CC BY
46
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ СУБСТАНЦИЙ РАЗНЫХ ВИДОВ КРУПЯНОЙ ПЫЛИ
УШКОВ С.А., ШЕВЛЯКОВ В.В., ЭРМ Г.И., ЧЕРНЫШОВА Е.В., БУЙНИЦКАЯ А.В.
ГУ «Республиканский научно-практический центр гигиены»
Резюме. Белоксодержащие субстанции пыли перловой, ячневой, овсяной и гречневой круп в унифицированных условиях внутрикожной сенсибилизации морских свинок вызывают выраженную сенсибилизацию организма (2 класс аллергенной активности) с однотипной активацией смешанных механизмов анафилактического, клеточноопосредованного, антителообусловленного цитотоксического и иммунокомплексного типов аллергических реакций на фоне угнетения фагоцитарной функции гранулоцитов крови и гемотоксических проявлений.
Ключевые слова: экстракты из крупяной пыли, сенсибилизирующее действие на организм лабораторных животных.
Abstract. Albuminiferous substances of pearl-barley, fine-ground barley, oat and buckwheat groats dust in unified conditions of endermic sensitization of guinea-pigs cause expressed sensitization of an organism (the 2nd class of allergenic activity) with homotypic activation of mixed mechanisms of anaphylactic, cell-mediated, caused by antibody cellulotoxic and immunocomplex types of allergic reactions on the background of blood granulocyte phagocytic function depression and hemotoxic manifestations.
Гигиеническими исследованиями на предприятиях производства разных видов крупяной продукции установлено, что наибольший вклад в классификационную оценку степени вредности условий труда работников вносит пылевой фактор (класс 3.13.2) [1, 2, 3]. Вместе с тем, действующая ПДК в воздухе рабочей зоны крупяной пыли (6 мг/м3)
Адрес для корреспонденции: 220012, г.Минск, ул.Академическая, 8, Республиканский научнопрактический центр гигиены. Тел.: 8 (017) 284-13-70-Ушков С.А.
как и других органических пылей растительного происхождения, нормированных ранее по критерию фиброгенного действия с учетом содержания диоксида кремния (которое в растительной пыли не превышает 0,08%), не учитывает различную гетероантигенную составляющую растительной пыли (протеины, ли-попротеиды, полисахариды) и их, возможное, вредное иммунотропное действие на организм. Следовательно, эта ПДК не может обеспечивать безопасные условия труда и профилактику профзаболеваний и требует пересмотра, о чем свидетельствуют результаты иссле-
дований по другим белоксодержащим растительным аэрозолям (комбикорма, мука), нормированным в воздухе по критерию ведущего аллергенного вредного действия на организм их растворимых органических субстанций [4, 5]. Непременным этапом гигиенического регламентирования крупяной пыли является оценка ее потенциальной аллергенной активности.
Цель работы - экспериментально изучить сенсибилизирующее действие разных видов крупяной пыли.
Методы
Единые методические подходы к изучению биологического действия и регламентированию в воздухе рабочей зоны органической пыли по белку были разработаны и апробированы при нормировании органических пылей животного (птицеводческого и животноводческого производств, кормовых дрожжей и добавок), смешанного (комбикормовая) и растительного (мучной) происхождения [6]. Это позволило целенаправленно провести исследования по изучению особенностей аллергического и иммунотоксического действия образцов крупяной пыли (далее - КП).
Для исследования на разных производствах крупяной продукции отобраны из фильтров очистки воздуха вытяжной вентиляции типичные образцы пыли перловой, овсяной, ячневой и гречневой круп, из которых оригинальным методом получены соответствующие экстракты (далее - ЭППК, ЭПОК, ЭПЯК, Э111 К) с максимальным содержанием растворимых веществ, стандартизированные по белку (от 1,57 до 5,3 мг/мл).
Аллергенные свойства экстрактов их КП изучены на экспериментальной модели воспроизведения сенсибилизации путем их внут-рикожного введения в ухо морским свинкам (по 8 в 6 группах) в объеме 100 мкл в стандартной дозе (по 500 мкг по белку) с выявлением специфических и неспецифических биологических эффектов через 2 недели, используя комплекс методов аллерго- и иммунодиагностики, позволяющих оценить механизмы основных типов аллергических реакций [6].
Результаты и обсуждение
Введение экстрактов из КП индуцировало у опытных животных всех опытных групп выраженную гиперчувствительность анафилактического немедленного типа. Активная кожная анафилактическая реакция (АКА) была выражена у большинства опытных животных на ЭППК (6 из 8), а средние величины абсолютного (в 2,3 раза, Р<0,01) и относительного в баллах (в 7,3 раза, Р<0,05) показателей внутрикожного теста опухания уха (ВТОУ) существенно превышали таковые в контроле (табл. 1). На ЭПОК гипериммунный ответ немедленного анафилактического типа был менее сильным, чем на ЭППК - уровень абсолютного показателя ВТОЛ у опытных животных (7 из 8) в 2 раза превышал контрольный (Р<0,05), а относительного показателя - в 4 раза (Р<0,01).
Схожие результаты выявления АКА получены и у опытных животных 3 и 4 групп на введение ЭПЯК и ЭПГК (табл. 2). При этом в опытной группе на ЭПЯК средние величины абсолютного (в 2,6 раза, Р<0,01) и относительного (в 10,4 раза, Р<0,01) показателей ВТОУ существенно превышали таковые в контроле. Подобные, но несколько более низкие уровни АКА регистрировались у опытных животных 4 группы при тестировании ЭПГК - гиперим-мунный ответ немедленного анафилактического типа по абсолютному показателю ВТОУ превышал таковой в контрольной группе в 2 раза (Р<0,05), а по относительному показателю в баллах в 4 раза (Р<0,05).
Наличие анафилактических IgE - антител в крови животных 1 и 2 опытных групп подтверждалось высокими уровнями специфической дегрануляции тучных клеток: показатели РНДТК в опыте с ЭППК в 2,8 раза и в опыте с ЭПОК в 3,3 раза превышали таковые в контрольной группе (соответственно Р<0,05 и Р<0,01). В то же время у животных 3 и 4 опытных групп определялась только статистическая тенденция к повышению уровня РНДТК по сравнению с контролем (соответственно превышение в 2,91 и 2,65 раза, Р<0,1). На провокационные внутрикожные пробы с экстрактами из КП у большинства опытных
Таблица 1
Иммуно-аллергологические показатели у морских свинок, сенсибилизированных внутрикожно в ухо экстрактами из образцов перловой (ЭППК) и овсяной (ЭПОК)
крупяной пыли в дозе по 500 мкг белка/жив.
Показатели, тест-аллергены Группы сравнения (M±m)
Ед. изм. ^^рольн. гр. n=8 1 оп.гр. - ЭППK n=8 2 оп.гр. - ЭПOK n=8
ВТОУ АКА: ЭППК 10-2 мм 6,13±1,87 14,4±2,00** 13,0±2,06*
Н 1 /8 6/8 5/8
Балл 0,12±0,12 0,88±0,23* 0,75±0,25*
ЭПОК 10-2 мм 7,25±1,61 10,8±2,20 14,1±1,70*
Н 2/8 5/8 7/8
Балл 0,25±0,16 0,63±0,20 1,00±0,20**
Г3Т: ЭППК 10- мм 7,62±1,70 20,0±3,70** 8,63±2,20
Н 1 /8 6/8 4/8
Балл 0,25±0,16 1,50±0,46*+ 0,50±0,20
ЭПОК 10-2 мм 7,00±1,30 9,75±3,30 14,8±2,70*
Н 1 /8 4/8 6/8
Балл 0,12±0,12 0,63±0,26 1,00±0,27**+
РНДТК: ЭППК Усл.ед. 0,88±0,29 2,48±0,50* 2,85±1,35
ЭПОК Усл.ед. 1,10±0,42 1,87±0,58 4,01±0,71**
РСНСТ: ЭППК: - к контр. пробе % 41,4±4,73 96,7±16,5** 31,1±4,81
-индекс стимуляции Усл.ед. 1,02±0,01 1,61±0,18** 1,06±0,04°
ЭПОК: - к контр. пробе % 33,8±6,33 50,4±6,07 86,7±9,80***
-индекс стимуляции Усл.ед. 0,97±0,02 1,32±0,04*** 1,65±0,10***
РСЛЛ: ЭППК Н 5/8 7/8 5/8
% 18,1±4,81 29,2±4,80° 16,4±3,84
ЭПОК Н 2/8 4/8 6/8
% 9,34±4,51 14,5±6,72 29,4±6,90*
Комплемент сыв. крови Усл.ед. 60,9±3,44 71,3±5,81 64,7±5,16
РСМП: ЭППК Н 0/8 4/8 -
Log2 тАт 0 0,88±0,35* -
ЭПОК Н 1/8 - 4/7
Log2 тАт 0,12±0,12 - 1,25±0,37*
ЦИК в сыв. крови Усл.ед. 94,1±11,1 87,8±6,97 97,9±8,48
НСТ-тест гранулоцитов крови: -спонтанный, к контр.пр. -ЗН-стимулир: к контр. пр. % 38,2±4,75 24,5±4,840 13,7±5,18***
- индекс стимуляции % 109,1±10,4 56,9±8,98** 67,6±8,80**
Величина фагоцитарного Усл.ед. 1,56±0,07 1,26±0,04** 1,48±0,08
резерва % 70,8±9,22 32,3±5,53** 53,9±8,48
Лизоцим в сыв. кр. % 34,2±2,82 45,5±3,28* 46,1±1,96**
БАСК % 91,7±2,56 89,6±2,79 84,4±3,82
Т-лимфоциты Аг-стиму-лированные ЭППК % 16,4±1,84 15,6±2,00 15,4±1,44
109/л 0,16±0,02 0,18±0,04 0,17±0,03
K 1,07±0,07 1,00±0,10 1,02±0,12
ЭПОК % 15,9±2,17 13,4±2,10 13,7±2,43
109/л 0,17±0,03 0,15±0,04 0,15±0,05
K 1,04±0,11 0,98±0,05 1,00±0,08
Примечание: * - достоверность различий с контролем при Р<0,05; **- при Р<0,01; ***- при Р<0,001; ° - при Р<0,1; + - достоверность различий с контролем по критерию Х при Р<0,05. Н - в числителе количество животных с положительными результатами, в знаменателе - всего в опыте.
Таблица 2
Иммуно-аллергологические показатели у морских свинок, сенсибилизированных внутрикожно в ухо экстрактами из образцов ячневой (ЭПЯК) и гречневой (ЭПГК)
крупяной пыли по 500 мкг белка/жив.
Показатели, тест-аллергены Группы сравнения (М±т)
Ед. изм. ^трол. гр. n=8 3 оп. гр. - ЭПЯK n=8 4 оп. гр. - ЭПГС n=8
ВТОУ АКА: ЭПЯК 10-2 мм 6,13±1,58 16,1±2,82** 8,38±1,58
Н 1 /8 7/8 3/8
Балл 0,12±0,12 1,25±0,31** 0,38±0,16
ЭПГК 10-2 мм 7,75±1,25 10,5±1,55 15,8±2,83*
Н 2/8 3/8 6/8
Балл 0,25±0,16 0,38±0,18 1,00±0,27*
Г3Т: ЭПЯК 10- мм 6,38±1,18 15,0±2,51** 8,13±1,65
Н 1 /8 6/8 3/8
Балл 0,12±0,12 0,88±0,23*+ 0,38±0,18
ЭПГК 10-2 мм 9,25±1,91 12,0±1,55 19,6±2,31**
Н 2/8 4/8 7/8
Балл 0,37±0,26 0,50±0,20 1,38±0,26*+
РНДТК: ЭПЯК Усл.ед. 0,88±0,41 2,56±0,690 1,44±0,50
ЭПГК Усл.ед. 1,13±0,34 2,12±0,64 2,99±1,010
РСНСТ: ЭПЯК: к контр. пробе % 44,8±5,92 109,4±7,37*** 32,5±4,54
индекс стимуляции Усл.ед. 1,04±0,02 1,76±0,06*** 1,12±0,05
ЭПГК: к контр. пробе % 42,1±5,50 20,1±4,52** 94,0±7,87***
индекс стимуляции Усл.ед. 1,05±0,02 1,02±0,05 1,64±0,06***
РСЛЛ: ЭПЯК Н 5/8 7/8 5/8
% 18,1±4,81 29,2±4,80° 16,4±3,84
ЭПГК Н 2/8 4/8 6/8
% 9,34±4,51 14,5±6,72 29,4±6,90*
Комплемент сыв. Крови Усл.ед. 60,9±3,44 66,3±5,80 69,6±5,20
РСМП: ЭПЯК Н 1/8 4/8 -
Log2 тАт 0,12±0,12 0,88±0,35° -
ЭПГК Н 0/8 - 5/8
Log2 тАт 0 - 1,25±0,32**
ЦИК в сыв. Крови Усл.ед. 81,0±3,38 72,4±3,80 79,0±3,18
НСТ-тест гранулоцитов крови: -спонтанный: к контр. пр. -ЗН-стимулир: к контр. пр. % 38,2±4,75 19,6±5,54* 18,3±2,70**
- индекс стимуляции % 109,1±10,4 75,5±4,75** 79,2±7,70*
Величина фагоцитарного резерва Усл.ед. 1,56±0,07 1,49±0,08 1,48±0,09
% 70,8±9,22 55,9±7,64 60,8±7,60
Лизоцим в сыв. кр. % 34,2±2,82 47,8±1,34*** 45,6±1,83**
БАСК % 91,7±2,56 89,6±2,79 84,4±3,82
Т-лимфоциты Аг-стиму-лированные ЭПЯК % 15,3±1,49 9,71±1,15** 14,3±1,32
109/л 0,14±0,03 0,11±0,02 0,20±0,05
K 1,04±0,10 0,61±0,09** 0,86±0,080
ЭПГК % 13,4±0,92 16,9±1,30* 13,8±1,29
109/л 0,16±0,02 0,15±0,02 0,18±0,03
K 0,95±0,09 1, 19±0,18 0,85±0,08
Примечание: * - достоверность различий с контролем при Р<0,05; **- при Р<0,01; ***- при Р<0,001; ° - при Р<0,1; + - достоверность различий с контролем по критерию Х при Р<0,05. Н - в числителе количество животных с положительными результатами, в знаменателе - всего в опыте.
животных всех групп (у 6-7 из 8) отмечались высокие уровни специфических воспалительных кожных реакций, более значимых на ЭППК, свидетельствующие о развитии у животных выраженной гиперчувствительности замедленного клеточноопосредованного типа (ГЗТ). Причем величины абсолютного и относительного показателей ВТОУ через 24 часа после тестирования у опытных животных 1 группы на тест-аллерген ЭППК в 2,6 (Р<0,01) и 6 раз (Р<0,05), 2 группы на тест-аллерген ЭПОК в 2,1 (р<0,05) и 8,3 раза (Р<0,01) превышали таковые в контрольной группе (табл. 1). У опытных животных 3 и 4 групп на внут-рикожные пробы с ЭПЯК и ЭПГК также определялись высокие уровни кожных реакций, существенно превышающие контрольные (Р<0,05-0,01).
Одновременно у большинства животных опытных групп определялись повышенные уровни специфического лейкоцитолиза (РСЛЛ), более четко выраженные на ЭПОК и ЭПГК по сравнению с контролем (Р<0,05), чем на ЭППК и ЭПЯК (Р<0,1), тогда как комплементарная активность сыворотки крови опытных животных незначительно превышала таковую у контрольных животных. Следовательно, у опытных животных на воздействие экстрактов из КП развивался гиперим-мунный ответ и с активацией механизмов антителообусловленной цитотоксичности (II тип аллергических реакций).
Преципитирующие гуморальные антитела выявлялись в РСМП в крови половины опытных животных всех 4 групп со среднегрупповыми уровнями титров антител, имеющими статистическую значимость превышения контрольного уровня, за исключением животных 3 опытной группы, у которых средний уровень логарифма титра антител имел только возрастающую тенденцию по отношению к контролю (Р<0,1). Это свидетельствует
о развитии в организме опытных животных на воздействие антигенов КП процессов аллергической реакции Ш-го иммунокомплекс-ного типа. Однако уровни циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови животных опытных групп были даже несколько ниже, чем в контроле.
Выраженная аллергизация опытных животных по смешанному типу аллергических реакций подтверждалась и реакцией специфического НСТ-теста. Стимуляция гранул о-цитов крови опытных животных соответствующими экстрактами из КП сопровождалось значительным повышением в них продукции кислородных радикалов (Р<0,01). Еще более высокую значимость отличий с контролем имели индексы стимуляции кислородного метаболизма в гранулоцитарных клетках крови опытных животных (Р<0,001).
Значительная аллергизация организма животных опытных групп сопровождалась существенным угнетением биоцидной функции фагоцитарно-гранулоцитарного звена иммунитета как по снижению спонтанного уровня кислородного метаболизма (особенно во 2 оп. гр. на ЭПОК - на 64,1%, Р<0,001 по сравнению с контролем), так и по зимозансти-мулированному уровню продукции активных форм кислорода в гранулоцитах и индексу стимуляции, что приводило к снижению в 2,19 раз в 1 оп. гр. (Р<0,01) величины фагоцитарного резерва гранулоцитов крови. Однако индексы стимуляции и величины фагоцитарного резерва гранулоцитов крови у опытных животных 2, 3 и 4 оп. гр. не имели достоверных различий с контролем.
Изменения показателей гуморальной неспецифической защиты крови у опытных животных характеризовались достоверным повышением активности лизоцима и мало изменяемыми величинами бактерицидной активности сыворотки крови по сравнению с контролем (табл. 1, 2).
Со стороны лейкоформулы у животных
1 оп. гр. определялась статистическая тенденция к снижению удельного веса и значимое снижение абсолютного количества в крови моноцитов, возможно в результате их задействования в воспалительном процессе, тогда как у животных 2 оп. гр. существенных сдвигов в морфологических субпопуляциях лейкоцитов не выявлено. Существенных отличий в относительном и абсолютном содержании в крови популяции Т-лимфоцитов и субпопуляций антигенстимулированных Т-лимфоци-тов, а также коэффициентов стимуляции ан-
тигенами ЭППК и ЭПОК Т-лимфоцитов у животных обеих опытных групп по сравнению с контрольной не установлено.
Со стороны клеточных элементов «белой» крови у животных 3 оп. гр. выявлено достоверное снижение стимулированных антигеном ЭПЯК Т-лимфоцитов с одновременным значимым снижением коэффициента специфической стимуляции, что свидетельствует о выраженном клеточном гипериммунном ответе организма - сенсибилизации лимфоцитов. У животных 4 оп. гр. установлено достоверное по сравнению с контролем возрастание в крови абсолютного количества зрелых сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов, тенденция к снижению коэффициента специфической стимуляции Т-лимфоцитов как отражение аллергического воспалительного процесса.
С учетом критериев классификационной оценки аллергенной способности веществ [7], экстракты из КП разных видов вызывали сенсибилизацию по ГЗТ у 75 и более процентов опытных животных (6-7 из 8) по положительным кожным специфическим реакциям, а уровни среднегрупповых относительных величин ВТОУ у животных опытных групп превышали таковые в контрольных при достоверной значимости различий не только по критерию Стьюдента (Р<0,05-0,01), но и по «жесткому» математическому критерию Ван дер Вардена «Х» при Р<0,05, что позволяет дифференцировать КП по их белковой составляющей к веществам с выраженной сенсибилизирующей активностью (2 класс аллергенной активности).
Обращают на себя внимание высокая частота и выраженность кожных реакций на перекрестное внутрикожное тестирование животных 1 опытной группы тест-аллергеном ЭПОК и животных 2 опытной группы тест-аллергеном ЭППК. Это свидетельствует о наличии в пыли перловой и овсяной крупы единых или близких по структуре антигенных детерминант. Причем, у пыли перловой крупы их больше, чем в овсяной, так как частота (4-5 из 8) и выраженность положительных реакций немедленного кожного анафилактического и замедленного типов гиперчувстви-
тельности у опытных животных 2 группы на перекрестное тестирование ЭППК выше, чем аналогичное в 1 опытной группе на провокационную пробу с ЭПОК, и результаты перекрестного тестирования не имели существенных отличий.
Аналогично установлена довольно высокая частота и выраженность кожных реакций на перекрестное внутрикожное тестирование в ухо животных 3 опытной группы тест-аллергеном ЭПГК (у 4 из 8) и животных 4 опытной группы тест-аллергеном ЭПЯК (у 3 из 8), что свидетельствует о наличии в этих образцах пыли единых или близких по структуре антигенных детерминант. Причем схожие антигены более представлены в пыли гречневой крупы, чем в пыли ячневой крупы.
Результаты РСНСТ также подтверждают наличие в крупяной пыли разных видов единых антигенов.
Заключение
1. Впервые установлено, что внутрикож-ное введение экстрактов из перловой, овсяной, ячневой и гречневой круп в стандартной дозе по белку вызывает индукцию в организме опытных животных гиперергического иммунного ответа, в патогенезе которого задействованы однотипные смешанные механизмы анафилактического, клеточноопосредованного, антителообусловленного цитотоксическо-го и иммунокомплексного типов аллергических реакций.
2. В унифицированных условиях экспериментального воспроизведения и выявления гиперчувствительности замедленного типа растворимые антигены пыли перловой, овсяной, ячневой и гречневой круп вызывали сенсибилизацию более половины опытных животных с достоверными различиями средних величин кожных реакций на внутрикожное провокационное тестирование в опыте и контроле по критерию «Х» при Р<0,05, что определяет их отнесение к веществам с выраженной сенсибилизирующей активностью (2 класс аллергенной активности).
3. Сенсибилизация организма животных антигенами крупяной пыли сопровожда-
лось угнетением спонтанного и зимозансти-мулированного уровня генерации гранулоци-тарно-макрофагальными клетками крови активных форм кислорода, проявлениями гемо-токсического действия на клеточные элементы периферической крови.
4. Доказано наличие в образцах разных видов крупяной пыли единых антигенных иммунодетерминант, что определяет высокий риск формирования у работников полисенсибилизации.
Литература
1. Г игиеническая оценка условий труда работников производства овсяной крупяной продукции / С.А. Ушков [и др.] // Здоровье и окружающая среда : сб. науч. тр. / Респ. науч.-практ. центр гигиены ; гл. ред. Л.В. Половинкин. - Минск, ГУ РНМБ, 2011. - Вып. 18. - С. 51-56.
2. Факторы производственной среды и трудовой деятельности работников производства перловой и ячневой круп / С. А. Ушков [и др.] // Здоровье и окружающая среда : сб. науч. тр. / Респ. науч.-практ. центр гигиены ; гл. ред. Л.В. Половинкин. - Минск, ГУ РНМБ, 2011. - Вып. 18. - С. 57-63.
3. Пофакторная и обобщенная классификационная ги-
гиеническая оценка условий и характера труда работников производства гречневой крупяной продукции / В.В. Шевляков [и др.] // Здоровье и окружающая среда: сб. науч. тр. / Респ. науч.-практ. центр гигиены ; гл. ред. Л.В. Половинкин. - Минск, ГУ РНМБ, 2011. - Вып. 18. - С. 69-75.
4. Шевляков, В.В. Г игиена труда работников комбикормового и кормоприготовительного производств / В.В. Шевляков, Е.В. Чернышова, В.П. Филонов. -Минск: РИВШ, 2009. - 112 с.
5. Шевляков, В.В. Особенности биологического действия и гигиенической регламентации в воздухе рабочей зоны мучной пыли / В.В. Шевляков, С.А. Ушков, В.П. Филонов. -Минск: РИВШ, 2010. - 162 с.
6. Требования к постановке токсиколого-аллерголо-гических исследований при гигиеническом нормировании белоксодержащих аэрозолей в воздухе рабочей зоны : метод. указания № 11-11-10-2002 // Сборник офиц. документов по медицине труда и производств. санитарии. - Минск, 2004. - Ч. XIV. - С. 4-49.
7. Классификация и перечень аллергоопасных для человека промышленных веществ, основные меры профилактики : рук. Р 11-11-11 РБ 02 // Сборник официальных документов по медицине труда и производственной санитарии. - Минск : Бизнесофсет, 2003. - Ч. XI. - С. 94-126.
Поступила 11.05.2012 г. Принята в печать 04.06.2012 г.
