CC BY
0
УДК 578.821
Влияние делеции гена ati на патогенные и иммуногенные свойства вируса осповакцины
С. Н. Якубицкий, А. А. Сергеев, К. А. Титова, И. С. Шульгина, Е. В. Старостина, М. Б. Боргоякова, Л. И. Карпенко, С. Н. Щелкунов*
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора,
Новосибирская обл., Кольцово, 630559 Россия
*E-mail: snshchel@rambler.ru
Поступила в редакцию 14.04.2023
Принята к печати 13.07.2023
DOI: 10.32607/actanaturae.17872
РЕФЕРАТ Среди невирионных белков вируса осповакцины (VACV) наиболее представлен поздний белок 94 кДа - укороченная форма белка внутриклеточных телец включения типа А (A-type inclusion, ATI) вируса оспы коров, который имеет размер 150 кДа и кодируется геном ati. Этот белок VACV не формирует внутриклеточные ATI, будучи при этом мажорным иммуногеном при инфекции/иммунизации VACV человека или животных, а антитела к этому белку не являются вируснейтрализующими. В представленной работе изучено влияние продукции неструктурного мажорного иммуногенного белка VACV на проявления патогенности и иммуногенности вируса при модельной инфекции мышей линии BALB/c. Для направленного введения делеции в геном VACV LIVP создана рекомбинантная плазмида интеграции/делеции pAati и с ее помощью рекомбинантный вирус LIVPAati. Патогенность штаммов VACV LIVP и LIVPAati изучали на 3-недельных мышах. Интраназальное заражение мышей вирусами в дозе 107 БОЕ приводило к гибели 50% животных, инфицированных исходным штаммом LIVP, тогда как после заражения штаммом LIVPAati погибло лишь 20% мышей. Внутрикожная иммунизация 6-7-недельных мышей вирусом LIVPAati приводила к достоверному увеличению продукции VACV-специфичных IgG по сравнению с внутрикожной вакцинацией VACV LIVP. При этом не выявлено различий в клеточном иммунном ответе на вакцинацию мышей VACV LIVP или LIVPAati, оцениваемом методом ELISpot по числу спленоцитов, продуцирующих IFN-y в ответ на стимуляцию вирус-специфическими пептидами. Интраназальное заражение мышей летальными дозами вируса оспы коров или вируса эктромелии на 60-й день после иммунизации изучаемыми вариантами VACV показало, что мутантный LIVPAati обусловливает более выраженный протективный эффект по сравнению с родительским LIVP.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ортопоксвирусы, вирус осповакцины, ген ati, внутрикожная инъекция, иммуноген-ность, протективность.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CPXV - вирус оспы коров; ECTV - вирус эктромелии; VACV - вирус осповак-цины; БОЕ - бляшкообразующая единица; в/к - внутрикожно; дпи - день после иммунизации; и/н -интраназально.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус осповакцины (Vaccinia virus, VACV) входит в состав рода Orthopoxvirus (семейство Poxviridae), который объединяет также такие виды, как вирус натуральной оспы (Variola virus, VARV), вирус оспы обезьян (Monkeypox virus, MPXV), вирус оспы коров (Cowpox virus, CPXV), вирус оспы верблюдов (Camelpox virus, CMLV) и некоторые другие [1, 2]. Ортопоксвирусы являются крупнейшими ДНК-содержащими вирусами млекопитающих, весь цикл развития которых проходит в цитоплазме инфи-
цированных клеток. Представители этого рода по структуре вирионов морфологически неразличимы и антигенно близки друг другу, поэтому заражение одним видом ортопоксвирусов обеспечивает иммунную защиту от других представителей данного рода [3]. Именно поэтому использование живой вакцины на основе разных штаммов VACV позволило искоренить оспу [1, 4].
VACV, как и другие виды ортопоксвирусов, существует в двух инфекционных формах. Подавляющее большинство вирусного потомства составляют вну-
триклеточные зрелые вирионы (IMV), гораздо меньшую часть - внеклеточные, покрытые дополнительной оболочкой вирионы (EEV) [5, 6].
Еще в ранних работах по изучению иммунного ответа на внутрикожную (в/к) инфекцию кроликов вирусом VACV был обнаружен так называемый LS-антиген (единый белок, состоящий из термолабильного (L) и термостабильного (S) антигенных компонентов), против которого активно продуцировались антитела [7]. Высокоиммуногенный LS-антиген, который не относится к вирионным белкам и синтезируется в большом количестве, выделяют из экстрактов инфицированных тканей животных. Антитела, полученные после иммунизации животных LS-антигеном, не обладают вирусней-трализующей активностью, но реагируют в тестах связывания комплемента и иммунопреципитации в геле с клиническими образцами от больных оспой и оспой обезьян [2].
В дальнейшем показали, что LS-антиген VACV размером 94 кДа - это укороченная форма белка, формирующего у CPXV внутриклеточные тельца типа А (A-type inclusion bodies, ATI). Белок ATI CPXV имеет размер 150 кДа [8], накапливается в инфицированных клетках в большом количестве на позднем этапе цикла репликации вируса (до 4% суммарного клеточного белка) и агрегирует с образованием в цитоплазме клеток гелеподобных тел, в которые могут включаться зрелые вирионы [9, 10]. Укороченные на С-конце формы этого белка размером от 92 до 96 кДа в большом количестве синтезируются в VARV, MPXV, CMLV и VACV, не образуя ATI (рис. 1).
Показано, что при иммунизации лабораторных животных или добровольцев VACV формируются антитела на широкий спектр вирионных белков, а также на высокоиммуногенный невирионный ATI-подобный белок [11]. Т-клеточный иммунный ответ на инфекцию VACV индуцируется в основном против ранних невирионных белков [6]. Исключение составляет укороченная форма белка ATI, синтезируемая на позднем этапе цикла репликации вируса, на которую, тем не менее, формируется выраженный Т-клеточный иммунный ответ [12]. По-видимому, это обусловлено тем, что укороченный ген ati (A29L в случае VACV-LIVP, см. рис. 1) является одним из наиболее интенсивно экспресси-руемых генов VACV, а кодируемый им белок продуцируется в наибольшем количестве среди неви-рионных белков [9].
Ген ati не входит в число генов, жизненно важных для VACV, так как обнаружены природные варианты этого вируса, у которых данный ген деле-тирован [13, 14]. На примере CPXV показано также,
ati p4c
A26L A27L
A26L A27L
150900 I 1156400 п.н. CPXV-GRI
□ 130748 п.н. VARV-IND
□ 139542 п.н. MPXV-ZAI
] 139992 п.н. VACV-WR
:
□ 142008 n.H.VACV-LIVP
Рис. 1. Сравнение ортопоксвирусных потенциальных открытых рамок считывания (ОРТ), входящих в состав генов ati (ОРТ A26L) и p4c (A27L) CPXV-GRI. Серыми стрелками обозначены размер и направление соответствующих ОРТ, названия которых приведены над этими стрелками для вирусов CPXV-GRI, VARV-IND, MPXV-ZAI, VACV-WR [2] и VACV-LIVP. Цифрами справа и слева от белых блоков указаны позиции соответствующей области генома вируса. Тонкими линиями обозначены делеции в геномах вирусов относительно последовательности ДНК CPXV-GRI. Укороченная форма белка ATI кодируется ОРТ A29L VACV-LIVP и соответствующими ОРТ других вирусов
что делеция гена ati не влияет на способность вируса размножаться как in vitro, так и in vivo [15, 16]. Однако до сих пор не изучено влияние делеции гена ati на иммуногенные свойства VACV
В данной работе изучено влияние делеции гена ati, кодирующего мажорный иммуногенный белок VACV, антитела к которому не обладают вирусней-трализующей активностью, на патогенные и имму-ногенные свойства вируса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактерии, вирусы и культура клеток
В работе использовали штамм Escherichia coli XL2-Blue, клон 14 штамма LIVP VACV, полученный нами ранее методом предельного разведения через бляшку из-под агарозного покрытия [17], а также вирус оспы коров (CPXV) штамм GRI-90 и вирус эктро-мелии (ECTV) штамм К-1, полученные из коллекции вирусов. Перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 получена из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Вирусы выращивали и титровали на монослойной культуре клеток CV-1 согласно [18].
A25L A26LA27L _ A28L A29L
A27L A28L A29L
125416
A26L A27L A28L
A26L A27L A28L
134649 I I I
134637 I —
A29L
A28L A30L
A28L
136655 С
Животные
В исследованиях использовали инбредных мышей линии BALB/c, полученных из питомника Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (Новосибирск). Подопытных животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях (ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами»). Исследования и манипуляции на животных проведены с одобрения комитета по биоэтике ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Протокол № 02-06.2022 от 28.06.2022 г.).
Оценка патогенности штаммов VACV
В исследованиях по изучению патогенности VACV LIVP и LIVPAati при интраназальном (и/н) заражении использовали 3-недельных мышей линии BALB/c (по 10 животных в группе). Мышам после ингаляционного наркоза диэтиловым эфиром вводили в полость носа вируссодержащую жидкость (50 мкл, 107 бляшкообразующих единиц (БОЕ)) либо физиологический раствор. За животными наблюдали в течение 22 дней и регистрировали клинические проявления инфекции и гибель.
Использовали балльную оценку выявляемых симптомов заболевания: 0 - нет признаков заболевания, 1 - легкая взъерошенность шерсти, 2 - сильная взъерошенность шерсти, 3 - сильная взъерошен-ность шерсти, а также сутулая поза или конъюнктивит, 4 - затрудненное дыхание или отсутствие движения, 5 - гибель.
Мышей взвешивали по отдельности каждые 2 дня. Средние арифметические значения массы тела мышей в каждой группе на временную точку рассчитывали и выражали в процентах от начального веса.
Иммунизация мышей и взятие образцов на анализы
Мышей линии BALB/c в возрасте 6-7 недель иммунизировали штаммами LIVP и LIVPAati VACV: внутрикожная (в/к) инъекция в дорсальную сторону хвоста (около 1 см от основания) как описано ранее [19], используя дозу вируса 105 Б0Е/20 мкл/мышь. В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым вводили физиологический раствор.
На 7, 14, 21, 28, 42 и 56 день после иммунизации (дпи) анализировали гуморальный иммунный ответ у мышей. В каждой временной точке, указанной
выше, в анализ брали по 6 мышей в группе. Кровь у мышей прижизненно забирали из ретроорбиталь-ного венозного синуса с помощью иглы 23G. Забор крови из ретроорбитального синуса не приводит к повреждению органа зрения. Взятие пробы крови является кратковременной, но болезненной процедурой, однако обезболивание не проводили, поскольку показано, что применение известных методов обезболивания или наркоза может влиять на иммунологические показатели крови животных.
Из индивидуальных образцов крови животных получали сыворотку путем осаждения форменных элементов с помощью центрифугирования с относительной центробежной силой 1000 g в течение 10 мин. Сыворотки выдерживали при температуре 56°C в течение 30 мин и хранили при температуре минус 20°С.
На 7, 14 и 21 дпи после взятия крови мышей умертвляли методом цервикальной дислокации, селезенки стерильно извлекали у каждой из 6 мышей изучаемых групп.
Выделение спленоцитов
Спленоциты выделяли путем продавлива-ния каждой селезенки через клеточный фильтр (BD Falcon™, США) с использованием поршня шприца. После удаления эритроцитов с помощью буфера ACK для лизиса эритроцитов (Thermo Fisher Scientific, США), спленоциты промывали и ресуспендировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина (50 мкг/мл).
Определение количества продуцирующих IFN-y клеток с использованием метода ELISpot
Интенсивность Т-клеточного иммунного ответа у иммунизированных мышей определяли по числу спленоцитов, продуцирующих IFN-y, с помощью метода IFN-y ELISpot. Анализ проводили с использованием наборов фирмы MABTECH (Швеция) согласно инструкции производителя. Для стимуляции клеток использовали смесь VACV-специфичных иммунодоминантных для мышей BALB/c пептидов SPYAAGYDL, SPGAAGYDL, VGPSNSPTF, KYGRLFNEI, GFIRSLQTI, KYMWCYSQV (по 20 мкг/мл каждого пептида) [20, 21]. Количество IFN-Y-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-ридера фирмы Carl Zeiss (Германия).
Иммуноферментный анализ сывороток крови мышей
Иммуноферментный анализ (ИФА) сывороток крови мышей выполняли согласно [18]. В качестве антигена использовали очищенный центрифугировани-
ем через сахарозную подушку препарат вирионов штамма LIVP VACV. Все исследуемые образцы сыворотки крови мышей титровали серией двукратных последовательных разбавлений с разведения 1:100 до разведения 1:12800. Повтор титрования проведен в постановке ИФА на следующий день. Для определения титров IgM и IgG использовали растворы с пероксидазными конъюгатами анти-IgM мыши и анти-IgG мыши (Sigma, США) соответственно. Титры IgM и IgG определяли в каждом образце сыворотки крови (отдельно в каждом повторе, а затем усредняли). Вычисляли средние геометрические значения логарифмов обратного титра VACV-специфических IgG или IgM по экспериментальным группам, рассчитывали доверительные интервалы для уровня 95% вероятности совпадения каждой выборки с генеральной совокупностью.
Оценка уровня протективности у иммунизированных мышей
На 60-й дпи группы иммунизированных VACV LIVP или LIVPAati и контрольных животных и/н заражали CPXV GRI-90 в дозе 2.0Х106 Б0Е/50 мкл/мышь (6 животных в каждой группе) или ECTV K-1 в дозе 2.2*103 Б0Е/50 мкл/мышь (6 животных в каждой группе). За животными наблюдали в течение 14 дней и регистрировали у них клинические проявления инфекции и гибель. Каждую мышь взвешивали каждые 2 дня. Средние арифметические значения массы тела мышей каждой группы на временную точку рассчитывали и выражали в процентах от начального веса.
Получали данные для групп животных, в/к иммунизированных VACV LIVP или LIVPAati, а также групп не иммунизированных мышей и не инфицированных (отрицательный контроль) или зараженных CPXV GRI-90 или ECTV K-1 (положительный контроль).
Статистический анализ данных
Статистическую обработку и сравнение результатов проводили стандартными методами, используя пакет компьютерных программ Statistica 13.0 (StatSoft Inc. 1984-2001). Значение Р менее 0.05 считали статистически значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Создание вируса LIVPAati
Направленное введение делеции в геном VACV LIVP (GenBank: KX781953.1) проводили в соответствии со схемой, приведенной на рис. 2. На первом этапе конструирования рекомбинантной плазмиды интеграции/делеции pAati c использованием ком-
ДНК VACV (14 клон LIVP)
ч rtA27L A28L A29L f"A30L
CPXV (GRI-90)
R'
gpt-селекция
P
(I Aati gpt /.5 Ap'_
qteetiOnz
L R L'
A28L A29L
R'
^/X^ внутримолекулярная рекомбинация
_Aati - j • _ A28L A29L
l ' ' R Ф °lF> L '' " ''
LIVPAati
LIVP
Рис. 2. Схема конструирования плазмиды pAati и VACV LIVPAati (см. объяснения в тексте). L и R - левая и правая фланкирующие ген ati области вирусного генома
пьютерной программы Oligo (версия 3.3) (Borland International, США) рассчитали и синтезировали олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР и амплификации последовательностей ДНК VACV LIVP, фланкирующих слева и справа делетируемый участок вирусного генома (ОРТ A28L-A29L, положение на геноме 137618-140470 п.н.) (рис. 1, 2).
Левый фланкирующий фрагмент (L) получали с использованием пары праймеров 5'-AAGCTTGTT-TGGTAGTAGATACATATCAATATCATC-3' (Hindlll) и 5'-CTGCAGGCTGACTCAATTGCATGAAGAT-3' (PstI), правый фланкирующий фрагмент (R) - праймеров 5'-CTGCAGGGGTAATTATAAGATCGTA-GATCTCC-3' (PstI) и 5'-CCCGGGATGGCGAACAT-TATAAATTTATGG-3' (XmaI), а также полимеразу с редактирующими свойствами Platinum Taq DNA High Fidelity Polymerase (Invitrogen, США), а в качестве ДНК-матрицы использовали ДНК клона 14
штамма LIVP VACV. Полученные целевые фрагменты L и R очищали, используя QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Нидерланды), встраивали в векторный HindIII-XmaI-фрагмент pMGC20-gpt (рис. 2) и клонировали, используя трансформацию компетентных клеток E. coli штамм XL2-Blue и ампициллин в качестве селективного маркера. Правильность структуры рекомбинантной плазмиды pAati подтверждали секвенированием.
На следующем этапе работы монослой клеток CV-1 инфицировали VACV LIVP и трансфицирова-ли рекомбинантной плазмидой pAati в условиях gpt-селекции рекомбинантов VACV как описано ранее [17]. В результате единичного кроссинговера плазмиды интеграции и вирусной ДНК образовывался рекомбинантный вирусный геном, содержащий как селективный ген gpt, так и последовательности, представляющие собой сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции (рис. 2). Такая генетическая конструкция с длинными прямыми повторами (R, R' и L, L') нестабильна и может существовать лишь под селективным давлением. После снятия селективного давления по гену gpt и внутримолекулярной рекомбинации по районам R-R' образовался рекомбинантный вирус LIVPAati (рис. 2). Клоны данного варианта вируса выявляли ПЦР-анализом с последующим секвени-рованием вирусной ДНК.
Оценка патогенности вирусов LIVP и LIVPAati при интраназальном заражении мышей
При изучении патогенности штаммов VACV LIVP и LIVPAati использовали 3-недельных мышей линии BALB/c. Осуществляли и/н заражение мышей (10 животных в группе) вирусами в дозе 107 БОЕ. За животными наблюдали в течение 22 дней, каждые 2 дня каждую мышь взвешивали и регистрировали клинические проявления инфекции и гибель. У мышей, зараженных VACV LIVP, выраженные клинические проявления инфекции выявляли, начиная с 4-го дня с максимумом на 6-й день, выздоровление наступало после 10-го дня (рис. 3Б). Заболевание сопровождалось существенным снижением массы тела (рис. 3А). Вирус LIVPAati в тех же условиях вызывал менее выраженные клинические проявления инфекции (рис. 3Б) и меньшее снижение массы тела по сравнению с группой мышей, инфицированных LIVP (рис. 3А), хотя и без статистически значимых различий. Заражение мышей штаммом LIVP приводило к гибели 50% животных, тогда как после заражения штаммом LIVPAati погибло лишь 20% мышей (рис. 4).
Полученные результаты указывают на снижение патогенности VACV LIVP с делецией гена ati (рис. 2).
CT-
140
130
g 120 ф
3 110 и и т Z ф х
X
ф
X
ф
м X
100
90
80
70
60
А
* 1 * 2 » 3
0 2 4
6 8 10 12 14 16 18 20 22 Дни после заражения
л л а
ю
и н а
m
е л о
Ю
а
з
JD
н е п е
н
и
А 1 2 3
¿Л
4-Х-г-Х ■ & ■ ¿-^är-^X-r-X-^-X-i-X-^X-^X-r-X-i
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Дни после заражения
Рис. 3. Динамика изменения массы тела мышей (А) и клинических проявлений инфекции (Б) после и/н заражения вирусами LIVP (2) или LIVPДati (3) в дозе 107 БОЕ. Приведены данные для групп из 10 животных, зараженных соответствующими вирусами, а также контрольной группы (1)
Анализ развития клеточного иммунного ответа на вакцинацию мышей вариантами VACV
Интенсивность клеточного иммунного ответа у мышей, в/к иммунизированных LIVP или LIVPДati, определяли на 7, 14 и 21 дпи по числу спленоцитов, продуцирующих №N-7 в ответ на стимуляцию вирус-специфическими пептидами, с помощью метода №N-7 ELISpot. В каждой временной точке анализировали по 6 животных в группе. Результаты, представленные на рис. 5, показывают, что высокий уровень клеточного иммунного ответа наблюдался уже на 7 дпи, пик которого приходился на 14 дпи со значительным снижением к 21 дпи. Динамика и уровень клеточного иммунного ответа совпадали у обоих штаммов VACV
4
Б
3
2
0
100
90
80
е, ы 70
н
т о 60
в
и ж 50
е и 40
ш
в и 30
ж
ы 20
ой
10
0
X—К—X—А—А—А—А—А—А—А—А—А
«—X—X—X—X—X—X—X—X
\
Ш—+—■—+—■—1—т—■
А 1 • 2 * 3
и
0
1
<и
с □
и
с
X
о
и <и т X С
о
12000 уур
ЫУРДаИ
8000 М
:. и [ а
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Дни после заражения
Рис. 4. Динамика гибели мышей, и/н зараженных вирусами ЫУР (2) или ЫУРДаА (3) в дозе 107 БОЕ. Контрольная группа - неинфицированные животные (1)
Сравнение динамики развития гуморального иммунного ответа на вакцинацию мышей вирусами LIVP и LIVPДati
Уровень VACV-специфичных ^М и IgG в сыворотках крови мышей, в/к иммунизированных LIVP или LГVPДati, определяли методом ИФА на 7, 14, 21, 28, 42 и 56 дпи.
На 7 дпи выявлен относительно высокий уровень ^М, который достигал максимума на 14 дпи, а затем снижался. По динамике и уровню продукции вирион-специфичных ^М оба штамма VACV не различались (рис. 6А).
Активный синтез VACV-специфичных IgG наблюдали на 14 дпи с последующим увеличением уровня антител на 21-28 дпи, который оставался высоким все время наблюдения (до 56 дпи, рис. 6Б) у мышей, иммунизированных LIVPДati, но снижался у мышей, вакцинированных LГVP. По среднегеометрическим значениям обратных титров IgG на 28, 42 и 56 дпи LIVPДati заметно превосходил LIVP, и эти различия были статистически значимыми на 42 и 56 дпи (рис. 6Б).
Оценка защитного эффекта вакцинации мышей вариантами VACV от повторной инфекции летальными дозами гетерологичных ортопоксвирусов
На 60-й дпи мышей, в/к иммунизированных VACV LIVP или LIVPДati, а также контрольных (неим-мунизированных) и/н заражали либо CPXV (в дозе 2.0Х106 БОЕ/мышь), либо ЕСТУ (в дозе 2.2Х103 БОЕ/мышь) (по 6 животных в группе). В течение 14 дней наблюдали за клиническими проявлениями
М 7 14 21
Дни после иммунизации
Рис. 5. ЕЬ^ро^анализ УАСУ-специфичного клеточного ответа на иммунизацию мышей линии ВАЬВ/с. ИПК - интерферон-у-продуцирующие клетки, М - неиммунизированные мыши
Л 4.5
2 1.5
14 21 28 42 Дни после иммунизации
Б 4.5
4
о
от о 3.5
_|
О 3
от
о. ь 2.5
и
1—
2
1.5
р= 0.008 р= 0.014
I-1 (-1
^ 1111 И 1111
К 7 14 21 28 42 56 Дни после иммунизации
Рис. 6. Титры УАСУ-специфичных 1дМ (А) и IдG (Б) в сыворотках мышей, иммунизированных вирусами Ь1УР (синие столбики) или ЫУРДаИ (красные столбики). К -сыворотки крови мышей, которым вводили физраствор
и гибелью мышей. Использовали критерий развития VACV инфекции по величине снижения массы тела.
При заражении CPXV все мыши контрольной группы погибли через 6 дней, а животные, иммунизированные обоими вариантами УАС^ выжили.
А 110
00
90
80
70
60
1 2
3
4
4 6 8 10 Дни после заражения
<и с о ю
н е п е
ь
и
1 2
3
4
<5^
100 90 80 70 60
£ 50
е
| 40
сс
I 30
m 20 10 0
1 2
3
4
4 6 8 10 Дни после заражения
Рис. 7. Динамика изменения массы тела (А) и клинических проявлений инфекции (Б) после и/н заражения CPXV-GRI мышей, вакцинированных LIVP (2) или LIVPAati (3), на 60-й день после иммунизации. Приведены данные для групп из 6 животных. В качестве контрольных использованы группы невакцинированных мышей как не инфицированных CPXV-GRI (1), так и зараженных этим вирусом (4). Звездочкой обозначены временные точки, в которых среднее значение массы тела в процентах от первоначального веса в группе иммунизированных LIVPAati мышей достоверно отличается от значений в группе мышей, иммунизированных LIVP. Сравнение проводили с помощью /-критерия Стьюдента для независимых выборок
При этом обнаружили менее выраженное снижение массы тела и менее существенные клинические проявления у мышей, вакцинированных LIVPAati, по сравнению с мышами, вакцинированными LIVP (рис. 7). На 10-14 дни после заражения CPXV различия в снижении массы тела между группами вакцинированных мышей были статистически значимыми (рис. 7А).
0 2 4 6 8 10 12 14 Дни после заражения
Рис. 8. Динамика гибели мышей, вакцинированных LIVP (2) или LIVPAati (3), после и/н заражения ECTV-K1 на 60-й день после вакцинации. Приведены данные для групп из 6 животных. В качестве контрольных использованы группы невакцинированных мышей как не инфицированных ECTV-K1 (1), так и зараженных этим вирусом (4)
При заражении иммунизированных мышей вирусом ECTV различия между группами животных были более выраженными. Все контрольные мыши погибли через 12 дней после заражения ECTV; в группе, вакцинированной LIVP, выжило 83% животных, а в группе LIVPAati - все животные (рис. 8). При этом в группе LIVPAati проявления инфекции были очень слабо выраженными и практически не сопровождались снижением массы тела (рис. 9). В то же время у мышей, вакцинированных LIVP, клинические признаки инфекционного процесса наблюдали на 6-12 дни после заражения ECTV. Выявлено значительное снижение массы тела животных и достоверные отличия по этому показателю от группы мышей, вакцинированных LIVPAati, на 8-14 дни после заражении ECTV (рис. 9А).
ОБСУЖДЕНИЕ
Наиболее активно из невирионных белков VACV синтезируется укороченная форма белка ATI -белок 94 кДа, который не формирует внутриклеточные ATI, но является мажорным иммуноге-ном при инфекции/иммунизации VACV человека или животных [11]. При этом антитела против этого белка не обладают вируснейтрализующей активностью. Влияние продукции данного неструктурного мажорного иммуногенного белка на проявление патогенности и иммуногенности VACV до сих пор не исследовано. Поэтому цель данной работы со-
0
2
Б
5
4
3
2
0
А 110
100
90
80
70
60
л, 1 2
♦ 3 О 4
4 6 8 10 Дни после заражения
12
е л о
ю
н е п е
ь
U
4 6 8 10 Дни после заражения
Рис. 9. Динамика изменения массы тела (А) и клинических проявлений инфекции (Б) после и/н заражения ECTV-K1 мышей, вакцинированных LIVP (2) или LIVPAati (3), на 60-й день после иммунизации. Приведены данные для групп из 6 животных. В качестве контрольных использованы группы невакцинированных мышей, не инфицированных ECTV-K1 (1) и зараженных этим вирусом (4). Звездочкой обозначены временные точки, в которых среднее значение массы тела в процентах от первоначального веса в группе иммунизированных LIVPAati мышей достоверно отличается от значения в группе мышей, иммунизированных LIVP. Сравнение проводили с помощью /-критерия Стьюден-та для независимых выборок
стояла в получении VACV с направленно удаленным геном ati и изучении свойств этого вируса на мышах.
В качестве объекта исследования использовали ранее охарактеризованный клоновый вариант LIVP VACV [17]. У LIVP ген ati (A26L у CPXV-GRI) распадается на три короткие потенциальные открытые
рамки считывания, из которых ген A29L кодирует мажорный иммуногенный белок А29 (94 кДа) (рис. 1).
Плазмида интеграции/делеции рДа^, а затем штамм LIVPДati получены согласно схеме, представленной на рис. 2.
На первом этапе сравнили патогенность штаммов LIVP и LIVPДati. Чувствительность мышей к орто-поксвирусам существенно зависит от их возраста [2], поэтому использовали молодых (возраст 3 недели) мышей линии BALB/c. Животных (по 10 особей в группе) и/н инфицировали вирусами, поскольку этот способ имитирует естественный путь заражения и обусловливает наибольшую чувствительность мышей к данной инфекции [22, 23].
Оказалось, что при и/н заражении молодых мышей в дозе 107 БОЕ штамм LIVP индуцировал развитие клинически выраженной инфекции (рис. 3) с гибелью 50% животных (рис. 4), тогда как штамм LIVPДati вызывал менее выраженные признаки заболевания (рис. 3) и вызывал гибель 20% мышей (рис. 4). Таким образом, удаление гена аЫ у VACV LIVP привело к его аттенуации по сравнению с исходным вариантом вируса. Это согласуется с ранее сформулированным предположением, что сниженная патогенность некоторых природных штаммов VACV может быть обусловлена спонтанной делеци-ей у них гена ati [13], хотя это и не доказано экспериментально.
Иммуногенность VACV LIVP и LIVPДati изучали на взрослых мышах (возраст 6-7 недель) со сформированной иммунной системой. Развитие VACV-специфичного клеточного иммунного ответа на в/к вакцинацию мышей оценивали с помощью метода ELISpot по числу спленоцитов, продуцирующих №N-7 в ответ на стимуляцию пептидами. На 7 дпи уже наблюдался высокий уровень клеточного иммунного ответа, пик которого приходился на 14 дпи со значительным снижением к 21 дпи (рис. 5). При этом делеция гена аЫ у VACV LIVP не сказывалась на динамике развития и уровне клеточного иммунного ответа мышей на вакцинацию.
Известно, что наибольший вклад в развитие адаптивного иммунного ответа на VACV-вакцинацию вносит антительный ответ [3, 24], поэтому с помощью ИФА оценили динамику синтеза ^М и специфичных к вирионным белкам УАСУ после в/к вакцинации мышей штаммами LIVP или LIVPДati в дозах 105 БОЕ.
На 7 дпи выявлен относительно высокий уровень ^М, который достигал максимума на 14 дпи, а затем снижался. По динамике и уровню продукции вирионспецифичных ^М оба штамма VACV не различались (рис. 6А).
0
2
Б
5
4
3
2
0
Активный синтез УАСУ-специфичных IgG наблюдали, начиная с 14 дпи, с последующим увеличением уровня антител на 21-28 дпи. По среднегеометрическим значениям обратных титров IgG на 28, 42 и 56 дпи LIVPДati заметно превосходил LГVP, при этом на 42 и 56 дпи - с высокой статистической значимостью (рис. 6Б). Одной из вероятных причин этого может быть тот факт, что отсутствие синтеза мажорного позднего неструктурного белка А29 у LIVPДati «не отвлекает» иммунную систему на синтез IgG к этому белку и обусловливает больший синтез антител, специфичных к вирионным белкам VACV
В ряде работ показано, что наибольший вклад в защиту от повторной ортопоксвирусной инфекции вносит гуморальный иммунный ответ [3, 6, 24, 25], поэтому важно было оценить протективный иммунитет, развившийся в ответ на в/к вакцинацию мышей VACV LГVP и LIVPДati. С этой целью на 60-й дпи по 6 мышей каждой группы и/н инфицировали летальными дозами CPXV GRI-90 или ЕСТУ К-1. Оказалось, что в обоих случаях защитный эффект вакцинации LIVPДati был выше, чем вакцинации родительским штаммом LIVP (рис. 7-9), что подтверждает ранее сделанные заключения о ключевой
роли антительного ответа в формировании защиты организма от ортопоксвирусной инфекции.
Таким образом, можно заключить, что делеция участка генома VACV LIVP в районе гена аЫ привела к снижению патогенных свойств вируса LIVPДati при и/н инфицировании мышей линии ВАЬВ/с и увеличению продукции вирионспецифичных IgG в ответ на в/к вакцинацию мышей данным мутантным вирусом, что привело (по сравнению с родительским LIVP) к формированию более высокого уровня защиты мышей от последующей летальной инфекции гетерологичными ортопоксвирусами CPXV и ЕСТУ Поэтому штамм LГVPДati можно рассматривать в качестве перспективного вектора для создания поливалентных рекомбинантных вакцин против различных инфекционных заболеваний. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00006-П). Авторы выражают благодарность И.В. Колосовой
за препараты VACV LIVP, Д.Н. Кисакову и С.А. Пьянкову — за статистическую обработку результатов экспериментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and Its Eradication. World Health Organization. Geneva, Switzerland, 1988. 1460 p.
2. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. New York, USA: Springer, 2005. 425 p.
3. Moss B. // Immunol. Rev. 2011. V. 239. P. 8-26.
4. Shchelkunova G.A., Shchelkunov S.N. // Acta Naturae. 2017. V. 9. P. 4-12.
5. Payne L.G. // J. Gen. Virol. 1980. V. 50. P. 89-100.
6. Shchelkunov S.N., Shchelkunova G.A. // Acta Naturae. 2020. V. 12. P. 33-41.
7. Shedlovsky T., Smadel J.E. // J. Exp. Med. 1942. V. 75. № 2. P. 165-178.
8. Funahashi S., Sato T., Shida H. // J. Gen. Virol. 1988. V. 69 (Pt 1). P. 35-47.
9. de Carlos A., Paez E. // Virology. 1991. V. 185. № 2. P. 768-778.
10. Katsafanas G.C., Moss B. // J. Virol. 2020. V. 94. № 4. e01671-19.
11. Jones-Trower A., Garcia A., Meseda C.A., He Y., Weiss C., Kumar A., Weir J.P., Merchlinsky M. // Virology. 2005. V. 343. № 1. P. 128-140.
12. Moutaftsi M., Tscharke D.C., Vaughan K., Koelle D.M., Stern L., Calvo-Calle M., Ennis F., Terajima M., Sutter G., Crotty S., et al. // Future Microbiol. 2010. V. 5. № 2. P. 221-239.
13. Marques J.T., Trindade G.D., Da Fonseca F.G., Dos Santos J.R., Bonjardim C.A., Ferreira P.C., Kroon E.G. // Virus Genes. 2001. V. 23. № 3. P. 291-301.
14. Leite J.A., Drumond B.P., de Souza Trindade G., Bonjardim C.A., Ferreira P.C.P., Kroon E.G. // Virus Genes. 2007. V. 35. № 3. P. 531-539.
15. Leite J.A., da Fonseca F.G., de Souza Trindade G., Abrahao J.S., Arantes R.M., de Almeida-Leite C.M., dos Santos J.R., Guedes M.I., Ribeiro B.M., Bonjardim C.A., et al. // Arch. Virol. 2011. V. 156. № 4. P. 617-628.
16. Kastenmayer R.J., Maruri-Avidal L., Americo J.L., Earl P.L., Weisberg A.S., Moss B. // Virology. 2014. V. 452-453. P. 59-66.
17. Yakubitskiy S.N., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. // Acta Naturae. 2015. V. 7. P. 113-121.
18. Shchelkunov S.N., Yakubitskiy S.N., Bauer T.V., Sergeev A.A., Kabanov A.S., Bulichev L.E., Yurganova I.A., Odnoshevskiy D.A., Kolosova I.V., Pyankov S.A., et al. // Acta Naturae. 2020. V. 12. P. 120-132.
19. Shchelkunov S.N., Yakubitskiy S.N., Sergeev A.A., Starostina E.V., Titova K.A., Pyankov S.A., Shchelkunova G.A., Borgoyakova M.B., Zadorozhny A.M., Orlova L.A., et al. // Viruses. 2022. V. 14. P. 1453.
20. Oseroff C., Peters B., Pasquetto V., Moutaftsi M., Sidney J., Panchanathan V., Tscharke D.C., Maillere B., Grey H., Sette A. // J. Immunol. 2008. V. 180. P. 7193-7202.
21. Russell T.A., Tscharke D.C. // Immunol. Cell Biol. 2014. V. 92. P. 466-469.
22. Hughes L.J., Townsend M.B., Gallardo-Romero N., Hutson C.L., Patel N., Dotty J.B., Salzer J.S., Damon I.K., Carroll D.S., Satheshkumar P.S., et al. // Virology. 2020. V. 544. P. 55-63.
23. Shchelkunov S.N., Yakubitskiy S.N., Sergeev A.A., Kabanov A.S., Bauer T.V., Bulichev L.E., Pyankov S.A. // Viruses. 2020. V. 12. № 8. P. 795.
24. Belyakov I.M., Earl P., Dzutsev A., Kuznetsov V.A., Lemon M., Wyatt L.S., Snyder J.T., Ahlers J.D., Franchini G., Moss B., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 9458-9463.
25. Lambert P.H., Laurent P.E. // Vaccine. 2008. V. 26. P. 31973208.
