CC BY
191
УДК 578.821.5:615.371
Сравнение кандидатных вакцин нового поколения против ортопоксвирусных инфекций человека
Р. А. Максютов1*, С. Н. Якубицкий1, И. В. Колосова1, С. Н. Щелкунов1,2*
Тосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Новосибирская обл.
2Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10
*E-mail: maksrinat@yandex.ru; snshchel@rambler.ru Поступила в редакцию 05.07.2016 Принята к печати 23.01.2017
РЕФЕРАТ Отсутствие у населения противооспенного иммунитета, участившиеся случаи поражения человека ортопоксвирусами и увеличивающиеся риски применения вируса натуральной оспы (variola virus, VARV) в качестве агента биотерроризма требуют разработки современных безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций. Ранее нами были получены поливалентная ДНК-вакцина на основе пяти антигенов VARV и аттенуированный вариант вируса осповакцины (vaccinia virus, VACV) с направленной делецией шести генов (VACA6). В независимых опытах показано, что трехкратная иммунизация ДНК-вакциной и двукратная иммунизация VACA6 обеспечивали защиту мышей от летальной дозы (10 LD50) высокопатогенного для них вируса эктромелии (ectromelia virus, ECTV). Цель представленной работы состояла в сравнении противооспенного иммунитета, формируемого при различных схемах иммунизации ДНК-вакциной и VACA6. Установлено, что иммунизация мышей поливалентной ДНК-вакциной с последующим бустирова-нием рекомбинантным вариантом VACA6 наравне с двукратной иммунизацией VACA6 индуцирует наработку VACV-нейтрализующих антител и обеспечивает защиту мышей от дозы 150 LD50 ECTV. Предложенные схемы иммунизации могут быть использованы для разработки стратегии безопасной вакцинации против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус осповакцины, гены вирулентности, ДНК-вакцина, натуральная оспа, протектив-ность.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БОЕ - бляшкообразующая единица; VARV - variola virus (вирус натуральной оспы); VACV - vaccinia virus (вирус осповакцины); CPXV - cowpox virus (вирус коровьей оспы); MPXV - monkeypox virus (вирус оспы обезьян); ECTV - ectromelia virus (вирус эктромелии); LIVP - штамм Л-ИВП вируса осповакцины; ПЦР - полимеразная цепная реакция; LD50 - 50% летальная доза.
ВВЕДЕНИЕ
Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae включает такие патогенные для человека виды, как вирусы натуральной оспы (variola virus, VARV), оспы обезьян (monkeypox virus, MPXV), коровьей оспы (cowpox virus, CPXV) и осповакцины (vaccinia virus, VACV). Массовая вакцинация традиционной вакциной на основе VACV защищала не только от VARV, но и от близкородственных MPXV и CPXV [1]. После 1980 года в результате ликвидации оспы и повсеместного прекращения иммунизации против нее доля населения, чувствительного к VARV и другим патогенным для человека ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. Об этом свидетельствуют участившиеся многочисленные вспышки ортопокс-
вирусных инфекций среди людей, обусловленных такими вирусами, как MPXV, CPXV и VACV [2-6]. Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь катастрофические последствия для всего населения Земли [6]. Отсутствие эффективных противовирусных препаратов и опасность использования классической живой вакцины на основе VACV из-за тяжелых поствакцинальных осложнений требуют разработки современных безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций и схем их применения
[7, 8].
Ранее нами на основе штамма LIVP VACV, используемого в Российской Федерации для вакцинации людей, создан рекомбинантный вариант
VACA6 с направленным нарушением шести генов, кодирующих гемагглютинин (A56R), гамма-ин-терферонсвязывающий белок (B8R), тимидинки-назу (J2R), комплементсвязывающий белок (C3L), Вс12-подобный ингибитор апоптоза (N1L), и гена A35R, контролирующего презентацию антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II (МНСП). Показано, что инактивация выбранных генов вирулентности не влияет на репродуктивные свойства VACV на культурах клеток млекопитающих. Штамм VACA6 характеризуется значительно меньшей реактогенностью и нейровирулентностью и большей иммуногенностью по сравнению с исходным штаммом LIVP. При двукратном подкожном введении мышам рекомбинантный вариант VACA6 индуцирует появление достоверно более высокого уровня вируснейтрализующих антител, чем родительский штамм LIVP, и обеспечивает полную защиту мышей от высокопатогенного для них вируса эктромелии (ectromelia virus, ECTV), что не наблюдали в данной модели при использовании принятого в качестве противооспенной вакцины штамма LIVP [9, 10].
Другим независимым подходом к вакцинопро-филактике оспы, реализованным нами ранее, стала разработка поливалентной ДНК-вакцины на основе смеси рекомбинантных плазмид, содержащих под контролем промотора цитомегаловируса гены пяти вирионных белков VARV - A30, F8, M1, входящих в состав поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов, и A36 и B7, расположенных на оболочке внеклеточной формы вируса. При трехкратной внутрикожной иммунизации поливалентная ДНК-вакцина вызывала наработку вирусней-трализующих антител и обеспечивала полную защиту мышей от инфицирования ECTV в дозе 10
LD50 [11-13].
Для повышения эффективности противооспен-ной вакцинации помимо разработки принципиально новых вакцинных препаратов перспективным представляется сочетание различных типов вакцин, которые смогут дополнять друг друга и вызывать широкий и устойчивый иммунитет [14]. Подобная стратегия гетерологичной вакцинации (prime-boost), в рамках которой для праймирования иммунной системы предлагается использовать субъединичную вакцину (ДНК-вакцину), а для последующей бустер-ной вакцинации - аттенуированный вариант VACV, считается перспективной.
В данной работе сравнивали противооспенный иммунитет, формируемый при двукратной иммунизации различными комбинациями поливалентной ДНК-вакцины и высокоаттенуированного штамма VACA6.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактерии,вирусы, культуры клеток
В работе использовали Escherichia coli XL2-blue, штамм VACA6 [10], штамм LIVP VACV (производный штамма Lister, полученный в Институте вирусных препаратов, Москва) и штамм К-1 ECTV из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», перевиваемую культуру клеток почки африканской зеленой мартышки 4647 [15] из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», культивируемую на питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров.
Поливалентная ДНК-вакцина
Набор рекомбинантных плазмид на основе векторной плазмиды pcDNA3.1, несущей гены пяти антигенов VARV - A30, F8, M1 поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов, A36 и B7 оболочки внеклеточной формы вируса под контролем промотора цитомегаловируса, был получен ранее [11-13]. Плазмидные ДНК нарабатывали в клетках E. coli в препаративном количестве и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию плазмидной ДНК измеряли спектро-фотометрически на приборе Ultrospec 3000 pro (GE Healthcare Life Sciences, США).
Наработка и очистка вирусов
Монослой клеток линии 4647, выращенный на куль-туральных матрасах с ростовой поверхностью 175 см2 (объем 650 мл), инфицировали VACV (штамм VACA6 или LIVP) с множественностью заражения 1 БОЕ/кл. Вирус инкубировали на среде ДМЕМ с 2% эмбриональной сыворотки коров в течение 48 ч при температуре 37°С до полного цитопатического действия, затем получали криолизат (три цикла замораживания-оттаивания) инфицированных клеток, обрабатывали его на ультразвуковом дезинтеграторе типа MSE 500 мощностью 22 кГц 2-3 раза по 10-15 с. От клеточного дебриса освобождались низкоскоростным центрифугированием (10 мин при 4000 g). Супернатант центрифугировали в течение 1.5 ч при 30000 g. Осадок вируса ресуспендировали в 4 мл физиологического раствора. Инфекционный титр вируса определяли безагарозным методом бляшек в монослое клеток 4647.
Изучение иммуногенности и протективности
В работе использовали мышей линии Balb/c (самки, вес 14-16 г, возраст 5-6 недель) из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей объединяли в группы по 10 особей. Мышей иммунизировали
поливалентной ДНК-вакциной внутрикожно и подкожно смесью плазмид pcDNA-A30, pcDNA-A36, pcDNA-M1, pcDNA-F8 и pcDNA-B7 (по 50 мкг каждой плазмиды, суммарная доза 250 мкг/100 мкл на мышь). Иммунизацию проводили подкожно штаммами VACA6 или LIVP в количестве 107 БОЕ/100 мкл на мышь. Мышам контрольной группы вводили равный объем физиологического раствора, на котором готовили разведения вируса. Иммунизацию проводили дважды с интервалом 21 сут согласно табл. 1.
Через 19 сут после второй иммунизации у предварительно наркотизированных мышей отбирали пробы крови из ретробульбарного венозного сплетения, инкубировали их при 4°С в течение 24 ч для формирования фибринового сгустка, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g. Объединяли препараты сывороток одной группы и прогревали при 56°С в течение 30 мин. Титр VACV-нейтрализующих антител определяли на культуре клеток 4647 согласно [16], используя последовательные пятикратные разведения сывороток, которые смешивали с VACV штамм LIVP в рабочем разведении 50 БОЕ/лунку. Эффективность нейтрализации рассчитывали относительно числа бляшек в лунках без сывороток как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация VACV.
Через 21 сут после второй иммунизации животных в состоянии легкого эфирного наркоза подвергали интраназальной инокуляции высокопатогенным для мышей ECTV в дозе 150 LD50/20 мкл на мышь согласно [17]. Наблюдение вели в течение 14 сут, учитывали количество выживших и погибших мышей.
Анализ данных
Статистическую значимость экспериментальных данных оценивали по ¿-критерию Стьюдента с использованием программы Origin Professional 8.1.10.86. Различия считали статистически значимыми при P < 0.05 [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сконструированные ранее плазмиды pcDNA-A30, pcDNA-A36, pcDNA-M1, pcDNA-F8 и pcDNA-B7 нарабатывали в клетках E. coli в препаративном количестве и очищали с помощью EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen, США) согласно инструкции производителя с последующим подтверждением правильности вставок рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз AsuNHI и HindIII (рис. 1) и секвениро-вания.
Штаммы VACA6 и LIVP вируса осповакцины нарабатывали на культуре клеток 4647, рекомендованной для производства противооспенной вакцины [15], очищали по описанной выше методике, подлинность
M
A
A'
M'
M
6000 3000
000 750 500 250
Рис. 1. Электрофоретическое разделение в 1.2% ага-розном геле продуктов расщепления рекомбинантных плазмид эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и Нт^П. А - pcDNA-A30; А' - pcDNA-A36; М' - pcDNA-M1; F - pcDNA-F8;
В - pcDNA-B7 соответственно. М - ДНК-маркер, п.н.
LIVP VACA6
MABCN JA' MABCN JA' M
т ~ W Л ^ Л —
2500 2000 1500 * « » « м W4
1000 750 -
500 т
Рис. 2. Электрофоретический анализ в 1.2% агароз-ном геле фрагментов ДНК исходного родительского клона штамма LIVP VACV и рекомбинантного штамма с делециями шести генов - VACA6, полученных с помощью ПЦР с праймерами на гены A56R (А); B8R (B); C3L (C); NIL (Nj; J2R (J); A35R (A'). М - маркеры длины фрагментов ДНК, п.н.
F
B
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Схема проверки иммуногенности и протективности вакцинных препаратов на животных
Группа Препарат, доза на животное Проверка протективности, 42 сут
1-я иммунизация, 1 сут 2-я иммунизация, 21 сут
DNA&DNA ДНК-вакцина 250 мкг ДНК-вакцина 250 мкг Штамм К-1 ECTV, 150 LD50 ' 50
DNA&VACA6 ДНК-вакцина 250 мкг Штамм VACA6 107 БОЕ Штамм К-1 ECTV, 150 LDRn 50
VACA6&VACA6 Штамм VACA6 107 БОЕ Штамм VACA6 107 БОЕ Штамм К-1 ECTV, 150 LD50 50
LIVP&LIVP Штамм LIVP VACV 107 БОЕ Штамм LIVP VACV 107 БОЕ Штамм К-1 ECTV, 150 LDRn 50
K- Физраствор Физраствор Штамм К-1 ECTV, 150 LD50 50
Таблица 2. ПЦР-анализ для определения подлинности рекомбинантного варианта VACV
Ген Праймер, нуклеотидная последовательность (5' ^ 3') Штамм LIVP, п.н. Штамм VACA6, п.н.
A56R GTGGTATGGGACACCACAAATCCAA ATTAAACATTCCTAGAATTAATCCCGCTC 2366 1425
B8R TCACAAATATGATGGTGATGAGCGA CGTGATATACCCTAGCCATAGGCAT 1555 737
C3L TCGCGCTTTACATTCTCGAATCT TGTTCGTGTGTTCTTGCGGTGA 1542 751
N1L GGGTTGGATCCTTTACACATAGATCTACTACAGGCGGAACA GGGAAAGCTTAATTTGTGAAGATGCCATGTACTACGCT 1784 1431
J2R ATATGTTCTTCATGCCTAAACGA ATGAAGGAGCAAAAGGTTGTAAC 512 617
A35R ACGACGGATGCTGAAGCGTGTTATA AAACGATGTTACCAATCGTTTGCTAGGT 1880 1360
штаммов подтверждали с помощью ПЦР-анализа по локусам шести инактивированных генов (табл. 2, рис. 2).
Иммуногенность различных комбинаций (табл. 1) поливалентной ДНК-вакцины и высокоаттенуиро-ванного штамма VACA6 при двукратной иммунизации оценивали по уровню индуцируемых вирусней-трализующих антител в сыворотках крови мышей, полученных через 21 сут после второй иммунизации. Как видно из данных, приведенных на рис. 3, комбинация вакцинных препаратов DNA&VACA6 вызывает наработку VACV-нейтрализующих антител, уровень которых сопоставим с уровнем антител, индуцируемых двукратной вакцинацией родительским штаммом LIVP. При этом двукратная иммунизация штаммом VACA6 индуцировала значимо более высокий уровень вируснейтрализующих антител, что согласуется с полученными нами ранее данными [10].
Трехкратная иммунизация поливалентной ДНК-вакциной или двукратная иммунизация штаммом VACA6 обеспечивают, как показано нами ранее,
100% защиту мышей при последующем инфицировании ECTV в дозе 10 LD^/мышь [10, 12]. Поэтому с целью выявления различий между эффективностью использованных схем иммунизации была выбрана принципиально большая разрешающая доза ECTV - 150 LD^/мышь. В результате для трех исследуемых групп выявили частичный защитный эффект при двукратной иммунизации: DNA&VACA6, LIVP&LIVP и VACA6&VACA6 (рис. 4).
Максимальную выживаемость наблюдали в группе лабораторных животных VACA6&VACA6, двукратно вакцинированных штаммом VACA6, и в группе DNA&VACA6, в которой праймирование иммунной системы проводили поливалентной ДНК-вакциной, а для последующей бустерной вакцинации использовали аттенуированный вариант VACA6. В контрольной группе на 8-е сут, а в группе DNA&DNA на 9-е сут после заражения вирусом эктромелии наблюдали гибель всех животных. Отсутствие полной защиты может объясняться использованием слишком высокой дозы гетерологичного для VACV вируса эктромелии.
2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
Рис. 3. VACV-нейтрализующая активность сывороток, полученных после двукратной иммунизации ДНК-вакциной, штаммами VACA6 и LIVP VACV
DNA&DNA DNA&VACA6 LIVP&LIVP VACA6&VACA6
ОБСУЖДЕНИЕ
Первым способом защиты людей от опустошительных эпидемий натуральной оспы была вариоляция, т.е. внутрикожное внесение инфекционного материала от больных оспой здоровым людям. Индуцированное таким образом заболевание имело короткий инкубационный период и протекало в относительно легкой форме по сравнению с обычной респираторной передачей вируса от человека к человеку. Смертность при вариоляции составляла 0.5-2% вместо 20-30%, наблюдавшихся во время эпидемий натуральной оспы [19]. Открытие возможности вакцинации людей путем инокуляции вируса оспы коров, а затем вируса осповакцины, привело к значительному снижению риска тяжелых побочных реакций. Во второй половине XX века при использовании для иммунизации VACV смертность составляла 1-25 человек на 1 млн вакцинированных [20]. В группу риска при такой вакцинации попадают прежде всего люди с иммунодефицитом, такие, как пациенты, перенесшие трансплантацию, ВИЧ-инфицированные, лица, принимающие иммуноде-прессанты и др. В связи с этим активно разрабатывали модифицированные вакцины на основе VACV с улучшенными характеристиками безопасности, например, в России в конце XX века получили живую вакцину на основе рекомбинантного штамма LIVP VACV, которая была испытана на людях [21].
На сегодняшний день массовая вакцинация от натуральной оспы не проводится, однако, есть ряд категорий людей, которые имеют риск инфицирования натуральной оспой или другими патогенными орто-поксвирусами ввиду особенностей своей работы. Эти категории входят в группу риска, они проходят вакцинацию от оспы в обязательном порядке. В первую очередь, это касается работников, осуществляющих эпидемиологический надзор; медицинский персонал инфекционных отделений больниц; сотрудников вирусологических лабораторий, в которых проводятся
работы с ортопоксвирусами. В случае вспышки натуральной оспы (например, в результате биотеррористической атаки) необходимо будет вакцинировать всех жителей данного региона. Классическая противооспенная вакцина первого поколения на основе штамма LIVP, которая в настоящее время используется для вакцинации, имеет значительное количество противопоказаний и может приводить к различным по своей тяжести осложнениям. Стоит отметить определенную сложность демонстрации формируемого защитного иммунитета против оспы при вакцинации новыми профилактическими препаратами - натуральная оспа была ликвидирована, поэтому в отсутствие эпидемий невозможно протестировать эффективность этих вакцин в отношении естественного заболевания.
Ранее нами были реализованы два независимых подхода к разработке безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций человека. Был создан высокоаттенуированный вариант вируса осповакци-ны VACA6 с направленным последовательным нарушением шести генов и поливалентная ДНК-вакцина на основе пяти антигенов вируса натуральной оспы. В независимых экспериментах показано, что трехкратная иммунизация ДНК-вакциной и двукратная иммунизация VACA6 обеспечивали защиту мышей против летальной дозы (10 LD50) высокопатогенного для них вируса эктромелии [10, 12].
В данной работе сравнили иммунный ответ, который развивается против ортопоксвирусов, при различных схемах иммунизации ДНК-вакциной и VACA6. Один из шести генов, удаленных в реком-бинантном варианте VACA6, - ген A35R, продукт которого снижает презентацию антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II. Поэтому закономерно, что штамм VACA6 индуцирует более высокий, чем родительский клон LIVP, уровень VACV-нейтрализующих антител и более эффективно защищает животных от заражения ECTV в дозе
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
—K-
VACA6&VACA6 —LIVP&LIVP -DNA&DNA -•- DNA&VACA6
Рис. 4. Динамика гибели мышей, иммунизированных ДНК-вакциной, штаммами VACД6 и LIVP VACV, после заражения ECTV в дозе 150 LD на мышь
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 День после заражения, сут
150 LD . Комбинированная иммунизация ДНК-вакциной и рекомбинантным вариантом VACД6 приводила к меньшему уровню вируснейтрализующих антител, чем двукратная иммунизация VACД6, однако обеспечивала такой же уровень протективности. Последнее, по-видимому, может объясняться индукцией ДНК-вакциной в большей степени клеточного звена иммунного ответа при первичной иммунизации, также необходимого для эффективной элиминации ортопоксвирусов из организма [22, 23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе для повышения эффективности противооспенной вакцинации применили стратегию гетерологичной вакцинации, в рамках которой для праймирования иммунной системы использовали поливалентную ДНК-вакцину на основе пяти генов VARV, а для последующей бустерной вакцинации - аттенуированный вариант VACД6. Уровень индуцируемой при этом протективности был таким же, как в варианте с двукратной иммунизацией штаммом VACД6 и превосходил уровень, обусловленный двукратной иммунизацией штаммом LIVP
VACV, используемым в Российской Федерации для вакцинации людей. Предложенные схемы иммунизации могут быть использованы для разработки стратегии безопасной вакцинации против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека. Вариант ДНК-вакцинации с последующей вакцинацией живым аттенуированным вирусом VACД6 может рассматриваться как предпочтительный в плане безопасности. Следует отметить, что схема двукратной вакцинации не является оптимальной при проведении экстренной профилактики натуральной оспы, в этом случае предпочтительно однократное введение классической противооспен-ной вакцины на основе VACV штамм LIVP.
Работа выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности (2009—2014 годы)», Российского
фонда фундаментальных исследований (грант № 15-04-01326а), Российского научного фонда (проект № 16-15-10101) и бюджетного проекта ИЦиГ СО РАН № 0324-2015-0004.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М.: KMK Scientific Press Ltd., 1998. 386 c.
2. Stephenson J. // J. Am. Med. Assoc. 2003. V. 290. P. 23-24.
3. Lewis-Jones S. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. V. 17. P. 81-89.
4. Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., Graf P., Weber B.K., Meyer H., Büttner M., et al. // Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 777-780.
5. Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D., Meyer H., Capek I., Zandotti C., Charrel R.N. // Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 781-784.
6. Shchelkunov S.N. // PLoS Pathogens. 2013. V. 9. e1003756.
7. Shchelkunov S.N. // Vaccine. 2011. V. 29. Suppl. 4. P. D49-D53.
8. Breman J.G., Henderson D.A. // N. Engl. J. Med. 2002. V. 346. P. 1300-1308.
9. Yakubitsky S.N., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 4. P. 113-121.
10. Якубицкий С.Н., Колосова И.В., Максютов Р.А., Щелкунов С.Н. // Докл. Акад. наук. 2016. Т. 466. № 2. С. 241-244.
11. Максютов Р.А., Щелкунов С.Н. // Рос. иммунол. журн. 2010. Т. 4. № 1. С. 25-32.
12. Maksyutov R.A., Gavrilova E.V., Kochneva G.V., Shchelkunov S.N. // J. of Vaccines. 2013. http://dx.doi. org/10.1155/2013/618324.
13. Максютов Р.А., Щелкунов С.Н. // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2011. № 2. С. 30-34.
14. Radosevic K., Rodriguez A., Lemckert A., Goudsmit J. // Expert Rev. Vaccines. 2009. V. 8. P. 577-592.
15. Скарнович М.О., Радаева И.Ф., Вдовиченко Г.В., Нечаева Е.А., Сергеев А.А., Петрищенко В.А., Плясунов И.В., Шиш-
кина Л.Н., Терновой В.А., Сметанникова М.А. и др. // Вопр. вирусол. 2007. Т. 52. С. 37-40.
16. Leparc-Goffart I., Poirier B., Garin D., Tissier M.-H., Fuchs F., Crance J.-M. // J. Clin. Virol. 2005. V. 32. P. 47-52.
17. Martinez M.J., Bray M.P., Huggins J.W. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2000. V. 124. P. 362-377.
18. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы
в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд. мед. лит., 1962. 186 с.
19. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and Its Eradication. Geneva: World Health Organization, 1988. 1460 p.
20. Gurvich E.B. // Vaccine. 1992. V. 10. № 2. P. 96-97.
21. Черное В.И., Челяпов Н.В., Антонова Т.П., Рахилина Л.Е., Унанов С.С., Альтштейн А.Д., Захарова Л.А., Фодор И.И., Бендукидзе К.А., Комаров Ф.И. и др. // Вопр. вирусол. 1990. № 2. С. 132-135.
22. Kennedy J.S., Frey S.E., Yan L., Rothman A.L., Cruz J., Newman F.K., Orphin L., Belshe R.B., Ennis F.A. // J. Infect. Dis. 2004. V. 190. № 7. P. 1286-1294.
23. Ennis F.A., Cruz J., Demkowicz W.E., Rothman A.L., McClain D.J. // J. Infect. Dis. 2002. V. 185. № 11. P. 1657-1659.
