифференцируются в направлении экзокринной части поджелудочной железы.
У крыс с аллоксановым диабетом, получавших пробиотик «Биовестин-Лакто», медиана содержания глюкозы в крови была достоверно выше этого показателя у контрольных животных, но ниже, чем у крыс с аллоксановым диабетом без коррекции. Содержание С-пептида на 3-й и 5-й неделях эксперимента снижалось, а к концу 8-й недели восстанавливалось до контрольного уровня (Таблица 2).
В поджелудочной железе крыс с аллоксано-вым диабетом, получавших «Биовестин-Лакто», относительный объем островков Лангерганса и их численная плотность на 8-й неделе эксперимента статистически значимо превышала таковую в группе животных с аллоксановым диабетом, не получавших пробиотик, хотя и не достигала уровня контрольных значений (Таблица 1). Характер распределения островков в зависимости от их размера различался между экспериментальными группами. Из рисунка 1 видно, что на 3-й неделе эксперимента число мелких новообразованных островков повышалось по сравнению с таковым у животных без коррекции заболевания. На 5-й неделе наблюдался сдвиг в сторону более крупных островков по сравнению с предыдущим сроком наблюдения; на 8-й неделе увеличивалось число как мелких, так и крупных островков.
У животных с аллоксановым диабетом, получавших пробиотик, в поджелудочной железе также зарегистрировано наличие фокальных зон: через 3 недели эксперимента — у 6 крыс из 11 (60%), через 5 недель — у 4 из 10 (40%), через 8 недель — у 2 из 7 (29%). Анализ данных показывает, что при аллоксановом диабете на фоне приема пробиотика «Биовестин-Лакто» образование фокальных зон в поджелудочной железе сопровождалось увеличением количества островков Лангерганса (Таблица 1). Динамика изменений их размеров свидетельствует о даль-
нейшем росте и развитии новообразованных островков.
Полученные результаты позволяют предположить наличие морфогенетических эффектов пробиотика «Биовестин-Лакто» — прямых или опосредованных клетками лимфоидной системы, присутствующими в фокальных зонах в большом количестве. Эти эффекты проявляются в способности оказывать влияние на направление дифференцировки фокальных зон в сторону эндокринной паренхимы поджелудочной железы при состояниях, сопровождающихся гибелью р-клеток островков Лангерганса.
Заключение
Результаты проведенного исследования показали, что длительный прием пробиотика «Биовестин-Лакто» здоровыми животными вызывает умеренное повышение уровня глюкозы в крови и гипертрофию существующих островков Лангерганса. В условиях аллоксанового диабета, сопровождающегося гибелью р-клеток островков поджелудочной железы, прием пробиотика оказывает положительное влияние на регенерацию ее эндокринной части, стимулируя неогенез островков, в том числе через образование фокальных зон.
INFLUENCE OF LONGTERM PROBIOTIC INTAKE ON MORPHOFUNCTIONAL CONDITION OF ENDOCRINE PART OF PANCREAS IN EXPERIMENTAL ANIMALS WITH ALLOXAN DIABETES L.A. Obuchova, Yu.G. Druzhinina, N.A. Palchikova, A.I. Kalmykova, V.G. Selyatitskaya
Morphometric study of endocrine part of the pancreas was conducted, concentrations of glucose and C-peptide in blood of rats with alloxan diabetes on the background of long acceptance of probiotic “Bio-vestin-Lacto” were determined. The hypertrophy of the pancreas isles not accompanied with increasing of their amount was observed in healthy animals under the influence of probiotic. In terms of alloxan diabetes the probiotic intake caused an increased amount of the pancreas isles.
Литература
1. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфомет-рия / Г.Г. Автандилов. — М., 1990. — 383 с.
2. Дружинина, Ю.Г. Влияние пробиотика «Биовестин-Лакто» на течение аллоксанового диабета и регенерацию панкреатических островков у крыс / Ю.Г. Дружинина, Н.А. Пальчикова, Л.А. Обухова // Бюллетень сибирской медицины. — 2005. — Т. 4. — Приложение 1. — С. 86.
3. Николаева, Т.Н. Иммуностимулирующая и антиканцерогенная активность нормальной лактофлоры кишечника / Т.Н. Николаева, В.В. Зорина, В.М. Бондаренко // Терапевтическая гастроэнтерология. — 2004. — № 4. — С. 39-44.
4. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных / О.Ю. Реброва. — М., 2003.
— 312 с.
5. Системная реакция организма экспериментальных животных на длительный прием пробиотика / А.И. Калмыкова, Н.А. Пальчикова, Н.П. Бгатова, и др. // Бюл. СО РАМН. — 2005. — № 3.
— С. 97-101.
6. A second pathway for regeneration of adult endocrine pancreas. A possible recapitulation of embryonic development / S. Bonner-Weir, L.A. Baxter, G.T. Schuppin, F.E. Smith // Diabetes. — 1993. — Vol. 42.
— № 12. — P. 1715-1720.
7. Bock, T. Increased islet volume but unchanged islet number in ob/ob mice / T. Bock, B. Pakkenberg, K. Buschard // Diabetes. — 2003. — Vol. 52. — № 7.
— P. 1716-1722.
8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic p cell growth / S. Bonner-Weir // Endocrinology.
— 2000. — Vol.141. — № 6. — P. 1926-1929.
9. Bouwens, L. Regulation of pancreatic betacell mass / L. Bouwens, I. Rooman // Physoil. Rev.
— 2005. — Vol. 85. — № 4. — P. 1255-1270.
10. Expression of gastrin and transforming growth factor-alfa during duct to islet cell differentiation in the pancreas of duct-ligated adult rats / R.N. Wang, J.F. Rehfeld, F.C. Nielsen, G. Kloppel // Diabetologia.
— 1997. — Vol. 40. — P. 887-893.
11. Garofano, A. Impaired p-cell regeneration in perinatally malnourished rats: a study with STZ / A. Garofano, P. Czernichow, B. Breant // FASEB J.
— 2000. — Vol. 14. — № 15. — P. 2611-2617.
12. Leichner, A. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus / A. Leichner, J.F. Habener // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. — 2003. — Vol. 284.
— № 2. — P. 259-266.
13. Levine, F. No pancreatic endocrine stem cells? / F. Levine, M. Mercola // New England J. Med. — 2004. — Vol. 351. — № 10. — P. 1024-1026.
14. Lipsett, M. p-cell neogenesis during prolonged hyperglycemia in rats / M. Lipsett, D.T. Finegood // Diabetes. — 2002. — Vol. 51. — № 6. — P. 1834-1841.
15. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reaction of neurogenin-3 / C.S. Lee, D.D. De Leon, K. H. Kaestner, D.A. Stoffers // Diabetes. — 2006. — Vol. 55. — № 2. — P.269-272.
