CC BY
21
УДК 591.437:616.379-008.64
ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦНОНАЛЬНОГО состояния ЭНДОКРИННОЙ ЧАСТИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА НА ФОНЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ
Т.А. Шубина, А.М. Ульянов
(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: shubina.74@mail.ru)
Было показано, что многократное (7 дней) интраназальное введение пептидов PGArg, и GPArg в дозе 1 мг/кг массы тела животных перед введением им диабетогенной дозы аллоксана способствовало сохранению нормогликемии в крови. Аналогичное введение крысам пептида PGPArg не обеспечивало защиту организма от развития инсулинозависимого сахарного диабета. Количество островков в поджелудочной железе данной группы оставалось сопоставимым с нормой, однако общее количество клеток в островке было достоверно ниже нормы, как и в контроле. В качестве профилактического антидиабетогенного средства лучшие результаты были получены при использовании пептида GPArg.
Ключевые слова: пептиды, сахарный диабет, поджелудочная железа.
Вследствие широкой распространенности инсулинозависимого сахарного диабета (ИЗСД) актуальна необходимость поиска новых подходов к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что критическая роль в развитии данного заболевания принадлежит ß-клеткам (они составляют 75% от общего количества клеток в островках Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ) (Bonner-Weir, 2000а; Балаболкин и др., 2005). Прогрессивное снижение инсулина, секретируемого этими клетками, а также, возможно, параллельное развитие инсулинорезистентности приводят к развитию клинически явного диабета, когда происходит деструкция и гибель 85—90% ß-клеток (Jonas et al, 1999; King et al., 2007). Поэтому при разработке новых путей профилактики и лечения ИЗСД в доклинические этапы изучения новых лекарственных средств включают морфологические исследования ПЖ.
Рядом научных исследований было показано, что различные регуляторные пептиды (Pro-Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro и др.) при пероральном введении беспородным белым крысам в течение недели обеспечивают сохранение в крови уровня гликемии, близкого к физиологической норме, при провокации аллоксаном развития экспериментального сахарного диабета (Ляпина и др., 2002; Ульянов и др., 2005). Известно также, что подобные пептиды постоянно образуются в организме при синтезе и деградации коллагена (Ашмарин и др., 1998; Ашмарин и др., 2002). Однако время нахождения их в кровотоке различно. Продемонстрировано усиление стабильности трипептида Gly-Pro-Arg
вследствие присоединения к пептиду Gly-Pro аминокислоты Arg. Эта аминокислота, содержащаяся в трипептиде Gly-Pro-Arg, входящем в молекулу коллагена, вносит максимальный вклад в местную стабильность тройной спирали коллагена, а также имеет значение при электростатическом взаимодействии образования фибрилл коллагена (Yangt et al., 1997).
В связи с вышеперечисленными данными целью настоящей работы было изучение влияния экзогенных пептидов: Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg и Pro-Gly-Pro-Arg на функциональное состояние инсуляр-ной системы организма и их возможной способности осуществлять протекторный антидиабетогенный эффект при развитии экспериментального сахарного диабета.
Материалы и методы
В экспериментах использовались следующие пептиды: Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Arg и Pro-Gly-Pro-Arg, которые были синтезированы в Институте молекулярной генетики РАН (Москва).
В разных сериях опытов выявляли возможное профилактическое антидиабетогенное действие вышеперечисленных пептидов. Для этого животным (крысам n = 41) предварительно интраназально вводили по 0,05 мл препарата пептида в дозе 1 мг/кг массы тела (опытные группы) или 0,85%-го раствора NaCl (контрольная группа) через каждые 24 ч в течение 7 дней. Животных (массой тела 200—250 г, в возрасте 8—9 мес) содержали на обычном лабораторном рационе. Через час после последнего введения препаратов у всех (опытных и контрольных) крыс вызывали диабет однократной инъек-
цией в яремную вену раствора аллоксана (фирма "Spofa", Чехия) в дозе 37,5 мг/кг после 18-24-часового голодания животных. Содержание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Взятие крови у крыс для определения уровня сахара осуществляли из яремной вены до введения аллоксана (т.е. на фоне многократного интраназа-льного применения пептидов) и через 7, 14 дней после отмены введения препаратов пептидов. В качестве консерванта использовали 3,8%-й раствор лимоннокислого натрия в соотношении кровь : консервант как 9:1. Концентрацию сахара в крови определяли модифицированным методом Хагедор-на—Иенсена (Канторович, 1963).
После последнего взятия крови проводили эвтаназию животных, брали биоптаты ткани поджелудочной железы (ПЖ), которые фиксировали в 10%-м формалине для последующей гистологической оценки морфофункционального состояния данного органа. На самозамораживающем микротоме готовили срезы толщиной 10—15 мкм из фиксированных кусочков ПЖ (по всем отделам), которые предварительно (в течение 24 ч) промывались проточной водой. Далее их наклеивали по модифицированному методу Н.Н. Аничкова на предметные стекла, окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной схеме (Валовая, Кавтарадзе, 1993) и заключали в канадский бальзам. В полученных срезах подсчитывали количество островков Лангерганса в поле зрения микроскопа фирмы "Биолам" при увеличении 15 х 10, а также общее количество клеток в островке (увеличение 15 х 40) во всех отобранных образцах.
При обработке полученных результатов использовали стандартные методы статистического анализа (Гублер, 1978). При сравнении характеристик массивов применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Все данные в таблицах представлены в виде среднее ± ошибка среднего.
Результаты
Как видно из табл. 1, через 7 дней после введения всем животным аллоксана на фоне введенных препаратов (пептидов) или физиологического раствора (контроль) уровень сахара в крови опытных крыс, где использовали GPArg и PGArg, значительно не изменялся. В опытной группе, где интрана-зально вводили PGPArg, концентрация сахара увеличивалась в 2 раза, причем данное повышение сохранялось и через неделю. В крови контрольных животных наблюдалось резкое повышение уровня сахара в 2,3 раза по сравнению с исходным. Эти изменения сохранялись и через 7 дней.
Таблица 1
Изменение концентрации сахара в крови крыс до и после введения аллоксана после предварительного 7-дневного интраназального введения пептидов ОРА^, РОА^ и РОРА^
Вводимый интра-назально препарат (в дозе 1 мк/кг) Концентрация сахара в крови (мг%)
исходная: до введения аллоксана через 7 дней после введения аллоксана через 14 дней после введения аллоксана
Контроль 0,85%-й р-р NaCl 105,6 ± 4,1 n = 10 296,3 ± 48,3 n = 7 249,0 ± 34,5 n = 6
GP-Arg 90,0 ± 4,1 n = 10 115,0** ± 3,9 n = 10 115,5** ± 5,4 n = 10
PG-Arg 105,1 ± 1,5 n = 11 94,4 ± 5,8** n = 10 109,2** ± 7,8 n = 10
PGP-Arg 101,6 ± 6,6 n = 10 220,0 ± 24,7 n = 10 223,3 ± 13,8 n = 10
Примечание. Статистические показатели были рассчитаны относительно соответствующих проб контроля. ** — р < 0,01.
Таким образом, предварительное интраназаль-ное введение животным пептидов ОРЛг§ и РОЛг§ способствовало достоверному сохранению нормо-гликемии в крови при провокации развития у них аллоксанового диабета. Пептид же РОРЛг§ подобным действием не обладал.
В табл. 2 приведены данные по гистологическому исследованию ПЖ крыс опытных и контрольных групп через 14 дней после введения аллоксана.
Таблица 2
Количество островков и общее количество клеток в островке Лангерганса ПЖ крыс с аллоксановым диабетом после предварительного 7-дневного интраназального введения им пептидов ОРА^, РОА^ и РОРА^
Группы Количество островков в поле зрения микроскопа, шт Общее количество клеток в островке, шт
GPArg 3,8 ± 0,8 n = 10 p1 < 0,05 151,1 ± 32,1 n = 30
PGArg 2,6 ± 0,6 n = 10 157,9 ± 12,9 n = 25
PGPArg 3,8 ± 0,6 n = 10 p1 < 0,05 140,5 ± 14,1 n = 35 p2 < 0,02
Контрольная группа 2,0 ± 0,5 n = 12 p2 < 0,05 139,9 ± 16,4 n = 20 p2 < 0,05
Норма 3,6 ± 0,5 n = 8 212,7 ± 32,1 n = 29
Примечание. Статистические показатели были рассчитаны отдельно относительно нормы и контрольной группы: р1 — достоверно по отношению к контролю; р2 — достоверно по отношению к норме.
Морфофункциональное состояние ПЖ по гистологической картине у животных без предварительного интраназального введения пептидов (или физиологического раствора) и без провокации развития аллоксанового диабета было принято за норму.
В ПЖ крыс с аллоксановым диабетом, получавших предварительно интраназально ОРЛг§ и рорлгб, численная плотность островков на 14 день после введения аллоксана была сопоставима с нормой. В группе, где животные получали РОЛг§, число островков не превышало статистически значимо уровень контрольных значений, т.е. в том случае, где крысам интраназально вводили физиологический раствор.
Обсуждение
По современным представлениям, р-клетки ПЖ не являются статичной популяцией, их общее количество и индивидуальные размеры могут возрастать и уменьшаться для поддержания уровня глюкозы в пределах узких физиологических границ (Воппег-'МЫг, 2000Ь; Во^еш, 2005). По мере развития ИЗСД наблюдается прогрессирующая гибель Р-клеток ПЖ, увеличивается уровень гипергликемии в крови.
Интересно отметить, что интраназальное введение животным пептида РОРЛг§ не способствовало достоверному сохранению нормогликемии в крови. Как видно из табл. 2, количество островков в ПЖ данной группы оставалось сопоставимым с нормой, однако общее количество клеток в эндокринном островке было достоверно ниже нормы, как и в контроле.
Исследования Т. КаШоИ с соавторами (Шифман, Теплухина, 1997), которые выполняли морфомет-рию и оценивали эндокринную функцию панкреатических островков в зависимости от их размера, показали, что эндокринная функция ПЖ человека определяется количеством больших островков. Наряду с этим было показано, что чем меньше островок, тем меньше в нем содержание а-клеток; основную массу таких островков составляют р-клетки. Внешняя форма ПЖ крысы, а также ее отношение к брюшине не соответствуют описанной ПЖ у человека. Однако ее внутреннее строение ("эндокринное") имеет единый план структурной организации с позвоночными, в том числе и человеком (Захарова, 2006). Таким образом, можно предположить, что пептид РОРЛгБ не обладал протекторным действием при развитии аллоксанового диабета у крыс из-за некомпенсированной гибели р-клеток.
Напротив, при интраназальном введении пептида РОЛгБ поддержание нормогликемии в крови можно объяснить лучшим сохранением пула Р-кле-ток в островках.
Результаты проведенного исследования позволяют предположить возможность использования инт-раназального введения пептидов ОРЛг§, РОЛг§ и РОРЛг§ в качестве профилактики развития ИЗСД в эксперименте. Наиболее перспективным в данном направлении является использование трипеп-тида ОРЛг§.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ля-пина Л.А., Самонина Г.Е. 1998. Простейшие пролинсодержащие пептиды PG, GP, PGP и GPGG: ре-гуляторная активность и возможные источники биосинтеза // Биохимия. 63. № 2. 134—141.
Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ля-пина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. 2002. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. № 1. 24—27.
Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. 2005. Лечение сахарного диабета и его осложнений. М.
Валовая М.А., Кавтарадзе Д.Н. 1993. Микротехника: правила, приемы, искусство, эксперимент. М.
Гублер Е.В. 1978. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.
Захарова И.В. 2006. Строение поджелудочной железы у крысы в норме и после воздействия гравитационных перегрузок: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб.
Канторович Л.С. 1963. Способ определения сахара в крови и других биологических жидкостях // Бюл. изобрет. и товарных знаков. № 21.
Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ульянов А.М., Тарасов Ю.А., Ашмарин И.П. 2002. Влияние желатина и пептида Pro-Gly-Pro на состо-
яние противосвертывающей системы и на развитие экспериментального диабета // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 7—10.
Ульянов А.М., Ляпина Л.А., Шубина Т . А. 2005. Влияние пептида Phe-Pro-Gly-Pro на развитие аллоксанового диабета и состояние противо-свертывающей системы // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. № 4. 19—21.
Шифман Е.М., Теплухина Е.В. 1997. Critical. http: // www. critical. ru
Bonner-Weir S. 2000а. Islet growth and development in the adult // Molecular. Endocrin. N 24. 297—302.
Bonner-Weir S. 2000b. Perspective: Postnatal pancreatic p cell growth // Endocrinology. 141. N 6. 1926—1929.
Bouwens L. 2005. Regulation of pancreatic beta-cell mass // Physoil. Rev. 85. N 4. 1255—1270.
Jonas J.-C., Sharma A., Hesenkamp W., Ilkova H., Patane G., La-ybutt R., Bonner-Weir S., Weir G.C. 1999. Chronic hyperglycemia triggers loss of pancreatic p cell differentiation in an animal model of diabetes // J. Biol. Chem. 274. Issue 20. 14112—14121.
King A.J.F., Fernandes J.R., Hollister-Lock J., Nienaber C.E., Bonner-Weir S., Weir G.C. 2007. Normal relationship of p- and non-p-cells not needed for successful islet transplantation // Diabetes. 56. 2312—2318.
Yangt W., Chant V.C., Kirkpatricki A., triple-helix of host-peptides // J. boil. chem. 272. N 46. Hamshaws J.A.M., Brodsky B. 1997. Gly-Pro- 28837-28840. Arg confers stability similar to Gly-Pro-Hyp in the collagen
Поступила в редакцию 17.12.07
PECULIARITY OF MORPHOFUNCTION STATE OF THE ENDOCRINE PART
OF THE PANCREAS AT THE DEVELOPMENT OF THE EXPERIMENTAL
DIABETES AGAINST THE BACKGROUND OF REGULATORY PEPTIDES
T.A.Shubina, A.M. Uljanov
It has been shown, that chronicle (7 days) intranasal injection of PGArg and GPArg peptide in a doze of 1mg/kg of weight of a body of animals before injection to them diabetogenic dozes alloxan promoted preservation normoglycemia in blood. Similar introduction to rats PGPArg peptide did not provide protection of an organism from diabetes mellitus development. The quantity islets in a pancreas of this group remains comparable to norm, however, the total of cells in islet was authentic below norm, as well as in the control. As preventive antidiabetic means the best results have been received at use GPArg peptide.
Key words: peptides, diabetes mellitus, pancreas.
Сведения об авторах
Шубина Татьяна Александровна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: Shubina.74@mail.ru
Ульянов Александр Михайлович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. 939-28-95; e-mail: Shubina.74@mail.ru
