CC BY
53
УДК 615.9:576.344+616-056.3
М.В. Долгушин. Л.М. Соседова
ВЛИЯНИЕ ДИОКСИДА СЕРЫ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МОРСКИХ СВИНОК, СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИМ АЛЛЕРГЕНОМ
АФ НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Ангарск)
Изучали влияние диоксида серы, в низкой концентрации (2—4 мг/м3) на состояние обмена в лимфоцитах периферической крови, морских свинок, сенсибилизированных биологическим, аллергеном, (белоксодержащей пылью). С этой целью оценивали, активность сукцинатдегидрогеназы, лактатдегид-рогеназы, неспецифической эстеразы и кислой фосфатазы. Показано, что при сочетанном, воздействии биологического и химического факторов в лимфоцитах имеют, место определенные ферментативные изменения, предшествующие прогрессированию аллергического процесса. Наблюдается возрастание активности лактатдегидрогеназы, снижение уровня сукцинатдегидрогеназы., что может сопровождаться, уменьшением, активности, неспецифической, эстеразы. и. отсутствием, достоверных изменений со стороны, кислой фосфатазы. Данная реакция, не обнаруживается, в лимфоцитах при. изолированном, введении биологического и. химического факторов, а также в том. случае, когда сочетанное воздействие белоксодержащей пыли. и. диоксида серы, не приводит, к возрастанию параметров гиперчувствительности.
Ключевые слова: лимфоциты, метаболизм, сенсибилизация, диоксид серы
SULPHUR DIOXIDE EFFECTS ON ENZYME ACTIVITY IN THE PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES OF GUINEA PIGS SENSIBILIZED WITH BIOLOGICAL ALLERGENS
M.V. Dolgushin, L.M. Sosedova
Research Institute of Industrial Medicine and Human Ecology, Branch of Scientific Centre of Medical
Ecology, Eastern Siberian Scientific Centre of RAMS, Angarsk
Sulphur dioxide effect in low concentrations (2—4 mg/m3) on metabolic state has been studied, in the peripheral blood lymphocytes of guinea pigs sensibilized with a biological allergen (protein bearing dust). To understand. this effect succinate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, nonspecific esterase and acidic phosphatase activities have been assessed. Some fermentative alterations, which preceded progressing allergic processes, were shown to take place in a combined, exposure to biological and chemical factors in the lymphocytes. The increase in lactate dehydrogenase activity, decrease in succinate dehydrogenase levels were observed which may be accompanied by the reduction in nonspecific esterase activity and the absence of significant alterations in acidic phosphatase. This response was not found to be observed in the lymphocytes in an isolated, administration, of biological and. chemical factors including the case when a combined, exposure to protein bearing dust and. sulphur dioxide will not lead, to increase in hypersensitivity parameters. Key words: lymphocytes, metabolism, hypersensitivity, sulphur dioxide
Функциональные расстройства на уровне иммунной системы сопровождаются дифференцированными изменениями характера обменных процессов в лимфоцитах периферической крови [7, 8]. В связи с этим представляет интерес изучение метаболических особенностей данных клеток при различных иммунопатологических состояниях.
К настоящему времени детально исследованы ферментативные сдвиги в лимфоцитах периферической крови после воздействия аллергенами биологической природы, в том числе и готовыми продуктами биотехнологического синтеза [8]. Известно, что специфические реакции замедленной и немедленной гиперчувствительности могут быть усилены дополнительной химической нагрузкой, даже при относительно низкой интенсивности последней [5, 11, 12]. В то же время влияние продуктов биотехнологического синтеза на обменные процессы в иммунокомпетентных клетках в случае дополнительной химической экспозиции ранее практически не изучалось. При этом в ходе проведения
подобных исследований желательно получить данные о специфике ответной реакции лимфоцитов после антигенного воздействия в различных дозах, учитывая возможность интенсификации нагрузки при длительном контакте с биологическими аллергенами в производственных условиях.
Исходя из вышеизложенного, основная направленность настоящей работы состояла в том, чтобы оценить характер изменения уровня гидро-лаз и оксидоредуктаз в лимфоцитах в зависимости от степени выраженности реакций гиперчувствительности, имеющих место в результате сочетанного воздействия биологического и химического факторов.
МЕТОДИКА
В опыте было использовано 100 морских свинок, массой 250 — 350 г, предоставленных ГНЦ ВБ «Вектор». Постановка эксперимента осуществлялась по ранее разработанной схеме, позволяющей моделировать степень выраженности реакций ги-
перчувствительности в зависимости от интенсивности и последовательности поступления биологического и химического факторов [11, 12]. Согласно условиям данной модели, в качестве сенсибилизирующего агента использовали белоксодержащую пыль (БСП), приготовленную из готового продукта биотехнологического производства кормовых дрожжей, а в качестве химического — диоксид серы (SO2). Ингаляцию диоксидом серы проводили в течение 10 дней, в концентрации 2 — 4 мг/м3 (по 4 часа ежедневно).
Все животные были разделены на 10 групп (по 8—12 особей в каждой). При этом 1-я группа была контрольной, а на особей 2-ой группы оказывали изолированное химическое воздействие.
Морским свинкам 3 — 6-й групп однократно вводили 500 мкг БСП в смеси с неполным адъювантом Фрейнда под апоневроз задней лапки. Животные 3-й группы подвергались изолированному воздействию БСП, а 4 — 6-й групп — сочетанному влиянию БСП и SO2. При этом ингаляционную экспозицию диоксидом серы начинали проводить за 14 дней до введения БСП (4-я группа), в день введения БСП (5-я группа) или через 14 дней после введения БСП (6-я группа). Оценку метаболического статуса лимфоцитов опытных животных проводили после прекращения ингаляции диоксидом серы (2 и 6-я группы) или через 14 дней после введения БСП (3, 4 и 5-я группы).
На морских свинках, входящих в 7 — 10-ю группы, изучали характер ответной реакции лимфоцитов на сочетанное воздействие биологического и химического факторов при ингаляционном введении диоксида серы на фоне высокодозной иммунологической толерантности (ВДТ), вызванной БСП. Для создания модели ВДТ всем животным однократно внутрисердечно вводили 5000 мкг водорастворимого полисахаридного антигена (ПСА), приготовленного из БСП, а через 14 дней — 500 мкг БСП в смеси с неполным адъювантом Фрейнда под апоневроз задней лапки [13]. Особи 7-й группы подвергались только воздействию ПСА и БСП, тогда как животные 8, 9 и 10-й групп — сочетанному влиянию биологического и химического факторов. При этом период начала ингаляции приходился на 14-е сутки после введения ПСА (8-я группа), на следующий день после поступления ПСА (9-я группа) и за 14 дней до введения ПСА (10-я группа). Метаболические показатели в лимфоцитах оценивали через 14 дней после введения 500 мкг БСП.
Определение активности ферментов проводили на мазках периферической крови с использованием цитохимических методов. Выявляли уровень сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [3], лактатдегидроге-назы (ЛДГ) [14], лизосомальной кислой фосфатазы (КФ) [1], а также неспецифической эстеразы (НЭ), используя в качестве субстрата нафтол-AS-D-аце-тат [3]. Реакцию на КФ применяли для оценки состояния лизосомальных мембран, выявляя уровень «свободной», «общей» и «связанной» активности фермента [4]. Возрастание «свободной» активности КФ при одновременном снижении «связанной»
свидетельствовало о дестабилизации лизосомаль-ных мембран [4]. Параллельно в лимфоцитах проводили цитохимическое определение активности тартратрезистентной КФ (трКФ), добавляя в инкубационную среду Ь-винную кислоту, из расчета 200 мг на 30 мл раствора [14]. Результаты определения активности ферментов выражали полуколиче-ственно, в условных единицах цитохимического индекса (ЦХИ) [3], а также в процентах положительно реагирующих клеток.
После забора крови осуществляли постановку тестов немедленной и замедленной гиперчувствительности. Оценивали уровень кожно-сенсибили-зирующих антител, выявляемых при помощи реакции пассивной кожной анафилаксии по Овери (РПКА), выраженность положительных внутри-кожных аллергических проб и реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) со специфическим антигеном [12].
Достоверность полученных данных оценивали при помощи непараметрического критерия Вил-коксона — Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Метаболические изменения в лимфоцитах периферической крови по отношению к контролю отмечались у животных всех опытных групп (табл. 1, 2). При этом эффект 802 на энзиматический статус лимфоцитов сенсибилизированных морских свинок отличался от влияния на интакт-ных, у которых имел место переход на более рациональное расходование субстратов окисления при параллельной функциональной активации лизосом. Сочетанное поступление биологического и химического факторов приводило к дестабилизации лизосомальных мембран, не зависящей от характера изменения активности дегидрогеназ.
Ответная реакция лимфоцитов на воздействие 802 у морских свинок с ВДТ не ограничивалась сдвигами на уровне СДГ, ЛДГ и в состоянии лизосом (табл. 2). В данном случае общая тенденция состояла в снижении активности ферментов по отношению к контролю, а также по отношению к животным, подвергавшимся изолированному воздействию аллергена (7-я группа). Отмеченный при этом параллелизм в характере изменения со стороны СДГ и НЭ выражался не только в достоверном уменьшении их активности по отношению к контролю (9 и 10-я группы). Наблюдалась положительная корреляционная связь между средними значениями данных ферментативных параметров в опытных группах ( + 0,981; р< 0,05). А характерные для сочетанного воздействия биологического и химического факторов (8 — 10-я группы) показатели активности фосфатаз в лимфоцитах по существу отражали возникающее при воздействии 802 ингибирование стимулирующего эффекта, вызванного изолированным введением аллергена. Возрастание уровня «свободной» КФ в лимфоцитах периферической крови морских свинок, составляющих 8 и 9ю группы, в принципе не противоречило указанной тенденции, поскольку было обусловлено нарушени-
Таблица 1
Метаболические изменения в лимфоцитах периферической крови морских свинок при изолированном и сочетанном воздействии белоксодержащей пыли (БСП) и диоксида серы (Э02)
Группа Показатель 1 (контроль) 2 (в02) 3 (БСП) 4 (Б02 + БСП) 5 (БСП и Б02) 6 (БСП + Б02)
СДГ (ЦХИ) 0,65 ± 0,06 0,89 ± 0,06* 0,17 ± 0,07* 0,19 ± 0,04* 0,65 ± 0,03 0,34 ± 0,03*
ЛДГ (ЦХИ) 0,75 ± 0,05 0,55 ± 0,05* 0,38 ± 0,05* 0,25 ± 0,04* 0,82 ± 0,03 0,96 ± 0,05*
НЭ (%) 10,2 ± 0,9 12,2 ± 2,5 13,2 ± 1,4 8,7 ± 1,1 8,0 ± 1,3 10,3 ± 1,7
трКФ (%) 3,2 ± 0,7 9,1 ± 1,6* 13,5 ± 2,1* 17,6 ± 2,0* 20,1 ± 3,7* 16,1 ± 2,5*
КФ «свободная» (ЦХИ) 0,56 ± 0,04 0,76 ± 0,03* 1,22 ± 0,01* 1,05 ± 0,05* 1,05 ± 0,06* 0,90 ± 0,05*
КФ «общая» (ЦХИ) 1,10 ± 0,04 1,13 ± 0,06 1,90 ± 0,06* 1,36 ± 0,08* 1,41 ± 0,08* 1,20 ± 0,07
КФ «связанная» (ЦХИ) 0,56 ± 0,06 0,42 ± 0,05 0,59 ± 0,07 0,30 ± 0,06* 0,40 ± 0,07 0,27 ± 0,04*
Примечание: * - достоверное отличие от контроля (р < 0,01).
Таблица 2
Метаболические изменения в лимфоцитах периферической крови морских свинок с ВДТ к БСП в зависимости от последовательности ингаляций диоксидом серы (Э02)
Группа Показатель 1 (контроль) 7 (ВДТ) 8 (ВДТ + Б02) последовательно 9 (ВДТ и Б02) одновременно 10 (Б02 + ВДТ) последовательно
СДГ (ЦХИ) 0,65 ± 0,07 0,90 ± 0,06* 0,74 ± 0,06 0,36 ± 0,03*^ 0,25 ± 0,04*^
ЛДГ (ЦХИ) 0,75 ± 0,05 1,43 ± 0,12* 1,32 ± 0,12* 1,27 ± 0,04* 1,30 ± 0,07*
НЭ (%) 10,2 ± 0,9 9,1 ± 2,7 8,8 ± 1,8 3,8 ± 1,7* 3,3 ± 0,6* •
трКФ (%) 3,2 ± 0,7 22,1 ± 2,3* 10,2 ± 1,6*^ 4,2 ± 0,8^ 4,7 ± 0,8^
КФ «свободная» (ЦХИ) 0,56 ± 0,04 0,88 ± 0,10* 0,83 ± 0,08* 0,71 ± 0,02* 0,55 ± 0,04^
КФ «общая» (ЦХИ) 1,10 ± 0,04 1,43 ± 0,06* 1,08 ± 0,17 0,80 ± 0,03* 1,01 ± 0,09
КФ «связанная» (ЦХИ) 0,56 ± 0,06 0,58 ± 0,11 0,27 ± 0,05* 0,06 ± 0,02* 0,44 ± 0,09
Примечание: *- достоверное отличие от контроля ф < 0,01); • - достоверное отличие от 7-й группы ф < 0,01).
ем стабильности лизосомальных мембран. Таким образом, характер изменения активности гидролаз зависел от типа ответной реакции организма на воздействие биологического фактора. Согласно полученным результатам (табл. 1), при формировании состояния сенсибилизации к БСП и дополнительном введении диоксида серы (группы 4, 5, 6) в периферической крови не происходило достоверного снижения числа клеток, положительно реагирующих на КФ, НЭ и трКФ (в отличие от воздействия 802 на морских свинок с ВДТ). При этом сопряженность в направленности изменения активности НЭ и трКФ может быть обусловлена общностью в их внутриклеточной локализации — в секреторных гранулах, отличных от истинных лизосом [9, 15].
Выявленные нами при воздействии БСП (3-я группа) изменения уровня СДГ, ЛДГ и КФ в лимфоцитах по существу отражают заключительную фазу ответной реакции на первичное введение антигена [8]. В то же время стимуляция этих ферментов у животных с развившейся ВДТ к БСП (7-я группа) может быть связана с начальной активацией лимфоцитов в ходе ответной реакции на антиген и, по всей видимости, обусловлена сохранением достаточной концентрации последнего в окружающей клетку среде [6, 7]. Напротив, метабо-
лические сдвиги, выявленные нами в лимфоцитах периферической крови при воздействии диоксида серы на животных, сенсибилизированных БСП, или на морских свинок с ВДТ, обоснованно рассматривать как патогенетически значимые. Об этом можно говорить, принимая во внимание полученные на этих же животных в условиях данного эксперимента результаты определения аллерготестов к БСП, которые свидетельствовали о наиболее выраженных реакциях гиперчувствительности у животных в 6, 9 и 10-ой группах (табл. 3, 4).
Сравнительная оценка позволила сделать вывод о том, что отмеченная в лимфоцитах реакция в виде угнетения СДГ и стимуляции ЛДГ при сочетанном воздействии биологического и химического факторов указывает на предрасположенность к прогрессированию иммунопатологического процесса. После введения разрешающей дозы аллергена у этих животных было выявлено возрастание уровня показателей гиперчувствительности как замедленного, так и немедленного типов (кожных аллергических проб, реакций торможения миграции лейкоцитов, пассивной кожной анафилаксии). Сравнение значений аллерготестов с результатами определения активности ферментов в лимфоцитах животных 7 — 10-й групп указывало и на вза-
Таблица 3
Изменение показателей специфического иммунного ответа у морских свинок при сочетанном воздействии белоксодержащей пыли (БСП) и диоксида серы (Э02) по отношению к животным,
сенсибилизированным БСП
Характер воздействия Кожные пробы с аллергеном (см) РПКА (см) РТМЛ с аллергеном (процент положит. реакций) (%)
Изолированное введение БСП (3-я группа) 0,38 ± 0,04 0,28 ± 0,02 72,7
Введение БСП - после воздействия ЭОг (4-ая группа) 0,35 ± 0,07 0,29 ± 0,04 30
Начало воздействия ЭОг - в день введения БСП (5-ая группа) 0,64 ± 0,13 0,30 ± 0,03 70
Начало воздействия ЭОг - через 14 дней после введения БСП (6-ая группа) 0,97 ± 0,15** 0,41 ± 0,06* 100
Примечания: показана достоверность различий по сравнению с 3-й группой (* - P < 0,05; ** - P < 0,01).
Таблица 4
Показатели специфического иммунного ответа у морских свинок с ВДТ в зависимости от последовательности ингаляций диоксида серы (Э02)
Группа Кожные пробы с аллергеном (см) РПКА (см) РТМЛ с аллергеном (процент положит. реакций) (%)
Животные с ВДТ (7-я группа) 0,20 ± 0,05 0,23 ± 0,04 57,1
ВДТ + ЭОг [последовательно] (8-я группа) 0,38 ± 0,05 0,17 ± 0,04 50
ВДТ и ЭОг [одновременно] (9-я группа) 0,68 ± 0,13* 0,27 ± 0,03 100
ЭОг + ВДТ [последовательно] (10-я группа) 0,92 ± 0,15* 0,41 ± 0,03* 100
Примечания: показана достоверность различий по сравнению с 7-й группой (* - P < 0,01).
имосвязь изменения активности гидролаз с нарастанием выраженности иммуноаллергического ответа организма морских свинок. При этом отмечалась обратная зависимость между степенью прогрессирования аллергического процесса и уровнем активности СДГ и НЭ.
Снижение уровня СДГ на фоне стимуляции ЛДГ в лимфоцитах периферической крови ранее было выявлено при силикозе, осложненном туберкулезной интоксикацией [10]. Параллельно происходила активация лизосомальной КФ, в связи с этим авторы предположили, что вышеуказанная реакция со стороны дегидрогеназ является одним из признаков прогрессирования аллергического процесса и может рассматриваться как результат токсического влияния на субклеточные структуры [10]. Однако в проведенном нами эксперименте не обнаружено абсолютной зависимости между вышеуказанным изменением со стороны дегидрогеназ и ранней повреждающей реакцией — нарушением стабильности мембран лизосом. По мнению М.В. Робинсон (1994), в качестве одной из вероятных причин снижения внутриклеточного уровня СДГ при параллельном возрастании реакции на ЛДГ после химических воздействий можно считать повышение содержания незрелых (менее дифференцированных) форм лимфоцитов в периферической крови [7], т.к. сочетание низкой активности СДГ с высокой интенсивностью гликолиза характерно для лимфобластов [7, 14]. Цитохимические исследования последних показали также незначительный уровень активности НЭ, лизосомальной КФ и практически полное отсутствие тартратрезистентной КФ [2, 16].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, характер изменения активности дегидрогеназ и гидролаз в лимфоцитах периферической крови животных, подвергавшихся сочетанному воздействию биологического аллергена и диоксида серы, зависит от степени выраженности реакций гиперчувствительности, определяющихся интенсивностью и последовательностью воздействия изучаемых факторов. При этом выявлены патогенетически значимые сдвиги, связанные с развитием специфических реакций замедленной и немедленной гиперчувствительности. На предрасположенность к прогрессированию иммунопатологического процесса указывает угнетение СДГ при параллельной активации ЛДГ, снижение интенсивности эстеразной реакции, а также отсутствие стимулирующего эффекта, отмеченного для кислой фосфатазы при изолированном воздействии аллергена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алиев В.А. Цитохимическое определение кислой фосфатазы в лейкоцитах крови для оценки влияния атмосферных загрязнений / В.А. Алиев, В.П. Андреева // Лаб. дело. — 1988. — №9. — С. 27 - 30.
2. Евсевьева А.И. Поверхностный фенотип и энзимоцитохимические маркеры В-клеток при активации митогеном лаконоса / А.И. Евсевьева, И.В. Абраменко // Цитология. — 1989. — Т. 31, № 5. — С. 569 — 575.
3. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В.В. Меньшикова. — М., 1987. — 368 с.
4. Михайлов Г.Т. Использование цитохимического метода выявления кислой фосфатазы для оценки функционального состояния лизосом ней-трофилов / Г.Т. Михайлов // Лаб. дело. — 1984. — №8. — С. 468 — 471.
5. Немыря В.И. Экспериментальные данные по оценке биологического эффекта при воздействии химического и биологического факторов / В.И. Немыря, Н.В. Стомахина, М.А. Рябова // Гиг. и сан. — 1993. — № 11. — С. 10—12.
6. Ревской С.Ю. Принципы метаболического контроля механизмов иммунного гомеостаза / С.Ю. Ревской // Физиол. человека. — 1984. — Т. 10, №6. — С. 1005—1018.
7. Робинсон М.В. Морфоцитохимические особенности лимфоцитов в норме, при дестабилизирующих воздействиях и при аутоиммунных процессах и заболеваниях: Дисс. ... докт. биол. наук в форме научного доклада: 03.00.25 / Новосиб. мед. ин-т МЗ РФ. — Новосибирск, 1994. — 58 с.
8. Робинсон М.В. Морфология и метаболизм лимфоцитов / М.В. Робинсон, Л.Б. Топоркова,
B.А. Труфакин. — Новосибирск, 1986. — 128 с.
9. Роговин В.В. Пероксидазосомы — 83 / В.В. Роговин, Р.А. Муравьев, Л.А. Пирузян // Известия АН СССР. Серия биол. — 1983. — № 4. —
C. 510-529.
10. Соколов В.В. Значение цитохимического исследования крови в оценке иммунологических и
токсикологических реакций профессионального генеза / В.В. Соколов, Л.А. Иванова // Профессиональные аллергозы. — Рига, 1976. — С. 142 — 149.
11. Соседова Л.М. Сочетанное действие белоксодержащей пыли и диоксида серы / Л.М. Соседова, В.В. Бенеманский // Мед. труда. — 2000. — № 8. - С. 21 - 24.
12. Соседова Л.М. Влияние диоксида серы на развитие повышенной чувствительности к белоксодержащей пыли / Л.М. Соседова, В.В. Бенеманский, Г.Д. Хамуев и др. // Токсикол. вестник. — 2001. — № 2. — С. 20 — 24.
13. Соседова Л.М. К вопросу о моделировании состояния иммунологической толерантности при воздействии белоксодержащей пыли / Л.М. Соседова, М.В. Долгушин, С.Э. Ганичева // Региональные проблемы гигиены и экологии человека. — Ангарск; Иркутск, 1998. — С. 170—176.
14. Хейхоу Ф.Г.Дж. Гематологическая цитохимия / Ф.Г.Дж. Хейхоу, Д. Кваглино. — М., 1983. — 320 с.
15. Monahan R.A. Ultrastructural localization of nonspecific esterase activity in guinea pig and human monocytes, macrophages and lymphocytes / R.A. Monahan, H.F. Dvorak, A.M. Dvorak // Blood.
— 1981. — Vol. 58, N6. — P. 1089—1099.
16. Rilke F. Morphological characterization of immunoblasts / F. Rilke // Pathol. Research. — 1979.
— Vol. 165, N 1—2. — P. 39.
