CC BY
4
Общие вопросы гигиены
О В. С. ПОЛКОВ. В. М. ЬОШ). 1997 УДК 612.014.46.84
В. С. Волков, В. М. Боев
ВЛИЯНИЕ ДИОКСИНА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ
Оренбургская медицинская академия
К настоящему времени доказано, что ведущая роль в обезвреживании как экзогенных, так и эндогенных веществ принадлежит системе цито-хром Р-450 [1,3, 5].
Анализ доступных научных работ по исследованию изменений биохимических процессов в организме млекопитающих при воздействии диоксина свидетельствует о том, что диоксин вызывает индукцию ферментов монооксигеназной системы печени |9. 12|. В то же время повышение активности ферментов монооксигеназной системы печени способствует более интенсивной биотрансформации экзогенных чужеродных соединений, т. е. налицо защитный эффект [б, 8]. Остается открытым вопрос о связи повышения активности ферментов этой системы с токсическим действием диоксина на организм. Поэтому целыо настоящего исследования стало экспериментальное изучение активности микросомальных монооксиге-наз печени в динамике при воздействии разных доз диоксина.
Эксперименты проведены на 220 белых нелинейных крысах-самцах массой 130—150 г, которые были разделены на 4 группы. 1-я служила контролем. Крысы 2—4-й групп получали диоксин в дозах 0,01, 0,001 и 0,0005 мг/кг. Диоксин (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксии) вводили внутрижелудочно эластичным зондом в 0,3 мл 5% раствора крахмала через день в течение 14 сут. Животные контрольной группы получали только раствор крахмала в том же объеме и по той же схеме. Биохимические исследования проводились через трое суток после последнего введения вещества в динамике — на 3, 7, 14, 21, 28 и 35-е сутки. При всех исследованиях была принята единая схема эксперимента. Перед умерщвлением животные в течение 24 ч не получали пищи. Печень животных перфузировали холодным 1,15% раствором КС1 и взвешивали. Выделяли фракцию микросом |1). В суспензии микросом определяли количество белка |10|, которое выражали в мг на I г ткани печени. Уровни цитохромов Р-450 и В5 определяли спектрофотометрически [11] и выражали в нМоль на 1 мг белка, скорости Ь1-демети-лирования амидопирина, п-гидроксилирования анилина определяли по общепринятому методу [2] и выражали в нМоль на 1 мг микросомального белка в минуту. Результаты обработаны статистически по Стыоденту.
Из полученных результатов (табл. 1, А) видно, что на протяжении всего эксперимента масса печени подопытных животных практически не изменяется. Микросомальный белок повышается к 14-м и снижается к 35-м сугкам эксперимента.
Активность всех исследуемых микросомальных оксигеназ печени существенно возрастает и достоверно отличается от контрольных величин. Так, уже на 3-й сутки активность цитохрома Р-450 превосходит контрольное значение на 130% и последовательно нарастает во все сроки исследования, достигая максимума активности на 28-е сутки. В период между 28 и 35 сутками последующего повышения его активности не отмечено, но величина ее намного превосходит контрольные значения. Наибольшее повышение активности именно этого фермента отмечено в работах с использованием уже известных индукторов микросомальных оксигеназ печени [3, 8, 9|. Данное обстоятельство позволяет сделать вывод о том, что диоксин, попадая в организм млекопитающих, вызывает индукцию цитохрома Р-450, по динамике существенно отличающейся от таковой, вызываемой другими известными индукторами.
Повышается активность цитохрома В5. но в сравнении с Р-450 активность его возрастает менее выражснно. Пик возрастания активности цитохрома В5 приходится на 21-е сутки эксперимента; на 28-е и 35-е сутки она остается высокой, но последующего (от 21-х суток) возрастания ее не выявлено.
Активность 1Ч-деметилазы амидопирина и п-гидроксилазы анилина также возрастает. Пик повышения активности приходится на 28-е сутки.
Представленные в таблице 1, ¿"данные показывают, что при затравке животных более высокой дозой диоксина (0,001 мг/кг) выявлен однонаправленный характер изменений исследуемых показателей, но в количественном отношении они более выражены. В этой серии эксперимента начиная с 7-х суток достоверно увеличивалась относительная масса печени подопытных животных. Увеличение относительной массы печени не носило нарастающего характера и оставалась примерно на одном уровне до конца опыта. Увеличение содержания микросомального белка, хотя и не было резко выраженным, но достоверно отличалось от контроля с 7-х суток эксперимента. В большей степени увеличивалось содержание цитохрома Р-450 и цитохрома В5, значительно возрастали скорости М-деметилирования амидопирина и п-гидроксилирования анилина.
В 4-й группе животных диоксин вводили в дозе 0,01 мг/кг. При семикратном введении этой дозы (величина суммарной дозы относится к категории сублетальной) у животных наблюдали все клинические симптомы отравления. В период между 21-ми и 35-ми сутками после последнего вве-
Таблица 1
Активность микросомальных оксигеназ печени белых крыс после хронического воздействия диоксина (М ± то)
Показатель | Контроль
Срок исследсиания, сутки
3-й : 7-е ! 14-е | 21-е ] 28-е I 35-е А. Доза 0.0005 мг/кг
Масса печени (г на 100 г
массы тела) 5.12 ± 0.14 5.20 ±0.11 4.96 ± 0.12 5.15 ± 0.14 5.23 ± 0.12 5.35 ± 0.12 5.32 ± 0.11 Микросомальный белок 4.55 ± 0.23 5.46 ± 0.27* 5.11 ± 0.28 5.59 ± 0.25* 4.31 ± 0.18 4.49 ± 0.21 4.03 ± 0.17 N-деметилаза амидопирина 3.87 ±0,31 7.05 ±1.18* 8.13 ±2.10* 11,22 ± 2.34* 14.32 ± 2.51* 14,38 ± 2.53* 13,55 ± 2.47* п-Гидроксилаза анилина 0,175 ± 0.01 0.298 ± 0,021* 0,385 ± 0,034* 0,455 ± 0.037* 0.788 ± 0,043* 0.858 ± 0,041* 0.823 ± 0.038* Цитохром Р-450 0.87 ± 0.03 2,00 ± 0,05* 2,69 ± 0,11* 3.57 ± 0.14* 6,26 ±0,18* 6,79 ± 0,24* 6,61 ± 0,27* Цитохром В5 0,52 ± 0.04 0.78 ± 0.06* 0.99 ± 0.05* 1.25 ± 0,11* 1.775 ± 0.12* 1,66 ± 0,14* 1,54 ± 0,12*
Б. Доза 0.001 мг/кг
Масса печени (г на 100 г
массы тела) 5,05 ± 0,14 5.12 ± 0.12 5.41 ±0.11* 5.63 ± 0.12* 5.42 ± 0,14* 5.44 ± 0.12* 5,38 ±0,11* Микросомальный белок 5.04 ±0,14 6,51 ± 0.17* 6.93 ± 0.35* 6.72 ± 0.25* 7,45 ± 0,29* 6,89 ± 0,31* 6.27 ± 0.27* К-дсмстилаза амидопирина 3.64 ± 0,42 11.65 ±0,64* 13.10 ±0.81* 14.56 ± 1,12* 15,29 ± 1,15* 15,65 ± 1,21* 16.02 ± 1,24* п-Гидроксилаза анилина 0,143 ± 0,010 0,443 ± 0,017* 0,529 ± 0,023* 0,772 ± 0,021* 0,872 ± 0,025* 0,972 ± 0,034* 0,958 ± 0,041* Цитохром Р-450 0,74 + 0.06 2,52 ±0,11* 3,85 ± 0.33 5,85 ± 0.51* 7,69 ± 1.17* 8,21 ± 1,25* 8.07 ± 1,27* Цитохром В3 0,56 ± 0,02 1,01 ± 0.04* 1,46 ±0,11* 1,74 ± 0,14* 2,86 ± 0.17* 2,69 ± 0,25* 2,74 ± 0,21*
В. Доза 0.01 мг/кг
Масса печени (г на 100 г
массы тела) 4.85 ± 0.12 5,82 ± 0.21* 5,в5 ± 0.23* 6.10 ± 0.24* 5,90 ± 0.21* 5,72 ± 0,25* 5.64 ± 0.21* Микросомальный белок 4.37 ±0,11 5.79 ± 0.14* 6,36 ±0,12* 7.71 ±0,15* 6,32 ±0.14* 5.76 ±0.16* 5,35 ± 0.12* 1М-демстилаза амидопирина 3,45 ± 0.22 12.42 ±1,12" 14,84 ± 1,17* 15,53 ±2.11* 18,02 ± 2,21* 18.98 ± 2,27* 18.63 ± 2.31* п-Гидроксилаза анилина 0.158 ± 0.012 0.664 ± 0.015* 0.964 ± 0.027* 1.09 ± 0,034* 1,280 ± 0,054* 1,359 ± 0.067* 1,296 ± 0.051* Цитохром Р-450 0.78 ± 0.04 3,90 ± 0,12* 5,93 ± 0,15* 8.58 ± 0,21* 11.39 ± 1.12* 12,09 ± 1,15* 11.70 ±1,14* Цитохром В5 0,61 ± 0,03 1.59 ±0.07* 2,14 ± 0.06* 3,05 ± 0.14* 3.90 ± 0,17* 4,21 ± 0,24* 4.15 ± 0,21*
П р и м е ч а н и с . Звездочка — достоверные различия с контролем при р < 0,05.
дения диоксина летальные исходы составляли 20—30%. Как видно (табл. 1, В), изменения исследуемых показателей микросомальной моноок-сигеназной системы печени животных носят более выраженный характер. Выявлено резкое увеличение содержание цитохрома Р-450 уже в начале исследования. На 3-й сутки после последнего введения диоксина его содержание превышало контрольное значение в 5 раз. Существенное нарастание содержания цитохрома Р-450 прослеживалось до 28-х суток эксперимента — пика его активности, когда его содержание превосходило контрольный уровень в 15,5 раз.
Повышение уровня цитохрома В5, в сравнении с изменением активности цитохрома Р-450, не столь выражено, хотя в количественном отношении он значительно превосходит контрольные цифры.
При этих условиях эксперимента выявлено и значительное возрастание скорости 1М-деметили-рования амидопирина и п-гидроксилирования анилина. Вместе с тем скорость п-гидроксилирования анилина повышает более интенсивно в сравнении со скоростью Т^-деметилирования амидопирина. Скорость обоих вышеназванных процессов существенно возрастает в течение эксперимента, достигая максимума на 28-е сутки. К 35-м суткам она уже не повышается, но и не отмечено ее снижения.
Анализ полученных данных показывает, что многократное введение диоксина вызывает выраженную индукцию цитохрома Р-450. Если в доступной зарубежной литературе говорится о влия-
нии диоксина на активность микросомальных мо-нооксигеназ печени без подтверждения этого высказывания фактическим экспериментальным материалом, то в настоящих исследованиях, на основании статистически достоверных экспериментальных данных, доказан не только факт индуцирования диоксином микросомальных моноокси-геназ печени млекопитающих, но и степень выраженности этой индукции в динамике. Кроме того, эксперимент позволил выявить достоверную линейную связь индуцирующего эффекта с дозой диоксина. При введении диоксина в дозах от минимально действующей до сублетальной четко определяется дозозависимая направленность степени выраженности индуцирующего действия этого ксенобиотика на микросомальные моноксигена-зы печени подопытных животных (табл. 2).
Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами исследований отечественных авторов [4, 7, 8), которые оценивали свойства различных химических соединений (лекарственные препараты, промышленные химические вещества и т. д.). Они отмечают, что первоначальная индукция цитохрома Р-450 является пусковым механизмом для последующей индукции других оксигеназ, так как цитохром Р-450 — главенствующий фермент этой системы и от его активности зависит функционирование всей ферментной системы. Необходимо отметить, что рассматриваемая ферментная система во многих работах называется системой оксидаз со смешанными функциями (ОСФ), в которой цитохрому Р-450 также отводится ведущая роль. В то же время
Таблица 2
Степень выраженпости индукции микросомальных монооксигеназ печени белых крыс в зависимости от дозы диоксина (отношение средней величины показателя в опыте к таковому в контроле)
Показатель
Доза дпок-сина, мг/кг j j
Срок исследования, сутки
7-е I 14-е | 21-е | 2S-c
35-е
Цитохром Р-450
Цитохром В,
N-деметила-за амидопирина
п-Гидрокси-лаза анилина
0,01 0,001 0.0005 0.01 0,001 0.0005 0.01 0.001 0.0005 0,01 0,001 0.0005
5.0
3.4 2.3 2.6 1.8
1.5
3.6 3.2 1.8 4.2
3.1
1.7
7.6
5.2
3.1
3.5
2.6 1.9
4.3
3.6 2,1 6.1
3.7
2.2
11.0 7.9 4.1
5.0
3.1
2.4
4.5 4.1 2,9 6.9 5.4
2.6
14.6 10.4
7.2 6,4
5.1
3.4
5.3
4.2 3.7 8.1 6,1
4.5
15.5 11.1
7.8
6.9
4.8
3.2
5.5
4.3
3.7
8.6
6.8
4.9
15.0 10,9
7.6 6.8 4.9
3.1 5,4
4.4
3.5
8.2
6.7 4,7
нельзя не отметить несколько иной характер индуцирующего действия диоксина. Обращает на себя внимание резкий, "взрывной" характер индуцирующего эффекта этого ксенобиотика по отношению, в первую очередь, к цитохрому Р-450 и другим показателям монооксигеназной ферментной системы микросом печени. В отличие от диоксина другие индуцирующие агенты с выраженным индуцирующим эффектом и даже в очень больших дозах вызывают плавный индуцирующий эффект, причем, естественно, не такой выраженный. Еще одной особенностью индуцирующего
действия диоксина является одномоментный, если его можно так характеризовать, или параллельный, индуцирующий эффект по отношению не только к цитохрому Р-450 и В5, но и к другим микросомальным монооксигеназам печени.
Таким образом, экспериментально доказано выраженное действие диоксина на активность микросомальных монооксигеназ печени млекопитающих, при этом выявлен дозозависимый эффект.
Л итсратура
1. Арчаков А. П., Девичепскин В. М., Карузипа И. И. // Биохимия. - 1968. - Т. 33. № 3. - С. 479-487.
2. Карузина II. И., Арча ков А. И. // Современные методы в биохимии. — М„ 1977. — С. 49—63.
3. Ковалев И. Е. // Цитохром Р—450 и охрана внутренней среды человека. — Пущино. I9S5. — С. 10—1 1.
4. Ковалев И. £".. Пирузяп Л. А., Шатерников О. А. // Докл. АН СССР. - 1982. - Т. 265, № 1. - С. 247-249.
5. Никоиороп А. А., Перепелкии С. В., Смагип Г. Н. и др. // Гиг. и сан. - 1991. - № 3. - С. 13—14.
6. Парк Д. В. Биохимия чужеродных соединений: Пер. с англ. — М.. 1981.
7. Ратников В. И., Рябишша Н. Е., Островская Р. У. // Бюл. экспср. биол. — 1982. — № 10. — С. 56—58.
8. Рябишша И. Е.. Ковалей И. Е. //Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека. — Пущино. 1985. — С. 78.
9. Neat R. А. // Environ Health Perspect. — 1985. — Vol. 60. — P. 41-46.
10. Lowry O. //., Rosebrough N. J., Farr A. L.. Randall R. J. // J. biol. Chcm. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
11. Отига Т.. Sato R. // Metli. Enzymol. — 1964. — Vol. 10. — P. 556-561.
12. Рощег II., Schlatter Ch. // Chemospherc. - 1953. - Vol. 12, N 4-5. - P. 453-462.
Поступили 27.12.%
«5 Л. Д. ШЕЙКО. В. Г1. МАМИНА. 1997 УДК 612.617-014.1-06:546.761.084
77. Л. Шейко, В. П. Мамина ДЕЙСТВИЕ ШЕСТИВАЛЕНТНОГО ХРОМА НА СПЕРМАТОГЕННЫЙ ЭПИТЕЛИЙ И ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ГОНАДАХ ЛАБОРАТОРНЫХ
ЖИВОТНЫХ
НИИ охраны материнства и младенчества. Екатеринбург; НИИ экологии растений и животных Уральского ОАН РФ,
Екатеринбург
Соединения Сг6+ являются одним из опасных токсичных агентов, широко использующихся в различных отраслях промышленности. Данные литературы свидетельствуют об отрицательном влиянии Сг6+ на организм человека и животных [10] . В ряде работ отмечалось гонадотоксическое действие соединений Сг6+, которое касалось в основном женской репродуктивный системы [4, 8].
Данные о влиянии хрома на мужскую половую систему единичны и не систематезированы: одни авторы изучали гонадотоксический эффект [5], другие — состояние ферментной системы в клетках семенника [13]. В связи с этим механизм действия хрома на репродуктивную систему изучен недостаточно.
Важным звеном в изучении механизмов повреждающего действия Сг6+ на сперматогенный эпителий является определение функционального состояния клеточных мембран, которое зависит от процессов перекисного окисления липидов. Изу-
чение механизмов действия Сг6+ на гонады, особенно в невысоких дозах, дает возможность вести целенаправленный поиск путей защиты половой системы от воздействующих токсических элементов. Данных литературы о процессах липоперок-сидации в семенниках мьг не встречали.
В данной работе сделана попытка выявить взаимосвязь повреждения сперматогенного эпителия и состояния перекисного окисления липидов в гонадах.
Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар с массой тела 230—260 г. Интоксикацию вызывали внутрибрюшинным введением би-хромата калия в дозах, соответствующих 1/10 (1-я группа), 1/100 (2-я группа), 1/1000 (3-я группа) ЬО50 (ЬО50 28 мг/кг) в течение сперматогенного цикла (48—50 дней) 5 раз в неделю.
В конце экспозиционного периода часть животных декапитировали для оценки состояния сперматогенеза, процессов перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной систе-
- зо —
