CC BY
103
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3
Вып. 1
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ
УДК 612.118
А. В. Крысова, А. Д. Ноздрачёв, А. А. Куншин, В. И. Циркин
ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ АЛЬФА- И БЕТА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ НА СПОСОБНОСТЬ АДРЕНАЛИНА ИЗМЕНЯТЬ ОСМОТИЧЕСКУЮ РЕЗИСТEНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ НЕБЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
Введение
Известно, что эритроциты содержат большое количество различных адреноре-цепторов (АР), в том числе а^АР, а2-АР, в^АР, р2-АР и рз-АР [1]. Так, согласно данным радиолигандных исследований, в одном эритроците человека содержится до 90-300 в-АР [2], а в одном эритроците крыс — до 286 в-АР [3]. Адренореактивность эритроцитов, т. е. характер их ответа на воздействие адренергических средств, в том числе неселективных и селективных агонистов, соответствующих АР, может меняться в зависимости от соотношения различных типов адренорецепторов [4]. Считается, что адренореактивность эритроцитов отражает адренореактивность внутренних органов [5-8]. По этой причине информация о ней может быть полезной, в том числе при профессиональном отборе лиц экстремальных профессий [7]; при оценке тяжести бронхиальной астмы [9] и гестоза [5, 10], а также для прогноза течения родов [5, 8].
Известны разные способы оценки адренореактивности эритроцитов. Чаще используются способы, основанные на изучении влияния различных адренергических средств на осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) [7, 9, 11]. Однако до настоящего времени отсутствует общепризнанная методика оценки ОРЭ, в том числе в отношении степени гипотоничности среды и вида адренергических средств. Так, ряд авторов [7, 8] определяли адренореактивность эритроцитов, помещенных на 30 мин при комнатной температуре в 0,45%-ный раствор №С1, по изменению их ОР под влиянием высоких концентраций пропранолола (7,5 • 10-3 г/мл). При этом они оценивали число гемолизи-рованных эритроцитов фотоэлектрокалориметрическим способом по Л. И. Идельсону
Крысова Анна Владимировна — аспирант, Вятский государственный гуманитарный университет; e-mail: tsirkin@list.ru
Ноздрачёв Александр Данилович — д-р биол. наук, академик РАН; профессор Санкт-Петербургского государственного университета; e-mail: and@infran.ru
Куншин Алексей Александрович — канд. биол. наук, доцент, Вятский социально-экономический институт; внештат. науч. сотр., Вятский государственный гуманитарный университет; e-mail: valeology@vshu.kirov.ru
Циркин Виктор Иванович — д-р мед. наук, профессор, Казанский государственный медицинский университет; профессор, Вятский государственный гуманитарный университет; e-mail: tsirkin@list.ru © А. В. Крысова, А. Д. Ноздрачёв, А. А. Куншин, В. И. Циркин, 2013
(1974) [12], т. е. по изменению оптической плотности надосадочной жидкости. А. П. Бабин и соавторы [11], используя метод Л. И. Идельсона, оценивали адренореактивность эритроцитов, помещаемых в 0,40%-ный раствор №С1 на 30 мин при 37 °С, по изменению числа гемолизированных эритроцитов под влиянием адренергических средств (адреналина, пропранолола, ницерголина и адреналина совместно с указанными бло-каторами). Реже для оценки адренореактивности эритроцитов применяются способы адренозависимой СОЭ [5] и адренозависимой агрегации эритроцитов, индуцированной алциановым голубым [10], позволяющие оценивать изменения указанных показателей под влиянием адренергических средств. Однако отсутствие однозначных данных о физиологической роли адренорецепторов в реализации осмотического гемолиза, оседания и агрегации эритроцитов и четкой зависимости эффекта адреналина от его концентрации в среде — все это привело к тому, что указанные выше способы не стали общепризнанными методами. Поэтому в настоящее время сохраняется потребность в разработке новых методов, адекватно отражающих адренореактивность эритроцитов.
В связи с этим нами был разработан метод оценки ОРЭ [13], основанный на подсчете числа негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ), оставшихся после их 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции в дистиллированной воде (ДВ), содержащей 2,5 мМ СаС12. Мы считали возможным на базе этого метода создать способ оценки адренореак-тивности, основанный на регистрации изменений ОРЭ под влиянием адренергических средств (адреналина и адреналина совместно с адреноблокаторами). Предварительные исследования показали [14], что адреналин способен изменять ОРЭ: либо повышать ее, либо снижать, а направленность и выраженность этих изменений зависит от концентрации адреналина, времени экспозиции эритроцитов, т. е. от исследуемой фракции эритроцитов, а также (у небеременных женщин) от фазы менструального цикла, т. е. от уровня половых гормонов. Мы предположили, что все эти особенности реакции эритроцитов на адреналин могут быть связаны с тем, что каждая фракция эритроцитов характеризуется определенным набором а-АР и в-АР, который (как и эффективность активации соответствующих АР) может изменяться под влиянием половых гормонов.
С учетом потребности создания объективного метода оценки адренореактивности эритроцитов в данной работе была поставлена цель изучить роль а-АР, в1-АР и в2-АР в изменении осмотической резистентности эритроцитов небеременных женщин, происходящем под влиянием адреналина. Для этого в четырех сериях опытов было изучено влияние неселективного блокатора в-АР пропранолола, или обзидана (10-8 и 10-5 г/мл), селективного блокатора в1-АР атенолола (10-8 г/мл), неселективного блокатора а-АР ницерголина (10-8 и 10-6 г/мл) и смеси ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл) на способность адреналина (10-10-10-6 г/мл) изменять осмотическую резистентность пяти фракций эритроцитов небеременных женщин (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120), т. е. эритроцитов, экспонируемых соответственно в течение 30, 45, 60, 90 и 120 с в ДВ, содержащей 2,5 мМ СаС12.
Материалы и методы исследования
В серии 1 оценивали влияние адреноблокаторов — обзидана (10-8 и 10-5 г/мл), ницерголина (10-8 и 10-6 г/мл), атенолола (10-8 г/мл) и смеси ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл) на ОР пяти фракций (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120) эритроцитов небеременных женщин (п = 40; без учета фазы цикла).
Для оценки роли а-АР, в1-АР и в2-АР в изменении ОР различных фракций эритроцитов под влиянием высоких концентраций адреналина были проведены серии 2 и 3. В серии 2 оценивали влияние высоких концентраций адреноблокаторов — обзидана (10-5 г/мл), ницерголина (10-6 г/мл), а также смеси ницерголина (10-6 г/мл) и атеноло-ла (10-6 г/мл) — на способность адреналина (10-6 г/мл) изменять осмотическую резистентность пяти фракций (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120) эритроцитов небеременных женщин (п = 38; без учета фазы цикла). В серии 3 оценивали влияние низких концентраций адреноблокаторов (10-8 г/мл) — обзидана, ницерголина и атенолола — на способность адреналина (10-6 г/мл) изменять ОР двух фракций эритроцитов (Ф30 и Ф60) небеременных женщин (п = 17; без учета фазы цикла).
Для изучения роли а-АР, в1-АР и в2-АР в изменении ОРЭ под влиянием адреналина, используемого в широком диапазоне концентраций, и влияния на адренореактивность эритроцитов половых гормонов была проведена серия 4. В ней оценивали влияние смеси двух адреноблокаторов — ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл) на способность адреналина в концентрациях 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл изменять ОРЭ фракции Ф45. Опыты проведены с эритроцитами небеременных женщин, 11 из которых находились в фолликулярной фазе цикла, т. е. на 3-12-й день от первого дня менструации, а 10 женщин — в лютеиновой фазе, т. е. на 16-24-й день цикла. Всего исследовано 116 небеременных женщин в возрасте 18-25 лет с их личного согласия.
Исследование ОР эритроцитов капиллярной крови проводили по методике В. И. Циркина и соавторов [13]. Забор крови в объеме 0,02 мл проводили с помощью микропипетки гемометра Сали. Этот объем вносили в пробирку с 0,2 мл 0,9%-ного раствора №С1, содержащего гепарин (1 МЕ/мл) и СаС12 (2,5 мМ), и этой смесью кровь разводили в 10 раз. Затем 0,02 мл этого разведения добавляли в пробирку, содержащую 0,4 мл 3%-ного раствора №С1, т. е. кровь разводили в конечном итоге в 200 раз. Это позволяло оценить исходное число негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) в 1 л крови, т. е. абсолютный контроль (АК). Все дальнейшие действия зависели от серии опытов.
В серии 1 готовили 10 пробирок, 5 из которых предназначались для определения ЧНЭ после 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции эритроцитов в ДВ, содержащей 2,5 мМ СаС12, т. е. для определения соответствующего экспозиционного контроля (ЭК30—ЭК120). Для этого в каждую пробирку вносили по 0,2 мл ДВ с 2,5 мМ СаС12, затем добавляли по 0,02 мл 10-кратно разведенной капиллярной крови, после чего точно через 30, 45, 60, 90 и 120 с (соответственно в 1, 2, 3, 4 и 5-ю пробирки) с целью остановки гемолиза эритроцитов вносили по 0,2 мл 6%-ного раствора №С1. Это приводило к конечному разведению крови в 200 раз и позволяло оценить ЭК30—ЭК120, которое выражали в абсолютных и относительных (в % к АК) значениях. Остальные пять пробирок (с 6-й по 10-ю) служили для оценки влияния адреноблокатора или смеси адре-ноблокаторов в соответствующей концентрации на ОР эритроцитов при их 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции в ДВ. Для этого в каждую пробирку вносили по 0,2 мл ДВ, содержащей, помимо 2,5 мМ СаС12, адреноблокатор или смесь адренобло-каторов в одной из концентраций. Затем (как и в первые пять пробирок) вносили по 0,02 мл 10-кратно разведенной капиллярной крови, а через 30, 45, 60, 90 и 120 с (соответственно в 6, 7, 8, 9 и 10-ю пробирки) вносили по 0,2 мл 6%-ного раствора №С1 и оценивали значения Облок, т. е. ЧНЭ, оставшихся после 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секунд-ной экспозиции в ДВ с адреноблокатором. Это число (Облок) выражали в абсолютных и относительных (в % к АК и в % к соответствующему ЭК^ значениях. В тех случаях,
в которых исследовалось не пять, а две фракции эритроцитов (Ф30 и Ф60), число пробирок соответственно было уменьшено.
В серии 2 при исследовании влияния обзидана готовили 15 пробирок. Первые пять служили для определения ЧНЭ после их 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции в ДВ, содержащей 2,5 мМ СаС12, т. е. для определения соответствующего экспозиционного контроля (ЭК30—ЭК120). Следующие пять пробирок (с 6-й по 10-ю) предназначались для оценки влияния адреналина (10-6 г/мл) на ОР эритроцитов при их 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции в ДВ, т. е. для определения Оадр, а остальные пять пробирок — для оценки влияния адреналина совместно с обзиданом, т. е. для определения Оадр+в-во. Аналогично использовали наборы из 15 пробирок при исследовании влияния ницерголина и ницерголина совместно с атенололом на способность адреналина изменять ОРЭ. При этом принцип заполнения пробирок был таким же, как в серии 1 и в опытах с обзиданом.
В серии 3 при оценке влияния обзидана использовали 6 пробирок, в том числе 1-ю и 2-ю для определения ЭК30 и ЭК60, 3-ю и 4-ю — для определения влияния адреналина (10-6 г/мл) на ОРЭ фракции Ф30 и Ф60, т. е. Оадр, а 5-ю и 6-ю — для определения влияния адреналина в смеси с обзиданом, т. е. О адр+в-во. Аналогично использовали наборы из 6 пробирок при исследовании влияния ницерголина и атенолола.
В серии 4 при оценке влияния смеси ницерголина и атенолола на способность адреналина в широком диапазоне концентраций (10-10-10-6 г/мл) изменять ОРЭ фракции Ф45 небеременных женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла, использовали 11 пробирок. Из них 1-я служила для определения экспозиционного контроля (ЭК45), т. е. ЧНЭ при 45-секундной экспозиции в ДВ, а следующие пять (со 2-й по 6-ю) служили для определения влияния адреналина в соответствующей концентрации (с 10-10 по 10-6 г/мл) на ОРЭ, т. е. для определения Оадр для каждой из указанных концентраций адреналина. Остальные пять пробирок (с 7-й по 11-ю) служили для определения влияния адреналина в соответствующей концентрации в смеси с ницерголином и атенололом, т. е. на фоне блокады а-АР и в1-АР. Аналогично использовали 11 пробирок при исследовании эритроцитов небеременных женщин, находящихся в лютеи-новой фазе цикла.
Во всех сериях подсчет эритроцитов проводили микроскопическим методом, используя микроскоп типа Биолам ЛОМО (ИМ13) и счетную камеру Алферова—Бюргера с сеткой Горяева.
Результаты исследования подвергнуты статистической обработке [15]. В тексте и в таблицах они представлены в виде М ± т, а различия оценивали непараметрическим методом Манна—Уитни, считая их достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования
Результаты каждой серии представлены в соответствующих таблицах 1-4. Как видно из таблиц, уровень эритроцитов в крови небеременных женщин, т. е. абсолютный контроль (АК), варьировал от 3,83 до 4,59 (х1012). При 30-секундной экспозиции в воде ЧНЭ снижалось до 84,6-66,8% от исходного уровня, т. е. от АК, при 45-, 60-, 90 и 120-секундной экспозиции — соответственно до 70,3-56,3, 53,9-37,9, 30,1-13,9 и 13,6-1,4%. Эти данные подтверждают целесообразность выделения отдельных фракций эритроцитов (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120) по их осмотической устойчивости.
Таблица 1. Число (М ± т) негемолизированных эритроцитов капиллярной крови небеременных женщин до (абсолютный контроль, АК) и после их 30-120-секундной экспозиции в дистиллированной воде (ДВ) с 2,5 мМ СаС12 (экспозиционный контроль, ЭК) или в ДВ совместно с 2,5 мМ СаС12 и блокаторами адренорецепторов (опыт, Облок)
Длительность экспозиции, с Число эритроцитов
АК ЭК Облок
в 1 л (х1012) ДВ+2,5 мМ СаС12 ДВ+2,5 мМ СаС12 + блокатор
в 1 л (х1012) в % к АК в 1 л (х1012) в % к АК в % к ЭК
Ницерголин, 10 6 г/мл, п = 12
30 3,99 ± 0,16 3,37 ± 0,14* 84,6 ± 2,9* 3,60 ± 0,17* 90,5 ± 3,0* 108,1 ± 3,9
45 3,99 ± 0,16 2,74 ± 0,10* 69,5 ± 3,5* 2,81 ± 0,14* 70,9 ± 3,4* 103,7 ± 5,9
60 3,99 ± 0,16 2,15 ± 0,12* 53,9 ± 2,1* 2,34 ± 0,10* 58,8 ± 3,9* 107,3 ± 6,8
90 3,99 ± 0,16 1,22 ± 0,14* 30,1±2,6* 1,29 ± 0,21* 31,7 ± 4,6* 95,8 ± 14,5
120 3,99 ± 0,16 0,55 ± 0,07* 13,6 ± 1,6* 0,95 ± 0,36* 23,4 ± 8,1* 92,5 ± 16,8
Ницерголин, 10 8 г/мл, п = 8
30 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 2,77 ± 0,31* 60,2 ± 6,1* 87,6 ± 10,5
60 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,32 ± 0,31* 60,7 ± 10,4* 115,6 ± 12,2
Ницерголин, 10 6 г/мл + атенолол, 10 6 г/мл, п = 10
30 4,01 ± 0,20 2,64 ± 0,13* 66,8 ± 4,2* 2,54 ± 0,22* 64,0 ± 5,1* 99,4 ± 7,4
45 4,01 ± 0,20 2,19 ± 0,14* 56,3 ± 4,6* 2,16 ± 0,17* 54,8 ± 4,6* 97,2 ± 3,3
60 4,01 ± 0,20 1,73 ± 0,10* 43,4 ± 2,9* 1,90 ± 0,17* 47,6 ± 3,9* 107,9 ± 6,3
90 4,01 ± 0,20 0,94 ± 0,12* 23,8 ± 3,2* 0,94 ± 0,22* 23,5 ± 4,9* 105,2 ± 16,9
120 4,01 ± 0,20 0,48 ± 0,10* 12,1±2,1* 0,59 ± 0,12* 14,2 ± 2,5* 119,2 ± 14,2
Атенолол, 10 8 г/мл, п = 8
30 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 2,97 ± 0,42* 64,0 ± 7,9* 93,9 ± 14,2
60 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,53 ± 0,47* 56,7 ± 10,6* 127,2 ± 22,4
Обзидан, 10 5 г/мл, п = 10
30 4,12 ± 0,26 3,03 ± 0,14* 74,8 ± 4,0* 2,90 ± 0,11* 72,4 ± 4,3* 100,7 ± 2,8
45 4,12 ± 0,26 2,57 ± 0,18* 63,6 ± 4,7* 2,52 ± 0,16* 62,6 ± 4,7* 94,7 ± 3,2
60 4,12 ± 0,26 1,88 ± 0,22* 46,2 ± 5,1* 2,01 ± 0,19* 47,7 ± 4,3* 111,8 ± 9,9
90 4,12 ± 0,26 0,89 ± 0,23* 21,1 ± 5,0* 1,01 ± 0,24* 24,7 ± 6,1* 120,2 ± 24,5
120 4,12 ± 0,26 0,51 ± 0,18* 11,8 ± 4,0* 0,55 ± 0,19* 13,4 ± 4,4* 83,0 ± 15,9
Обзидан, 10 8 г/мл, п = 8
30 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 2,79 ± 0,33* 60,0 ± 5,5* 89,0 ± 11,4
60 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,66 ± 0,39* 60,4 ± 8,9* 137,7 ± 20,2
* Различие с АК достоверно (р < 0,05) по критерию Манна—Уитни. Все различия Облок с ЭК носят недостоверный характер (р > 0,05) по критерию Манна—Уитни.
Таблица 2. Число (М ± т) негемолизированных эритроцитов капиллярной крови небеременных женщин до (абсолютный контроль, АК) и после их 30-120-секундной экспозиции (фракции Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120) в дистиллированной воде (ДВ) с 2,5 мМ СаС12 (экспозиционный контроль, ЭК) или в ДВ совместно с адренергическими веществами (Оадр+в-во), включая адреналин (10-6 г/мл, Адр), ницерголин (10-6 г/мл, Ниц), атенолол (10-6 г/мл, Ат) и обзидан (10-5 г/мл, Обз)
о к £ о ¡Г и Число эритроцитов
АК ЭК Оадр.+в-во
& & й и щ и в 1 л (х 1012) ДВ + 2,5 мМ СаС12 ДВ + 2,5 мМ СаС12 + адренергическое вещество
< в 1 л (х 1012) в % к АК в 1 л (х 1012) в % к АК в % к ЭК
30-секундная экспозиция (Ф30), п = 10▲
Адр 3,84 ± 0,12 2,96 ± 0,23* 77,8 ± 7,0* 2,91 ± 0,26* 78,2 ± 7,5* 99,4 ± 6,5
Адр + Ниц 4,28 ± 0,10 3,44 ± 0,13* 80,2 ± 3,0* 3,19 ± 0,16* 74,6 ± 3,9* 92,7 ± 2,3
Адр + Ниц + Ат 3,83 ± 0,14 2,69 ± 0,9* 70,9 ± 3,4* 2,30 ± 0,17* 59,4 ± 4,0*# 86,3 ± 5,8#
Адр + Обз 4,05 ± 0,25 2,97 ± 0,16* 76,0 ± 6,0* 3,35 ± 0,22* 84,7 ± 6,6*# 113,2 ± 6,5#
45-секундная экспозиция (Ф45), п = 10к
Адр 3,84 ± 0,12 2,12 ± 0,18* 56,1 ± 5,8* 2,32 ± 0,32* 62,7 ± 10,1* 111,8 ± 15,8
Адр + Ниц 4,28 ± 0,10 2,55 ± 0,18* 60,0 ± 4,9* 2,38 ± 0,17* 56,0 ± 4,4* 94,9 ± 2,6
Адр + Ниц + Ат 3,83 ± 0,14 2,12 ± 0,16* 56,3 ± 5,1* 1,65 ± 0,15* 43,4 ± 3,7* 77,8 ± 6,2#
Адр + Обз 4,05 ± 0,25 2,36 ± 0,20* 58,7 ± 4,9* 2,76 ± 0,24* 69,9 ± 8,1* # 121,4 ± 10,5#
60-секундная экспозиция (Ф60), п = 10к
Адр 3,84 ± 0,12 1,60 ± 0,23* 41,9 ± 6,4* 1,94 ± 0,31* 53,1 ± 9,6* 119,0 ± 11,4
Адр + Ниц 4,28 ± 0,10 2,03 ± 0,13* 47,8 ± 3,9* 1,81 ± 0,15* 42,4 ± 3,9* 89,1 ± 4,1#
Адр + Ниц + Ат 3,83 ± 0,14 1,45 ± 0,15* 37,9 ± 3,9* 1,42 ± 0,17* 36,9 ± 3,7* 92,0 ± 5,5
Адр + Обз 4,05 ± 0,25 1,94 ± 0,18* 48,4 ± 4,4* 2,37 ± 0,23* 59,6 ± 5,8*# 122,0 ± 7,1#
90-секундная экспозиция (Ф90), п = 10к
Адр 3,84 ± 0,12 0,53 ± 0,12* 13,9 ± 3,4* 1,19 ± 0,30* 32,2 ± 8,9* 125,2 ± 8,5#
Адр + Ниц 4,28 ± 0,10 8,9 ± 0,20* 21,1 ± 4,8* 0,79 ± 0,15* 18,8 ± 3,8* 95,7 ± 4,4
Адр + Ниц + Ат 3,83 ± 0,14 0,74 ± 0,16* 18,6 ± 3,9* 0,46 ± 0,09* 18,4 ± 6,7* 69,2 ± 6,5# А
Адр + Обз 4,05 ± 0,25 0,88 ± 0,16* 22,1 ± 4,5* 1,08 ± 0,23* 26,8 ± 6,3* 126,6 ± 13,8
120-секундная экспозиция (Ф120), п = 10А
Адр 3,84 ± 0,12 0,05 ± 0,02* 1,4 ± 0,4* 0,13 ± 0,07* 3,6 ± 2,4* 223,0 ± 128,7
Адр + Ниц 4,28 ± 0,10 5,2 ± 0,16* 12,1 ± 3,7* 0,49 ± 0,18* 11,7 ± 4,3* 101,2 ± 9,3
Адр + Ниц + Ат 3,83 ± 0,14 0,31 ± 0,11* 7,9 ± 2,9* 0,16 ± 0,06* 4,3±1,5*# 44,4 ± 7,0#
Адр + Обз 4,05 ± 0,25 0,48 ± 0,12* 12,0 ± 3,4* 0,57 ± 0,18* 14,0 ± 4,9* 113,3 ± 13,3
Примечание. ▲ — в опытах с обзиданом п = 9; символы *, # и А означают, что различие с АК (*), ЭК (#) или адреналином (А) достоверно (р < 0,05) по критерию Манна—Уитни.
Таблица 3. Число (М ± т) негемолизированных эритроцитов капиллярной крови небеременных
женщин до (абсолютный контроль, АК) и после их 30- и 60-секундной экспозиции (фракции Ф30 и Ф60) в дистиллированной воде (ДВ) с 2,5 мМ СаС12 (экспозиционный контроль, ЭК) или в ДВ совместно с адренергическими веществами (Оадр+в-во), включая адреналин (10-6 г/мл, Адр), ницерголин (10-8 г/мл, Ниц), атенолол (10-8 г/мл, Ат) и обзидан (10-8 г/мл, Обз)
о о с Число эритроцитов
к а о ¡г я в, о т АК ЭК Оадр в-во
§ и л » й э не ев л п о о л с в 1 л ДВ + 2,5 мМ СаС12 ДВ + 2,5 мМ СаС12 + адренергическое вещество
р др < и ¡Г (х 1012) в 1 л (х 1012) в % к АК в 1 л (х 1012) в % к АК в % к ЭК
30-секундная экспозиция (Ф30)
Адр 8 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 3,56 ± 0,22* 78,8 ± 6,1* 112,6 ± 8,8
Адр +Ниц 8 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 2,83 ± 0,23* 63,6 ± 3,9* 85,3 ± 6,2#а
Адр + Ат 8 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 3,11 ± 0,31* 67,8 ± 5,9* 99,2 ± 11,7
Адр + Обз 8 4,59 ± 0,21 3,23 ± 0,20* 70,5 ± 3,7* 3,42 ± 0,36 74,7 ± 7,0* 107,3 ± 10,7
60-секундная экспозиция (Ф60)
Адр 8 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 3,18 ± 0,32* 74,8 ± 8,6*# 149,7 ± 13,5#
Адр + Ниц 7 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,27 ± 0,42* 53,7 ± 12,1* 111,6 ± 12,3
Адр + Ат 9 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,26 ± 0,30* 53,0 ± 8,6* 115,9 ± 13,5
Адр + Обз 7 4,34 ± 0,32 1,98 ± 0,16* 49,7 ± 6,1* 2,49 ± 0,47* 46,4 ± 4,6* 133,1 ± 28,8
Примечание. *, # и А означают, что различие с АК (*), ЭК (#) или адреналином (А) достоверно (р < 0,05) по критерию Манна—Уитни.
Адреналин, как показано в серии 2 (см. табл. 2), в концентрации 10-6 г/мл не влиял на ОРЭ фракций Ф30, Ф45, Ф60 и Ф120 небеременных женщин (ЧНЭ в присутствии адреналина, т. е. показатель Оадр для этих фракций составил соответственно 99,4, 111,8, 119,0 и 223,0% от ЭК^. Однако адреналин достоверно (р < 0,05) повышал ОРЭ фракции Ф90 (показатель Оадр составил 125,2% от ЭК90). В серии 3 (см табл. 3) адреналин в концентрации 10-6 г/мл не влиял на ОРЭ фракции Ф30 (показатель Оадр = 112,6% от ЭК30), но повышал ОРЭ фракции Ф60 (показатель Оадр = 149,7% от ЭК60). В серии 4 (см. табл. 4), в которой исследовали влияние пяти концентраций адреналина (10-10, 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл) на ОРЭ фракции Ф45, показано, что адреналин не оказывал достоверного влияния на ОРЭ женщин в лютеиновой фазе цикла (показатель Оадр составил соответственно 94,3, 91,9, 90,5, 90,4 и 96,7% от ЭК45). А в концентрациях 10-10, 10-9 и 10-8 г/мл достоверно снижал ОРЭ женщин в фолликулярной фазе цикла (показатель Оадр составил соответственно 84,4, 87,2, 87,9 , 91,5 и 98,9% от ЭК45).
Таким образом, влияние адреналина на ОРЭ зависит от концентрации адреналина, фракции эритроцитов и уровня половых гормонов. Нам удалось обнаружить способность адреналина повышать ОРЭ в концентрации 10-6 г/мл у фракций Ф60 и Ф90 (без учета фазы цикла) или, наоборот, снижать ее, что отмечено для концентраций 10-10, 10-9 и 10-8 г/мл в отношении эритроцитов фракции Ф45 женщин в фолликулярной фазе цикла.
Таблица 4. Число (М ± т) негемолизированных эритроцитов капиллярной крови небеременных женщин, находящихся в фолликулярной или лютеиновой фазе цикла, до (абсолютный контроль, АК) и после их 45-секундной экспозиции (фракция Ф45) в дистиллированной воде (ДВ) с 2,5 мМ
СаС12 (экспозиционный контроль, ЭК) или в ДВ совместно с адренергическими веществами (Оадр+в-во), включая адреналин (1010-10-6 г/мл, Адр), ницерголин (10-6 г/мл, Ниц) и атенолол (106 г/мл, Ат)
ям о о с Число эритроцитов
й о ст я я ^ в, о н ы ЭК Оадр+в-во
тин ^ 5 я 5 н не Кд л Л » й Э к о ев & < п о о л с и ДВ + 2,5 мМ СаС12 ДВ + 2,5 мМ СаС12 + адренергическое вещество
¡Г в 1 л (х1012) в % к АК в 1 л (х1012) в % к АК в % к ЭК
Фолликулярная фаза, АК = 4,04 ± 0,19 х 1012
10-10 Адр 11 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,27 ± 0,18* 56,7 ± 4,5* 84,4 ± 4,8#
Адр+ Ниц+Ат 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,28 ± 0,15* 57,9 ± 4,5*# 85,9 ± 5,1#
10-9 Адр 11 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,33 ± 0,16* 58,9 ± 4,8* 87,2 ± 4,9#
Адр+ Ниц+Ат 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,15 ± 0,21* 55,3 ± 6,3* 82,4 ± 9,3
10-8 Адр 11 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,32 ± 0,11* 58,4 ± 3,2* 87,9 ± 4,0#
Адр+ Ниц+Ат 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,13±0,12* 53,4 ± 3,4*# 80,9 ± 4,9#
10-7 Адр 11 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,41 ± 0,10* 60,6 ± 3,4* 91,5 ± 4,5
Адр+ Ниц+Ат 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,29 ± 0,13* 57,8 ± 4,2* 87,8 ± 6,5
10-6 Адр 11 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,60 ± 0,24* 64,9 ± 5,4* 98,9 ± 9,5
Адр+ Ниц+Ат 2,66 ± 0,11* 67,1 ± 3,4* 2,16 ± 0,17* 55,2 ± 5,7*# 81,8 ± 6,5#
Лютеиновая фаза, АК=4,12 ± 0,18 х1012
10-10 Адр 10 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,65 ± 0,21* 64,5 ± 4,4* 94,3 ± 7,8
Адр+ Ниц+Ат 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,48±0,19* 61,7 ± 5,3*# 87,6 ± 4,6#
10-9 Адр 10 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,59 ± 0,19* 64,3 ± 5,5* 91,9 ± 5,9
Адр+ Ниц+Ат 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,43 ± 0,22* 60,6 ± 6,05* 85,2 ± 5,3#
10-8 Адр 10 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,57 ± 0,23* 63,9 ± 6,2* 90,5±5,6
Адр+ Ниц+Ат 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,78 ± 0,25* 68,6 ± 6,4* 97,9 ± 6,8
10-7 Адр 10 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,57 ± 0,26* 63,4 ± 6,8* 90,4 ± 7,7
Адр+ Ниц+Ат 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,48 ± 0,21* 61,4 ± 5,3* 86,7 ± 4,5#
10-6 Адр 10 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,70 ± 0,22* 64,6 ± 6,2* 96,7 ± 8,7
Адр+ Ниц+Ат 2,85 ± 0,15* 70,3 ± 3,9* 2,32 ± 0,21* 56,7 ± 4,7*# 82,1 ± 7,2 #
Примечание. Символы *, # и А означают что различие с АК (*), ЭК (#) и адреналином (А) достоверно (р < 0,05) по критерию Манна—Уитни. Различия между фазами цикла носят недостоверный характер (р > 0,05) по критерию Манна—Уитни.
Исследование влияния адреноблокаторов на ОРЭ. Как показано в серии 1 (см. табл. 1), неселективный блокатор в-АР пропранолол, или обзидан (10-8 и 10-5 г/мл), селективный блокатор ргАР атенолол (10-8 г/мл), неселективный блокатор а-АР ни-церголин (10-8 и 10-6 г/мл), а также смесь ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл) не оказывают достоверного влияния на ОР различных фракций эритроцитов небеременных женщин. Так, при действии обзидана в концентрации 10-5 г/мл на эритроциты пяти фракций (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120) число негемолизирован-ных эритроцитов, т. е. показатель Облок составил соответственно 100,7, 94,7, 111,8, 120,2 и 83,0% от ЭКЬ а при действии смеси ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл), показатель Облок составил соответственно 99,4, 97,2, 107,9, 105,2 и 119,2% от ЭК; (все указанные различия носят недостоверный характер по критерию Манна— Уитни, р > 0,05).
Таким образом, наши данные не подтвердили представление многих авторов о способности обзидана повышать ОРЭ [7] и одновременно показали, что и другие адреноблокаторы, т. е. ницерголин и атенолол, по отдельности и в смеси не влияют на ОРЭ всех фракций. Это позволило изучить способность адреналина влиять на ОРЭ на фоне блокады адренорецепторов.
Влияние пропранолола (обзидана) на способность адреналина изменять ОРЭ. Оно было исследовано в серии 2 (фракции Ф30—Ф120) и в серии 3 (фракции Ф30 и Ф60). В серии 2 показано, что адреналин (10-6 г/мл) при совместном действии с обзиданом (10-5 г/мл) достоверно (р < 0,05) повышает ОРЭ фракций Ф30, Ф45 и Ф60. Так, в опытах с эритроцитами фракции Ф30 при воздействии адреналина (10-6 г/мл) показатель Оадр составил 99,4% от ЭК30, а при воздействии адреналина совместно с об-зиданом Оадр составил 113,2% от ЭК30; аналогично, для фракции Ф45 эти значения составили соответственно 111,8 и 121,4% от ЭК45, а для фракции Ф60 — 119,0 и 122,0% от ЭК45 . Таким образом, одновременная блокада ргАР и в2-АР увеличивает способность адреналина повышать ОРЭ.
В серии 3 в опытах с эритроцитами (фракции Ф30 и Ф60) показано, что обзидан при его использовании в более низкой концентрации (10-8 г/мл) не изменяет способности адреналина повышать ОРЭ. Так, в опытах с эритроцитами фракции Ф30 при воздействии адреналина (10-6 г/мл) показатель Оадр составил 112,6% от ЭК30, а при его воздействии совместно с обзиданом (10-8 г/мл) — 107,3% от ЭК30. Для фракции Ф60 эти значения составили соответственно 149,7 и 133,1% от ЭК60.
Влияние ницерголина на способность адреналина изменять ОРЭ. Его оценивали в серии 2 (фракции Ф30—Ф120) и в серии 3 (фракции Ф30 и Ф60). В серии 2 в опытах с эритроцитами фракции Ф30 показано, что адреналин не влияет на их ОР при изолированном воздействии (показатель Оадр = 99,4% от ЭК30) и при совместном с ницер-голином воздействии (Оадр+ниц = 92,7%). Аналогичные данные получены в отношении эритроцитов фракции Ф45 и фракции Ф120. Для фракции Ф45 значения показателей Оадр и Оадр+ниц составили соответственно 111,8 и 94,9%, а для фракции Ф120 — 223,0 и 101,2%. В опытах с эритроцитами фракции Ф60 сам по себе адреналин не изменял ОРЭ (Оадр = 119,0% от ЭК60), а при совместном воздействии с ницерголином достоверно снижал ее (Оадр+ниц = 89,1% ). В опытах с эритроцитами фракции Ф90 сам по себе адреналин достоверно повышал ОРЭ (Оадр = 125,2% от ЭК90), а при совместном воздействии с ницерголином он не влиял на ОРЭ (Оадр+ниц = 95,7%). Таким образом, результаты серии 2, полученные при исследовании ОРЭ фракций Ф60 и Ф90, указывают на то, что
блокада а-АР эритроцитов ницерголином в концентрации 10-6 г/мл на фоне интакт-ных в1-АР и в2-АР уменьшает способность адреналина (10-6 г/мл) повышать ОРЭ. Косвенно это означает, что при активации а-АР ОРЭ возрастает.
В серии 3 в опытах с эритроцитами фракций Ф30 и Ф60 ницерголин даже в более низкой концентрации (10-8 г/мл), чем в серии 2, усиливал способность адреналина снижать ОРЭ. Так, в опытах с эритроцитами фракции Ф30 адреналин (10-6 г/мл) не влиял на ОРЭ (Оадр = 112,6% от ЭК30), а при совместном с ницерголином воздействии достоверно снижал ее (Оадр+ниц = 85,3% от ЭК30). В опытах с эритроцитами фракции Ф60 адреналин достоверно повышал ОРЭ (Оадр = 149,7% от ЭК60), а при совместном с ницерголином воздействии не влиял на нее (Оадр+ниц = 111,6% от ЭК60). Все это подтверждает наш вывод о том, что активация а-АР повышает ОРЭ.
Влияние атенолола на способность адреналина изменять ОРЭ. Его оценивали в серии 3 в опытах с эритроцитами фракций Ф30 и Ф60, используя атенолол лишь в низкой концентрации (10-8 г/мл). В опытах с эритроцитами фракции Ф30 установлено, что адреналин не менял ОРЭ (Оадр= 112,6%) ни самостоятельно, ни при совместном воздействии с атенололом (Оадр+блок = 99,2%). В опытах с эритроцитами фракции Ф60 сам по себе адреналин достоверно повышал ОРЭ (Оадр = 149,7% ), а при совместном с атенололом воздействии не менял ее (Оадр+блок = 115,9%). Результаты опытов с эритроцитами фракции Ф60 позволяют сделать заключение, что блокада в1-АР при интактных а-АР и в2-АР усиливает способность адреналина снижать ОРЭ. Это означает, что активация вгАР так же, как и активация а-АР, повышает ОРЭ. С учетом наших данных, что об-зидан увеличивает способность адреналина повышать ОРЭ, можно утверждать, что активация адреналином в2-АР в отличие от активации в^АР и а-АР снижает ОРЭ. Это предположение подтвердили результаты опытов по исследованию эффекта адреналина при его совместном воздействии с ницерголином и атенололом.
Влияние смеси ницерголина и атенолола на способность адреналина изменять ОРЭ. Его оценивали в серии 2 (фракции Ф30—Ф120) и в серии 4 (фракция Ф45), используя оба блокатора в концентрации 10-6 г/мл. В серии 2 в опытах с эритроцитами фракций Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120 адреналин (10-6 г/мл) сам по себе не изменял ОР эритроцитов, за исключением фракции Ф90, где он повышал ее (показатель Оадр составил соответственно 99,4, 111,8, 119,0, 125,2 и 223,0% от ЭК;). Однако на фоне смеси ницерголина и атенолола, т. е. при блокаде а-АР и вгАР, адреналин достоверно снижал ОР у эритроцитов фракций Ф30, Ф45, Ф90 и Ф120, но не повышал ОР у эритроцитов фракции Ф60 (показатель Оадр+блок для эритроцитов фракций Ф30—Ф120 составил соответственно 86,3, 77,8, 92,0, 69,2А и 44,4% ). При этом в отношении эритроцитов фракции Ф90 выявлено достоверное различие (А) с эффектом адреналина. Таким образом, результаты опытов с эритроцитами фракций Ф30, Ф45, Ф90 и Ф120 указывают на то, что блокада а-АР и в^АР при интактных в2-АР способствует снижению ОРЭ под влиянием адреналина. Это подтверждает наш вывод о том, что при активации адреналином а-АР и вгАР происходит рост ОРЭ, а при активации в2-АР — ее снижение.
В серии 4 в опытах с эритроцитами фракции Ф45 было исследовано влияние пяти концентраций адреналина (10-10, 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл), в том числе на фоне блокады а-АР и в1-АР ницерголином и атенололом на их ОР. Часть женщин находилась в фолликулярной фазе цикла, а часть — в лютеиновой.
В опытах с эритроцитами женщин в фолликулярной фазе адреналин достоверно снижал ОРЭ в концентрациях 10-10, 10-9 и 10-8 г/мл и не влиял на ОРЭ в концентрациях
10-7 и 10-6 г/мл (показатель Оадр составил соответственно 84,4, 87,2, 87,9, 91,5 и 98,9% от ЭК45). На фоне смеси ницерголина и атенолола адреналин также достоверно снижал ОРЭ в концентрациях 10-10 г/мл (Оадр+блок = 85,9% ) и в 10-8 г/мл (Оадр+блок = 80,9% ), не влияя на ОРЭ в концентрациях 10-9 г/мл (Оадр+блок = 82,4%) и 10-7 г/мл (Оадр+блок = 87,8%), но достоверно снижал ОРЭ в концентрации 10-6 г/мл (Оадр+блок = 81,8% ). Таким образом, данные, полученные в опытах с эритроцитами фракций Ф45 при использовании адреналина в концентрации 10-6 г/мл также говорят о том, что блокада а-АР и ргАР на фоне интактных в2-АР усиливает способность адреналина снижать ОРЭ.
В опытах с эритроцитами женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, сам по себе адреналин во всех исследованных концентрациях (10-10-10-6 г/мл) не влиял достоверно на ОРЭ (показатель Оадр составил соответственно 94,3, 91,9, 90,5, 90,4 и 96,7% от ЭК45). В тоже время на фоне смеси ницерголина и атенолола адреналин достоверно снижал ОРЭ во всех концентрациях, кроме концентрации, равной 10-8 г/мл (показатель Оадр+блок для адреналина в концентрациях 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл составил соответственно 87,6, 85,2, 97,9, 86,7 и 82,1% ). Таким образом, опыты с эритроцитами фракции Ф45 при использовании адреналина в концентрациях 10-10, 10-9, 10-7 и 10-6 г/мл также указывают на то, что блокада а-АР и ргАР на фоне интактных в2-АР повышает способность адреналина снижать ОРЭ. Кроме того, результаты исследований позволяют предположить, что различия между женщинами, находящимися в разных фазах цикла, в отношении изменения ОРЭ под влиянием адреналина, скорее всего, связаны с тем, что половые гормоны меняют эффективность активации а-АР и в-АР.
Обсуждение результатов исследования
Нами установлено, что исходно число эритроцитов у женщин варьировало от 3,83 до 4,59 х 1012 в 1 л крови. Это соответствует данным литературы [16] и косвенно указывает на то, что в работе были использованы эритроциты здоровых женщин.
Нами установлено, что эритроциты, помещенные в ДВ, проявляют разную осмотическую резистентность, т. е. различаются между собой по способности мембраны выдерживать внутриклеточное давление, создаваемое входящей в клетку водой. На этом основании предлагаем условно говорить, как минимум, о пяти фракциях эритроцитов (Ф30, Ф45, Ф60, Ф90 и Ф120). С учетом данных литературы о том, что ОРЭ уменьшается по мере их старения [17, 18], полагаем, что фракция Ф120, обладающая максимальной ОР — это самые «молодые» эритроциты, т. е. только что покинувшие костный мозг, а фракция Ф30, обладающая самой низкой ОР, — это самые «старые» эритроциты. Можно думать, что предложенный нами метод оценки ОРЭ, позволяющий количественно характеризовать основные фракции эритроцитов, одновременно является простым и надежным способом характеристики длительности циркуляции эритроцитов у конкретного исследуемого. Наша гипотеза о наличии различных фракций эритроцитов базируется на представлении о том, что мембрана эритроцитов содержит аквапорины типа AQP0, AQP1 и AQP3, обеспечивающие транспорт воды из среды в эритроцит и обратно [19]. Это означает, что число аквапоринов, содержащихся в поверхностной мембране эритроцита, должно определять скорость гемолиза эритроцитов в гипотонической среде. С этих позиций мы предполагаем, что по мере старения эритроцита в нем возрастает число аквапоринов, что ускоряет транспорт воды в эритроцит, т. е. снижает ОРЭ. В то же время не исключаем, что в процессе
«старения» эритроцитов помимо роста числа аквапоринов одновременно снижается и прочность поверхностной мембраны, т. е. способность выдерживать натяжение под влиянием входящей в эритроцит воды, что также проявляется в снижении ОРЭ.
Нами подтверждены данные литературы о способности адреналина изменять ОРЭ небеременных женщин — либо повышать ОРЭ [6, 11], либо снижать [4, 9, 11]. Очевидно, что эта способность связана с тем, что под влиянием адреналина или меняется число аквапоринов на мембране эритроцитов (за счет их транслокации из цитозоля в мембрану, или из мембраны в цитозоль), или меняется прочность поверхностной мембраны эритроцитов, т. е. ее устойчивость к растяжению. Каков конкретный механизм этого влияния — пока неясно. Но в любом случае можно утверждать, что способность адреналина изменять ОРЭ зависит от его взаимодействия с адренорецепторами эри-троцитарной мембраны. Прежде всего, об этом говорят впервые установленные нами данные о том, что характер влияния адреналина на ОРЭ зависит от его концентрации в среде, фракции эритроцитов и уровня в крови половых гормонов. В частности, о значении концентрации адреналина данные авторов настоящей статьи говорят о том, что в опытах с эритроцитами фракции Ф45 небеременных женщин (фолликулярная фаза цикла) адреналин в концентрациях 10-10, 10-9 и 10-8 г/мл снижает ОРЭ, а в концентрациях 10-7 и 10-6 г/мл — не влияет на нее. О значении фракций свидетельствует тот факт, что адреналин в одной и той же концентрации (10-6 г/мл) повышает ОРЭ фракций Ф60 и Ф90, снижает ОРЭ фракции Ф45 и не влияет на ОРЭ фракции Ф120. О влиянии половых гормонов на эффект адреналина свидетельствуют полученные данные о том, что адреналин в концентрациях 10-10, 10-9 г/мл и 10-8 г/мл не влияет на ОР фракции Ф45 женщин в лютеиновой фазе цикла, но снижает ОР этой же фракции, полученной от женщин в фолликулярной фазе. Наличие зависимости эффекта адреналина от его концентрации, фракции эритроцитов и уровня половых гормонов мы объясняем тем, что конечный эффект адреналина зависит от имеющихся на мембране эритроцитов адренорецепторов. Очевидно, что именно эффективность активации этих рецепторов и/или их число зависит от фракции эритроцитов и уровня половых гормонов. Доказательством участия АР в эффекте адреналина являются наши данные о влиянии адре-ноблокаторов на эффект адреналина.
Как известно, эритроциты содержат агАР, а2-АР, вгАР, в2-АР и вз-АР [1]. Наиболее вероятно, что при активации одних из них ОРЭ возрастает, а при активации других — снижается. Результаты экспериментов с адреноблокаторами подтверждают это представление и позволяют его уточнить. В частности, мы полагаем, что при активации а-АР и в1-АР ОРЭ возрастает, а при активации в2-АР она снижается. Этот вывод вытекает из результатов исследования влияния адреноблокаторов на эффект адреналина. Прежде всего, установлено, что сами по себе адреноблокаторы, в том числе обзидан (10-8 и 10-5 г/мл), ницерголин (10-8 и 10-6 г/мл), атенолол (10-8 г/мл), а также смесь ницерголина и атенолола (оба в концентрации 10-6 г/мл) не влияют на ОРЭ всех исследованных нами фракций эритроцитов (Ф30—Ф120) небеременных женщин. Это позволяет использовать их при исследовании вопроса о роли а-АР, в^АР и в2-АР в эффектах адреналина.
Здесь необходимо отметить, что в литературе давно уже обсуждается вопрос о способности пропранолола (обзидана) повышать ОРЭ [4, 7, 20]. Этот эффект про-пранолола объясняется авторами его способностью оказывать мембраностабилизиру-ющее действие. В частности, считается [20], что она обусловлена тем, что пропрано-
лол (в отличие от адреналина) уменьшает жидкостность мембраны эритроцита и по этой причине уменьшает проницаемость воды, тем самым повышает ОРЭ. Почему же в наших исследованиях пропранолол не проявлял мембраностабилизирующую активность, т. е. не повышал ОРЭ? Не исключаем, что это связано с тем, что в наших исследованиях ОРЭ оценивалась по количеству эритроцитов, оставшихся негемолизирован-ными после их экспозиции в ДВ, в то время как цитируемые выше авторы определяли ОРЭ по уровню гемоглобина, выходящего из эритроцитов при их экспозиции в гипотонической среде. Но как показали наши предварительные данные, процесс гемолиза эритроцитов и выход из них гемоглобина в гипотонической среде — это разные по скорости процессы. В целом, считаем, что наш вывод о том, что обзидан, как и другие адреноблокаторы, не влияет на ОРЭ, вполне обоснован в связи с чем эти адренергиче-ские средства были использованы при исследовании роли АР в эффектах адреналина.
Показано, что блокада вгАР и в2-АР обзиданом (10-5 г/мл) при интактных а-АР увеличивает способность адреналина (10-6 г/мл) повышать ОРЭ (установлено в опытах с эритроцитами фракций Ф30, Ф45 и Ф60). В то же время блокада вгАР атенололом (10-8 г/мл) при интактных в2-АР и а-АР усиливает способность адреналина (10-6 г/мл) снижать ОРЭ. Это установлено в опытах с эритроцитами фракции Ф60. В целом эти данные позволяют утверждать, что адреналин, активируя вгАР, повышает ОРЭ, а, активируя в2-АР, наоборот, снижает ее. Блокада а-АР ницерголином в концентрациях 10-8 г/мл (опыты с эритроцитами фракций Ф30 и Ф60) и 10-6 г/мл (опыты с эритроцитами фракций Ф60 и Ф90) на фоне интактных в^АР и в2-АР уменьшает способность адреналина (10-6 г/мл) повышать ОРЭ. Это означает, что адреналин, активируя а-АР, повышает ОРЭ. Одновременная блокада а-АР (ницерголином) и в1-АР (атенололом) на фоне интактных в2-АР также уменьшает способность адреналина повышать ОРЭ. Это установлено в опытах с эритроцитами фракций Ф30, Ф45, Ф90 и Ф120 (при воздействии адреналина в концентрации 10-6 г/мл), в опытах с эритроцитами фракции Ф45, полученных от женщин в фолликулярной фазе цикла (при воздействии адреналина в концентрации 10-6 г/мл) или от женщин в лютеиновой фазе (при воздействии адреналина в концентрациях 10-10,10-9, 10-7, 10-6 г/мл). Эти данные позволяют утверждать, что при активации в2-АР ОРЭ снижается, в то время как при активации в1-АР и, особенно, при активации а-АР ОРЭ возрастает. Как известно, популяция а-АР неоднородна — она представлена агАР и а2-АР. Однозначность результатов исследования, полученных нами в опытах с ницерголином, позволяет предположить, что повышение ОРЭ происходит при активации и агАР, и а2-АР. Однако для доказательства этого предположения, конечно, необходимы дополнительные исследования с использованием селективных блокаторов агАР и а2-АР.
Что происходит при активации а-АР и вгАР, в результате которой возрастает ОРЭ? Полагаем, что при этом снижается число аквапоринов в мембране (за счет их перехода в цитозоль) и, возможно, повышается жидкостность мембраны, т. е. ее способность выдерживать напряжение, создаваемое входящей в эритроцит водой. Очевидно, что при активации в2-АР, в результате которой ОРЭ снижается, происходят противоположные процессы.
Отметим, что попытка исследовать роль а-АР и в-АР в изменении ОР эритроцитов, помещенных в гипотонический (0,40%) раствор №С1, под влиянием адреналина была предпринята ранее А. П. Бабиным и соавторами[11]. Авторы оценивали ОР эритроцитов беременных женщин методом Л. И. Идельсона, т. е. по интенсивности выхода
гемоглобина в раствор. Они нашли, что адреналин в концентрации 10-10 г/мл повышает ОРЭ и этот эффект блокируется обзиданом (но не атенололом или ницерголином), а в концентрациях 10-8-10-5 г/мл адреналин дозозависимо снижает ОРЭ и этот эффект блокируется ницерголином. Эти данные позволили авторам сделать заключение, что активация а-АР снижает ОРЭ, а активация ß2-AP повышает ОРЭ. Таким образом, наши данные о роли а-АР, ргАР и р2-АР коренным образом отличаются от данных из работы [11]. Наиболее вероятно, что эти противоречия обусловлены использованием разных методов оценки ОРЭ.
Заключение
Необходимо отметить, что результаты наших исследований позволили предложить новый способ оценки адренореактивности разных фракций эритроцитов (Ф30—Ф120), основанный на оценке характера изменения осмотической резистентности экспонируемых в ДВ эритроцитов под влиянием адреналина (10-10-10-6 г/мл) на фоне интактных АР и в условиях одновременной блокады а-АР ницерголином и ргАР атенололом, т. е. на фоне интактных р2-АР [21]. С помощью этого метода удалось показать, что адренореак-тивность эритроцитов у женщин зависит от этапа репродуктивного процесса [14].
На основании проведенных исследований были сделаны следующие выводы.
1. Авторами предложен метод оценки осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) небеременных женщин, основанный на определении числа негемолизирован-ных эритроцитов после их экспозиции в дистиллированной воде (ДВ). Этим методом установлено, что при 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозиции эритроцитов, их число снижается соответственно до 84,6-66,8%, 70,3-56,3%, 53,9-37,9%, 30,1-13,9% и 13,6-1,4% от исходного уровня. Это позволяет говорить о фракциях эритроцитов (Ф30, Ф45—Ф120), отличающихся между собой по осмотической резистентности.
2. Добавление адреналина в экспозиционную среду в одних случаях повышает ОРЭ, а в других — снижает или не изменяет ее. Характер влияния адреналина на ОРЭ зависит от фракции эритроцитов, его концентрации и уровня половых гормонов. Например, для фракции Ф45 установлено, что способность адреналина снижать ОРЭ уменьшается с ростом концентрации адреналина и ростом содержания в крови прогестерона.
3. Обзидан усиливает способность адреналина повышать ОР эритроцитов, а атенолол, ницерголин или их смесь — снижают эту способность. Это означает, что рост ОРЭ под влиянием адреналина обусловлен активацией а-АР и, в меньшей степени, р1-АР, а снижение ОРЭ связано с активацией р2-АР.
Литература
1. Age related alterations of adrenoreceptor activity in erythrocyte membrane / Lomsadze G., Khetsuriani R., Arabuli M., Intskirveli N., Sanikidze T. // Georgian Med. News. 2011. N 195. P. 58-61.
2. Уровень специфического связывания ß-адренергических лигандов и некоторые морфофункциональ-ные свойства эритроцитов при бронхиальной астме / Жихарев С. С., Перцева М. Н., Кузнецова Л. А., Мине-ев В. Н., Яблонская В. Н., Богданова Ю. М. // Терапевтический архив.1988.Т. 60, № 3. С. 89-93.
3. Манухин Б. Н., Нестерова Л. А., Смурова Е. А. Характеристика кинетики взаимодействия ß-адренорецепторов эритроцитов крыс со специфическим б локатором пропранололом // Биологические мембраны. 1994. Т. 11, № 5. С. 489-495.
4. Соминский В. Н., Окунь К. В. Повышение осмотической резистентности эритроцитов крови под влиянием пропранолола // Лабораторное дело. 1981, № 9. С. 525-527.
5. Гусева Е. В., Дворянский С. А., Циркин В. И. ß-адренореактивность эритроцитов женщин при нормальных и осложненных родах // Акушерство и гинекология. 1998. № 4. С. 17-22.
6. Бацев Н. М. Состояние эритроцитарной системы у детей, больных бронхиальной астмой, при горноклиматическом лечении: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2002.
7. Стрюк Р. И., Длусская И. Г. Адренореактивность и сердечно-сосудистая система. М.: Медицина, 2003. 160 с.
8. Метод оценки адренореактивности организма (ß-АРМ) у беременных для прогнозирования течения родов / Адамян Л. В., Смольникова Т. Ю., Длусская И. Г., Стрюк Р. И., Ляшко Е. С., Бейлин А. Л., Мисхин С. В., Герасимов А. Н., Брагинская С. Г. // Проблемы репродукции. 2006. № 1. С. 91-97.
9. Минеев В. Н., Шпетная Е. А., Шадрина Е. Б. Мембранно-рецепторные нарушения при бронхиальной астме // Терапевтический архив. 1999. Т. 71, № 3. С. 9-13.
10. Трошкина Н. А., Циркин В. И., Дворянский С. А., Ивашкина Е. П. Оценка адренореактивности эритроцитов небеременных и беременных женщин с физиологически протекающей и осложненной гестозом беременностью // Пермский медицинский журнал. 2007. Т. 24, № 1-2. С. 140-145.
11. Изменение осмотической резистентности и адренореактивности эритроцитов у женщин при беременности / Бабин А. П., Дворянский С. А., Циркин В. И., Трошкина Н. А., Гусева Е. В., Круть И. Ю., Ко-стяев А. А. // Гемореология в микро- и макроциркуляции: матер. V Междунар. конф. Ярославль: ЯГПУ им. К. Д. Ушинского, 2005. С. 196.
12. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / под ред. В. В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. 364 с.
13. Циркин В. И., Крысова А. В., Куншин А. А. Способ оценки осмотической резистентности эритроцитов // Патент на изобретение Ru № 2419792 C1 от 07.12.2009. Описание изобретения к патенту Российской Федерации. Бюллетень № 5, 2011.
14. Кинетика гемолиза эритроцитов человека в дистиллированной воде и влияние на нее адренергиче-ских средств / Крысова А. В., Куншин А. А., Циркин В. И., Тройлова М. Е., Джалилова В. Д., Иванова Е. П., Сысуева Е. А., Торопова А. Л., Саитова О. В. // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику): матер. VII Междунар. науч. конф. Ярославль: ЯГПУ им. К. Д. Ушинского, 2009. С. 218.
15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
16. Кишкун А. А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 800 с.
17. Marks P., Johnson A. Relationship between the age of human erythrocytes and their osmotic resistance: a basis for separating young and old erythrocytes // J. Clin Invest. 1958. Vol. 37, N 1. Р. 1542-1548.
18. Кленов Р. О. Действие адреналина, цАМФ и АТФ на образование пептидов возрастными фракциями эритроцитов человека: автореф. дис. . канд. биол. наук. Уфа, 2010. 24 с
19. Automated cell-based assay for screening of aquaporin inhibitors / Mola M., Nicchia G., Svelto M., Spray D., Frigeri A. // Anal Chem. 2009. Vol. 81, N 9. Р. 8219-8229.
20. Геворкян Н. А. Состояние мембранно-рецепторного комплекса эритроцитов у больных различными клинико-патогенетическими формами первичного хронического бронхита: автореф. дис. . канд. мед. наук. СПб., 1995. 19 с.
21. Крысова А. В., Циркин В. И. Способ оценки а- и р2-адренореактивности эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адреналина и адреноблокаторов: приоритетная справка № 2011134138/17(050548) от 17.08.2011.
Статья поступила в редакцию 13 сентября 2012 г.
