CC BY
14© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Г.Г.Харсеева, Н.А.Воронина, С.Ю.Тюкавкина
ВЛИЯНИЕ CORYNEBACTERIUM NON DIPHTHERIAE НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И АПОПТОЗ МАКРОФАГОВ
Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Цель. Определить способность Corynebacterium non diphtheriaе к индукции фагоцитоза и апоптоза макрофагов и оценить регуляторное влияние НфК, индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе, на данные процессы. Материалы и методы. Исследовали способность Corynebacterium non diphtheriaе, выделенных из верхних дыхательных путей, кожи и урогенитального тракта (УГТ), индуцировать фагоцитоз и апоптоз макрофагов (Мф) мышей (in vitro при окрашивании по Май-Грюнвальду и докрашиванием по Романовскому-Гимзе) до и после добавления нейтрофилокинов (НфК), индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе. Результаты. Фагоцитарный индекс (ФИ) был одинаков для всех видов Corynebacterium non diphtheriaе, фагоцитарное число (ФЧ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) — минимальны относительно коринебактерий, выделенных из УГТ. Все исследованные виды коринебактерий индуцировали апоптоз Мф, наиболее выраженное апоптогенное действие было выявлено у Corynebacterium pseudotuberculosis, выделенного из УГТ. НфК повышали ФЧ в отношении коринебактерий, выделенных их всех исследованных биотопов, ИЗФ — только при изучении коринебак-терий, выделенных с кожных покровов. Воздействие НфК приводило к снижению апоп-тогенного эффекта почти всех видов Corynebacterium non diphtheriaе, вне зависимости от места выделения. Заключение. Способом реализации патогенного действия Corynebacterium non diphtheriaе является их выраженное апоптогенное действие и недостаточность процессов индуцированного коринебактериями фагоцитоза. Возможно использовать НфК для иммунокоррекции иммунодефицитных состояний, развивающихся на фоне заболеваний, обусловленных Corynebacterium non diphtheriaе.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 96—100
Ключевые слова: Corynebacterium non diphtheriae, нейтрофилокины, апоптоз, фагоцитоз
G.G.Kharseeva, N.A.Voronina, S.Yu.Tyukavkina
EFFECT OF CORYNEBACTERIUM NON DIPHTHERIAE ON FUNCTIONAL ACTIVITY AND APOPTOSIS OF MACROPHAGES
Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Determine the ability of Corynebacterium non diphtheriae to induce phagocytosis and apoptosis of macrophages and evaluate regulatory effect of nuetrophilokines (NPK) induced by Corynebacterium non diphtheriae on these processes. Materials and methods. The ability of Corynebacterium non diphtheriae, isolated from upper respiratory tract, skin and urogenital tract (UGT) were studied for the ability to induce phagocytosis and apoptosis of mice macrophages (MP; in vitro during staining by May-Grunwald with additional staining by Romanowsky-Giemsa) before and after the addition ofNPK induced by Corynebacterium non diphtheriae. Results. Phagocytic index (PI) was the same for all the Corynebacterium non diphtheriae species, phagocytic number (PN) and index of phagocytosis completion (IPC) — were minimal relative to corynebacteria isolated from UGT. All the studied corynebacteria species induced MP apoptosis; the most pronounced apoptogenic effect was detected in Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from UGT. NPK increased PN against corynebacteria isolated from the studied biotopes, IPC — only during studies of corynebacteria isolated from skin. The effect of NPK resulted in a reduction of apoptogenic effect for almost all the Corynebacterium non diphtheriaе, regardless of the isolation location. Conclusion. A pronounced apoptogenic effect and insufficiency of phagocytosis processes induced by corynebacteria are the means of realization of Corynebacterium non diphtheriae
pathogenic effect. NPK use is possible for immune correction of immune deficiency conditions developing against the background of diseases determined by Corynebacterium non diphtheriae.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 96-100
Key words: Corynebacterium non diphtheriae, neutrophilokines, apoptosis, phagocytosis
Corynebacterium non diphtheriae (Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium bovis, и др.), являясь одними из главных представителей нормальной микрофлоры [1, 5, 6, 11, 13, 16], могут стать причиной развития патологических процессов в организме человека. Роль этих микроорганизмов в развитии заболеваний человека установлена недавно [6]. Наиболее часто недифтерийные коринебактерии в диагностически значимом количестве выделяются от лиц с иммуносупрессией или мультиорганной патологией, онкологических и гематологических больных, наркоманов, ВИЧ-инфицированных и пожилых людей [1, 3, 5, 11, 12].
Corynebacterium non diphtheriae, как и токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, обладают способностью снижать фагоцитарную активность и активизировать процессы апоптоза в клетках хозяина [9], что может быть обусловлено наличием поверхностных антигенов, cord-фактора, нейраминидазы, высокой уреазной активности. Повреждающее воздействие Corynebacterium non diphtheriae на организм в целом и на клетки иммунной системы, в частности, является важнейшим механизмом реализации их патогенного действия и способом выживания и распространения в организме [8, 9]. В связи с этим, закономерно встает вопрос о способах регуляции функциональной активности клеток иммунной системы, позволяющих повышать фагоцитарную активность макрофагов и их устойчивость к апоптогенному воздействию недифтерийных коринебактерий. Известно, что нейтрофилы, наряду с макрофагами и лимфоцитами, способны осуществлять регуля-торную функцию, опосредованную продуцируемыми ими низкомолекулярными пептидами — нейтрофилокинами (НфК) [2, 8, 10]. С этих позиций, представляет интерес оценить характер воздействия НфК на процессы фагоцитоза и апоптоза макрофагов, индуцированных Corynebacterium non diphtheriae.
Целью настоящего исследования явилось определение способности Corynebacterium non diphtheriae к индукции фагоцитоза и апоптоза макрофагов, а также оценка регулятор-ного влияния НфК, индуцированных Corynebacterium non diphtheriae, на данные процессы.
Объектом исследования послужили Corynebacterium non diphtheriae, выделенные за период с 2010 по 2013 гг. из верхних дыхательных путей (ВДП) от больных острым и хроническим тонзиллитом, острым ринитом (^pseudotuberculosis, C.pseudodiphtheriticum); с поверхности кожи от больных с аллергическими заболеваниями и дерматитами (С. pseudotuberculosis, C.pseudodiphtheriticum, C.xerosis); из урогенитального тракта (УГТ) от пациентов с острым и хроническим пиелонефритом, острым кольпитом и лиц, проходивших профилактическое обследование (^pseudotuberculosis, C.amycolatum, C.xerosis).
Штаммы Corynebacterium non diphtheriae идентифицировали общепринятыми методами [6], а также методом секвенирования по 16S рРНК (ЗАО «Синтол», Москва).
В работе использовали беспородных мышей массой 19 — 21 г, полученных из вивария Ростовского-на-Дону противочумного института.
Для получения НфК мышам вводили внутрибрюшинно 2 мл 0,1% раствора гликогена на стерильном забуференном изотоническом растворе натрия хлорида (рН 7,2). Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5 мг/кг через 4 часа после введения препарата. Перитонеальный экссудат, содержащий до 90% нейтрофилов, получали путем вымывания из брюшной полости мышей средой 199 (10 мл), содержащей 20% инактивированной (56°C, 30 мин.) сыворотки крупного рогатого скота, 5 ед/мл гепарина и пенициллина (100 мг/л). В качестве индуктора синтеза нейтрофилокинов использовали микробные клетки Corynebacterium non diphtheriae густотой 0,5 ОЕ (500 млн м.т./ мл). Контролем служил 0,15 М раствор натрия хлорида. Длительность примирования клеток указанными препаратами составила 4 часа при 37°C в атмосфере 5% СО2. После окончания срока инкубации супернатанты получали центрифугированием культуральной
7. ЖМЭИ 6 № 34
97
жидкости при 1000 об/мин в течение 10 мин. и изучали регуляторное влияние полученных НфК на фагоцитарную активность макрофагов (Мф) и их устойчивость к апоптогенному действию исследованных штаммов Corynebacterium non diphtheriaе.
Для постановки реакции фагоцитоза [4] перитонеальный экссудат (0,8 мл) смешивали с микробной взвесью исследованных штаммов Corynebacterium non diphtheriaе густотой 0,5 ОЕ (0,04 мл) и НфК в объеме по 0,04 мл. Фагоцитарную активность Мф определяли по следующим показателям: фагоцитарное число (ФЧ) — среднее количество поглощенных частиц на 1 клетку и фагоцитарный индекс (ФИ) — процент фагоцитирующих клеток в мазках по Романовскому-Гимзе; индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) — отношение количества колоний в контроле к количеству колоний в опыте. Для определения ИЗФ проводили высевы из полученных смесей в объеме 0,02 мл на чашки с 20% сывороточным агаром через 15 мин (контроль) и 1,5 часа (опыт), чашки инкубировали при 37°C 24 часа, после чего осуществляли подсчет количества выросших колоний.
Апоптогенную активность штаммов Corynebacterium non diphtheriaе в отношении пери-тонеальных Мф мышей изучали до и после добавления НфК in vitro по характерным морфологическим изменениям в клетках при окрашивании по Май-Грюнвальду и докрашиванием по Романовскому-Гимзе [9]. Для исследования использовали микробные взвеси культур коринебактерий густотой 0,5 ОЕ (500 млн м.т./мл) в разведении 1/10, которые соединяли с перитонеальным экссудатом и НфК в равных объемах.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов Microsoft Office 2007 и Statistica 6,0 для Windows XP, а также с помощью [7]. Достоверность полученных результатов оценивали при уровне значимости t>2 (Р>95%).
При сравнении поглотительной активности Мф мышей, индуцированной исследованными видами Corynebacterium non diphtheriaе, выделенными из различных биотопов, никаких отличий при определении ФИ установлено не было. Средний показатель ФЧ был выше (t>2, Р>95%) при использовании коринебактерий, выделенных из ВДП (2,4±0,03), по сравнению с таковым для коринебактерий из других биотопов: кожные покровы (1,7±0,02) и УГТ (0,9±0,01). Максимальные значения ФЧ были выявлены при оценке поглотительной активности Мф в отношении вида Cpseudodiphtheriticum (3,4±0,03), выделенного из ВДП, и ^pseudotuberculosis (2,0±0,02), выделенного с поверхности кожи. В то же время, наименьшее (t>2, Р>95%) среднее значение ФЧ выявили при исследовании Corynebacterium non diphtheriaе, выделенных из УГТ (0,9±0,01).
Обработка макрофагов НфК не оказывала влияния на поглотительную активность макрофагов в отношении Corynebacterium non diphtheriaе, оцениваемую по показателю ФИ. При определении ФЧ, напротив, наблюдали достоверное (t>2, Р>95%) его увеличение при использовании Corynebacterium non diphtheriaе, выделенных из различных биотопов. Примечательно, что максимальное значение ФЧ было зарегистрировано при исследовании коринебактерий, выделенных из ВДП (3,3±0,04), а минимальное — из УГТ (2,1±0,02).
При исследовании переваривающей активности Мф максимальные (t>2, Р>95%) значения ИЗФ (2,8±0,3) были определены для Cpseudotuberculosis, выделенных с кожных покровов. При этом средний показатель ИЗФ относительно Corynebacterium non diphtheriaе из данного биотопа (2,0±0,2) был выше (t>2, Р>95%) по сравнению с аналогичным для коринебактерий, выделенных из УГТ (1,5±0,1).
Изменения средних показателей переваривающей активности Мф под влиянием НфК наблюдали только для изолятов коринебактерий, выделенных с кожных покровов: ИЗФ достоверно (t>2, Р>95%) увеличился и составил 2,9±0,4. При этом киллинг макрофагами Corynebacterium non diphtheriaе, выделенных из УГТ, был минимальным (1,7 ±0,1) по сравнению с таковым коринебактерий из ВДП (2,1±0,2) и кожных покровов (2,9±0,4).
Все исследованные виды Corynebacterium non diphtheriaе обладали способностью индуцировать апоптоз Мф, количество клеток с апоптозом находилось в пределах от 42,8±6,7% до 70,0±6,4%. Никаких отличий при сравнении апоптогенной активности коринебактерий, выделенных из различных биотопов, обнаружено не было. При сравнении способности различных видов коринебактерий внутри биотопа индуцировать апоптоз Мф отличия были зарегистрировано только для Corynebacterium non diphtheriaе, выделенных из УГТ. Так, % Мф с признаками апоптоза, индуцированного С. pseudotuberculosis (70,0±6,4%), был достоверно (t>2, Р>95%) выше, чем вызываемый С. amycolatum (42,8±6,7%) и С. xerosis (45,3±6,8%), изолированных из этого же биотопа.
Добавление в реакционную смесь НфК приводило к повышению устойчивости Мф к апоптогенному воздействию Corynebacterium non &рЬШег1ае. Об этом свидетельствовало достоверное (t>2, Р>95%) снижение средних показателей апоптоза Мф, индуцированного коринебактериями, выделенными из всех исследованных биотопов. При этом апопто-генная активность C.pseudotuberculosis, выделенных с кожных покровов (58,8+6,9%) и УГТ (48,4,0+6,6%), достоверно (t>2, Р>95%) превышала таковую других коринебактерий, выделенных из этих же биотопов.
Поглотительная активность Мф, оцениваемая по показателю ФИ, была одинакова для всех видов Corynebacterium non diphtheriaе, вне зависимости от места их выделения. В то же время, значения ФЧ были минимальны относительно коринебактерий, выделенных из УГТ. При этом показатель ФЧ для C.pseudotuberculosis, выделенных их ВДП и УГТ, был ниже, чем для других видов коринебактерий из этих же биотопов. Переваривающая активность Мф также была наименее выражена в отношении коринебактерий, выделенных из УГТ. Однако, в отличие от ФЧ, ИЗФ относительно C.pseudotuberculosis имел значения, превышающие таковые для других видов Corynebacterium non diphtheriaе. Все исследованные виды коринебактерий индуцировали апоптоз Мф, причем наиболее выраженное апоптогенное действие было выявлено у C.pseudotuberculosis, выделенных из УГТ. С. pseudotuberculosis, помимо C.diphtheriaе и C.ulcerans, является единственным известным на сегодняшний день видом коринебактерий, способным продуцировать токсин, имеющий активность фосфолипазы D, сфингомиелиназы и проникающего фактора [14]. Однако способность к длительной персистенции в организме и антифагоцитарные свойства корине-бактерий связаны не только с действием токсина, но и наличием у них cord-фактора, мико-ловых кислот, способности продуцировать каталазу и супероксиддисмутазу. По результатам наших исследований, C.pseudotuberculosis, по сравнению с другими видами коринебактерий, обладал наиболее выраженной способностью индуцировать процессы завершенного фагоцитоза, однако максимальной была и его способность вызывать программированную гибель Мф. По-видимому, высокая апоптогенная активность C.pseudotuberculosis, обусловленная интерференцией действия его факторов патогенности, обладающих как токсической, так и антифагоцитарной функцией, является одним из способов защиты данного вида корине-бактерий от фагоцитоза. Известно, что гибель клеток организма путем апоптоза благоприятна для бактерий, так как при этом не происходит запуска воспалительных реакций [8] и создаются условия для длительной персистенции возбудителя.
Учитывая данные о широком спектре иммунорегуляторной активности НфК (2, 10], мы изучили возможность их использования для иммунокоррекции процессов фагоцитоза и апоптоза Мф, индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе. НфК повышали поглотительную активность Мф, оцениваемую по ФЧ, в отношении коринебактерий, выделенных из всех исследованных биотопов. Увеличение переваривающей активности Мф наблюдали только при изучении коринебактерий, выделенных с кожных покровов. Примечательно, что наименьшие средние показатели фагоцитарной активности Мф как исходные, так и при добавлении НфК были зарегистрированы относительно Corynebacterium non diphtheriaе, изолированных из УГТ. Известно, что одними из доминирующих микроорганизмов, выделяемых при патологии УГТ, являются коринебактерии (60 — 70%), причем доказана роль некоторых из них (C riegelii, C. urealyticum) в генезе воспалительных заболеваний нижних мочевых путей и уросепсиса [11]. При острых воспалительных заболеваниях ВДП недифтерийные коринебактерии выделяются реже — в 10 — 15% случаев [15]. По нашим данным, несмотря на то, что фагоцитарная активность Мф была ниже относительно коринебактерий, выделенных из УГТ, устойчивость Мф к апоптогенному действию Corynebacterium non diphtheriaе одинакова вне зависимости от места их выделения. При этом воздействие НфК приводило к снижению апоптогенного эффекта почти всех видов взятых в исследование Corynebacterium non diphtheriaе также вне зависимости от биотопа, из которого они были выделены.
Таким образом, одним из возможных способов реализации патогенного действия Corynebacterium non diphtheriaе является их угнетающее влияние на клетки иммунной системы, обусловленное, прежде всего, выраженным апоптогенным действием, а также недостаточностью процессов индуцированного коринебактериями фагоцитоза. Это, по всей видимости, способствует длительной персистенции коринебактерий в организме и, как следствие, развитию воспалительных заболеваний различной локализации. Результаты наших исследований указывают на возможность использования НфК для иммунокоррек-
ции иммунодефицитных состояний, развивающихся на фоне заболеваний, обусловленных
Corynebacterium non diphtheriaе, и связанных, вероятно, с их апоптогенным действием на
клетки иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анохин В.А., Халиуллина C.B., Назарова О.А. и др. Олучай раннего неонатального сепсиса, обусловленного C.amycolatum. Практическая медицина. 2012, 7: 178-180.
2. Васильева Г.И., Козловский В.Н., Киселева А.К. и др. Влияние нейтрофилокинов на синтез лимфокинов в процессе формирования противочумного иммунитета. Журн. микробиол. 2005, 1: 61-65.
3. Костюкова Н.Н., Михайлова В.С, Малахов В.Н. и др. Опыт проведения внешней оценки качества идентификации видов рода Corynebacterium. Клиническая лабораторная диагностика. 2002, 12: 43-45.
4. Кондратьева И.А., Cамуилов В.Д. Практикум по иммунологии. М., МГУ, 2001.
5. Краева Л.А., Манина Ж.Н., Ценева Г.Я. и др. Этиологическое значение Corynebacterium non diphtheriae у больных с различной патологией. Журн. микробиол. 2007, 5: 3-7.
6. МР 4.2.00.20-11. Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium. М., 2011.
7. Cтрелков Р.Б. Cтатистические таблицы для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала. Обнинск, 1980.
8. Тюкавкина СЮ. Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний. Иммунология. 2013, 1: 52-56.
9. Харсеева Г.Г., Воронина Н.А., Алутина Э.Л. и др. Роль Corynebacterium non diphtheriaе в индукции апоптоза макрофагов мышей. Иммунопатол. аллергол. инфектол. 2012, 1: 56-59.
10. Швыдченко И.Н., Нестерова И.В., ^нельникова Е.Ю. Цитокин-секретирующая функция нейтрофильных гранулоцитов. Иммунология. 2005, 1: 31-34.
11. Aygun G., Midilli K., Cilingir H. et al. A fatal case of urosepsis due to Corynebacterium riegelii. Braz. J. Microbiol. 2013, 44 (2): 475-476.
12. Belmares J., Detterline S., Pak J.B. et al. Corynebacterium endocarditis species-specific risk factors and outcomes. BMC Infect. Dis. 2007, 6: 7-14.
13. Bonmarin I., Guiso N., Grimont P.A.D. Diphtheriae: a zoonotic disease in France? Vaccine. 2009, 27 (31): 4196-4200.
14. Dorella FA., Pacheco L.G., Oliveira S.C. et al. Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet. Res. 2006, 37 (2): 201-218.
15. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge J.E. Clinical microbiology of corynefopm bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 1997, 1: 125-159.
16. Knox K., Nolmes A. Nosocomial endocarditis caused by Corynebacterium amycolatum and other nondiphtheriae Corynebacterium. J. Emerg. Inf. Dis. 2002, 8 (1): 97-99.
Поступила 27.02.2014
Контактная информация: Харсеева Галина Георгиевна, д.м.н., проф.,
344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29, р.т. (632)250-41-09
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
И.Н.Дьяков1, В.С.Покровский2, Е.П.Санникова3, Н.В.Булушова3, М.В.Покровская4, С.С.Александрова4
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ИММУНОГЕННОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ L-АСПА-РАГИНАЗ
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина, 3ГосНИИ генетика, 4НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича, Москва
Цель. Оценка иммунного ответа у мышей на различные L-аспарагиназы и определение их перекрестной иммуногенности. Материалы и методы. Исследования проводили на мышах линии C57Bl6j. Исследовали иммуногенность L-аспарагиназ: Escherichia coli II
