CC BY
23
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2018 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 612-017.1.018
И. Л. Шаравьеваa, С. В. Гейнa,b, С. П. Тендряковаa,b
a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН, Пермь, Россия b Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ
Установлено, что более короткое, 10-минутное, охлаждение приводило к угнетению образования активных форм кислорода, в то время как модели 60 мин. и хронического охлаждения приводили к усилению выраженности респираторного взрыва в макрофагах. Динамика секреции макрофагами IL-1P на фоне используемых нами вариантов холодового стресса статистически значимо не изменялась. В то же время продукция IL-10 усиливалась независимо от длительности холодового стресса. В обоих случаях, при оценке влияния стресса как на продукцию АФК, так и на продукцию ци-токинов, эффект холодового воздействия полностью или частично отменялся введением налоксона. Концентрация кортикостерона в периферической крови мышей на фоне блокады опиатных рецепторов не изменялась.
Ключевые слова: холодовой стресс; цитокины; кортикостерон; макрофаги; хемилюминесценция.
I. L. Sharav'evaa, S. V. Geina,b, S. P. Tendryakovaa,b
a Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of PFRC of the Ural Branch of the RAS, Perm, Russian Federation b Perm State University, Perm, Russian Federation
EFFECT OF OPIATE RECEPTOR BLOCKADE ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF PERITONEAL MACROPHAGES IN ACUTE AND CHRONIC COLD STRESS
It was found that a short 10 min cold stress led to inhibition of the formation of reactive oxygen species, while a model of 60 min and chronic cold stress to an increase in the severity of the respiratory explosion in macrophages. The dynamics of IL-1 secretion did not change statistically significantly against the background of cold stress variants used by us. At the same time, production of IL-10 was enhanced irrespective of the duration of cold stress. In both cases, when assessing the effect of stress on both the products of ROS and on the production of cytokines, the effect of cold exposure was completely or partially abolished by the administration of naloxone. The concentration of corticosterone in peripheral blood of mice against the background of blockade of opiate receptors did not change.
Key words: cold stress; cytokines; corticosterone; macrophages; chemiluminescence.
Роль опиоидных пептидов в регуляции функций клеток иммунной системы при стрессе заслуживает особого внимания. Данная группа эндогенных биорегуляторных пептидов образуется в результате расщепления крупных молекул предшественников и продукт расщепления проопиомеланокортина -бета-эндорфин вместе с АКТГ секретируется при стрессе в периферическую кровь, оказывая стресс-протективное, обезболивающее и иммунорегуля-торное действие. Помимо этого, пептид продуцируется клетками иммунной системы в ответ на попадание антигена, либо в присутствии высоких концентраций провоспалительных цитокинов, обусловливая широкий спектр иммунорегуляторных и антиноцицептивных эффектов [Smith, 2008]. Концентрация бета-эндорфина в периферической кро-
ви при холодовом стрессе увеличивается [Clark, Pang, Bernardini, 1983], а соответственно, опиоид-ные пептиды могут быть важными факторами коммуникации между нервной и иммунной системами организма. Известно, что бета-эндорфин модулирует функции лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток [Гейн, Баева, 2011], а блокада опиатных рецепторов нивелирует угнетающее действие иммобилизационного стресса на пролиферацию и продукцию цитокинов сплено-цитами [Гейн, Шаравьева, 2014]. В то же время при холодовом стрессе роль опиоидной системы исследована недостаточно, в настоящее время нет единого мнения о направленности влияния низких температур на функции клеток иммунной системы, приводят ли изменения, вызванные переохлажде-
© Шаравьева И. Л., Гейн С. В., Тендрякова С. П., 2018
336
нием, к подавлению [Salman et al., 2000] или активации [Kizkai et al., 2001] иммунной системы.
Цель работы - исследовать влияние блокады опиатных рецепторов на уровень кортикостерона в плазме крови, продукцию активных форм кислорода, IL-ip, TNF-a, IL-10 перитонеальными макрофагами при остром и хроническом холодовом стрессе у мышей in vivo.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на белых мышах-самцах массой тела 20-22 г. Животные содержались в условиях лабораторного вивария, при естественном освещении, неограниченном доступе к воде и кормам. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).
Мыши подвергались острому переохлаждению при -20°С в течение 10 или 60 мин., а также длительному переохлаждению при -4°С в течение 4 ч. на протяжении 7 сут. Антагонист опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид вводили в дозе 0.2 мг/кг подкожно за 20 мин до стресса при остром переохлаждении и подкожно ежесуточно за 20 мин. до охлаждения и повторно через 3 ч. от первого введения при длительном. Все животные были разбиты на следующие группы: 1-я - контрольная, 2-я - стресс, 3-я - стресс на фоне налоксона, 4-я - введение одного налоксона. Через 1 ч. после окончания стрессорного воздействия мышей выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Плазму крови собирали и замораживали, из брюшной полости выделяли пери-тонеальные макрофаги по стандартной методике [Фримель, 1987].
Оценку продукции активных форм кислорода (АФК) перитонеальными макрофагами осуществляли с использованием реакции люминолзависи-мой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 150 мкг/мл. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол 10-5М (Sigma). Регистрация результатов проводилась в течение 1 ч. с интервалом в 5 мин. с помощью многофункционального спектрофотометра TECAN (Австрия).
Для определения продукции цитокинов перито-неальные макрофаги культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10%-ной инактивированной фетальной сыворотки, 100 ЕД/мл гентамицина, в 24-х луночных планшетах, содержащих 2.5х106 клеток на лунку. Через 24 ч. супернатанты собира-
ли в пробирки «Эппендорф», замораживали и хранили при -20°С. Определяли концентрацию цитокинов в супернатантах клеточных культур с использованием иммуноферментных тест-систем «R&D» (США). Концентрацию кортикостерона в плазме крови определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем Enzo (США).
Статистическая обработка результатов проведена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и LSD-критерия для межгруппового сравнения. Все данные на рисунках представлены в виде средней и её стандартной ошибки (M+m).
Результаты и их обсуждение
Установлено, что острое, 10-минутное, а также длительное переохлаждение в течение 7 сут. не влияло на спонтанную продукцию АФК перитоне-альными макрофагами. Острое переохлаждение мышей в течение 60 мин. усиливало спонтанную продукцию АФК по отношению к животным контрольной группы с 10- по 60-ю мин. наблюдения. Предварительное введение животным налоксона приводило к ослаблению эффекта стресса, однако с 35- по 60-ю мин. регистрации реакции показатели люминесценции в этой группе животных оставались статистически значимо выше значений по отношению к контрольной группе (данные не приводятся).
В стимулированных зимозаном культурах (рис. 1) 10-минутный холодовой стресс угнетал продукцию АФК макрофагами в первые 35 мин. наблюдений, эффект нивелировался на фоне введения налоксона. В группе животных, подвергнутых 60-минутному стрессу, напротив, наблюдалась стимуляция продукции АФК с 5 до 45 мин. наблюдения, которая отменялась на фоне введения животным налоксона. Хронический холодовой стресс в стимулированных зимозаном культурах усиливал продукцию АФК с 15- по 60-ю мин. исследования, в 3-й группе животных, на фоне блокады опиатных рецепторов отмечается усиление кислородзависи-мой микробицидности с 10- по 25-ю мин. исследования (рис. 2, Б). Таким образом, блокада опиат-ных рецепторов приводила к частичной отмене эффектов холодового стресса на продукцию АФК макрофагами.
Как острое, так и хроническое переохлаждение не оказывало значимого влияния на продукцию IL-1Р (данные не приводятся). Продукция макрофагами IL-10 в условиях острого холодового стресса усиливалась независимо от продолжительности холодового воздействия, в условиях стимуляции и без неё, и отменялась на фоне блокады опиатных рецепторов (рис. 2). Хронический холодовой стресс в спонтанных пробах усиливал продукцию IL-10, которая нивелировалась введением животным налоксона. В зимозан-индуцированных культурах статистически значимое стимулирующее
действие длительного пререохлаждения на синтез ГЬ-10 зарегистрировано только в группе животных, подвергнутых стрессу на фоне налоксона. У животных, получавших один стресс, наблюдалась лишь тенденция к усилению продукции ГЬ-10 стимулированными макрофагами.
А
120 100 80
* * * ^^Контроль Стресс ^^Стресс+нал ^^Налоксон
/ ч / V__* ? —*
*
* * —*
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин
стерона в плазме крови экспериментальных животных значительно возрастала, однако предварительное введение мышам налоксона на уровень кортикостерона в периферической крови влияния не оказывало.
А
спонтанные
12 3 1
стимул преданные
[ : з а
1200
1000
600 400
* * -□-Стресс ^^Стресс+нал < Налоксон
* /
/ ^ч*
у,/ \* /
///
спонтанные
ст[|ыул]1рованные
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин
В
0 5 [0 15 20 25 30 40 4? 50 60
В]>ГМЯ, НИН
Рис. 1. Влияние 10 мин. (А), 60 мин. (Б) и хронического (В) холодового стресса на зимозан-стимулированную продукцию АФК перитонеальными макрофагами мыши в условиях блокады опиатных рецепторов.
*-р<0.05 к контролю, (п=9)
В дальнейшем мы оценивали роль блокады опиатных рецепторов в регуляции продукции кор-тикостерона при холодовом стрессе (данные не приводятся). Как в условиях острого, так и хронического переохлаждения, концентрация кортико-
12 3 1
В
спонтанные
[ : з -I
ст[|ыул]1рованные
Рис. 2. Влияние 10 мин. (А), 60 мин. (Б) и хронического (В) холодового стресса на продукцию ГЬ-10 перитонеальными макрофагами в условиях блокады опиатных рецепторов. По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - стресс, 3 - стресс + налоксон, 4 - налоксон. По оси ординат концентрация ГЬ-10 (пг/мл). *-р<0,05 к контролю, (п=8)
Таким образом, направленность действия острого холодового стресса на функции макрофагов зависела как от исследуемого параметра, так и от
0
Б
Б
0
0
времени воздействия, при этом блокада опиатных рецепторов существенно модифицировала имму-норегуляторные эффекты острого переохлаждения. Так, более короткое, 10-минутное, охлаждение приводило к угнетению образования активных форм кислорода, в то время как модель 60 мин. и хронического охлаждения приводили к усилению выраженности респираторного взрыва в макрофагах. Динамика секреции макрофагами IL-1 ß на фоне используемых нами вариантов холодового стресса статистически значимо не изменялась. По-видимому, эффект, оказываемый холодовым стрессом на продукцию IL-1 ß, сильно зависит от времени экспозиции и температуры воздействия [Zhu et al., 1996; Tringali et al.; 2000; Kizkai et al., 2001; Zhang et al., 2015]. Очевидно, что модели холодового стресса с более низкими температурами и коротким периодом экспозиции, как и использованные нами в настоящей работе, к статистически значимым изменениям продукции IL-1 ß не приводят. В то же время продукция IL-10 усиливалась независимо от длительности холодового стресса. В обоих случаях, при оценке влияния стресса как на продукцию АФК, так и на продукцию цитокинов, эффект холодового воздействия полностью или частично отменялся введением на-локсона, что говорит о прямом участии эндогенных опиоидов в регуляции функций макрофагов при переохлаждении, независимо от направленности иммунорегуляторного действия стресса. Прямое действие эндогенных опиоидов на функциональную активность клеток иммунной системы при холодовом стрессе подтверждается фактом отсутствия влияния блокады опиатных рецепторов на уровень кортикостерона.
Работа поддержана грантом AAAA-A18-118030790046-9.
Библиографический список
Гейн С.В., Баева Т.А. Эндогенные опиоидные пептиды в регуляции функций клеток врождeнного иммунитета // Биохимия. 2011. Т. 76, № 3. C. 379-390.
Гейн С.В., Шаравьева И.Л. Влияние ротационного и иммобилизационного стресса на продукцию IL-1, IL-2, IL-4 и IFN-gamma спленоцитами в условиях блокады опиатных рецепторов in vivo // Доклады Академии наук. 2014. Т. 454, № 4. С. 485-487.
Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 472 с. Clark W.G., Pang I.H., Bernardini G.L. Evidence against involvement of beta-endorphin in thermoregulation in the cat // Pharmacol Biochem Behav. 1983. Vol. 18, № 5. P 741-745. Kizkai T. et al. Activation and Apoptosis of Murine Peritoneal Macrophages by Acute Cold Stress //
Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. Vol. 283, № 3. P. 700-706.
Salman H. et al. Hypothermia affects the phagocytic activity of rat peritoneal macrophages // Acta Physiol. Scand. 2000. Vol. 68, № 3. P. 431-436.
Smith E.M. Neuropeptides as signal molecules in common with leukocytes and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis // Brain, Behav. Immun. 2008. Vol. 22, № l.P. 3-14.
Tringali G. et al. Circulating interleukin-1-beta levels after acute and prolonged exposure to low temperatures: human and rat studies // Neuroimmu-nomodulation. 2000. Vol. 7, № 4. P. 177-181.
Zhang Z. et al. Acute cold stress improved the transcription of pro-inflammatory cytokines of Chinese soft-shelled turtle against Aeromonas hydro-phila // Dev. Comp. Immunol. 2015. Vol. 49, № 1. P. 127-137.
Zhu G.F. et al. Endogenous substance P mediates cold water stress-induced increase in interleukin-6 secretion from peritoneal macrophages // J. Neuro-sci. 1996. Vol. 16, № 11. P. 3745-3752.
References
Gein S.V., Baeva T.A. [Endogenous opioip peptides in regulation of innate immunity cell functions] // Biochemistry. V. 76. N 3 (2011): pp. 379-390. (In Russ.).
Gein S.V., Sharav'eva I.L. [Effect of rotational and immobilization stress on the production of IL-1, IL-2. IL-4, and IFN-gamma by splenocytes in conditions of blockade of opiate receptors in vivo.]. Reports of the Academy of Sciences. 2014, N 454(4), pp. 485-487.
Friemel, H., ed. Immunologiceskie metody [Immunologische Arbeitsmethoden]. Translated by A.P. Tarasova Moskow, Medicina Publ., 1987. 472 p. (In Russ.).
Clark W.G., Pang I.H. Bernardini G.L. Evidence against involvement of beta-endorphin in thermoregulation in the cat, Pharmacol Biochem Behav. V. 18, N. 5 (1983): pp. 741-745.
Kizkai T., Suzuki K., Hitomi Y., Iwabuchi K., Onoe K., Ishida H., Izawa T., Ji. L. L. Ohno H. Activation and Apoptosis of Murine Peritoneal Macrophages by Acute Cold Stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. V. 283, N. 3 (2001): pp. 700-706.
Salman H., Bergman M., Bessler H., Alexandrova S., Beilin B., Djaldetti M. Hypothermia affects the phagocytic activity of rat peritoneal macrophages. Acta Physiol Scand. V. 68, N 3 (2000): pp. 431-436.
Smith E.M. Neuropeptides as signal molecules in common with leukocytes and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Brain, Behav. Immun. V. 22, N. 1 (2008): pp. 3-14.
Tringali G., Farrace S., Ragazzoni E., Dello Russo C., Piscitelli R., Preziosi P., Navarra P. Circulat-
ing interleukin-1-beta levels after acute and prolonged exposure to low temperatures: human and rat studies. Neuroimmunomodulation. V. 7, N. 4 (2000): pp. 177-181.
Zhang Z, Chen B, Yuan L, Niu C. Acute cold stress improved the transcription of pro-inflammatory cytokines of Chinese soft-shelled turtle against Aeromonas hydrophila. Dev Comp Immunol. V. 49, N. 1 (2015): pp. 127-137.
Zhu G.F., Chancellor-Freeland C., Berman A.S., Kage R., Leeman S.E., Beller D.I., Black P.F. Endogenous substance P mediates cold water stress-induced increase in interleukin-6 secretion from peritoneal macrophages. J. Neurosci. V. 16, N. 11 (1996): pp. 3745-3752.
Поступила в редакцию 04.09.2018
Об авторах
Шаравьева Ирина Леонидовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» ORCID: 0000-0002-3881-7943 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Гейн Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, зам. директора по научной работе
Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»» ORCID: 0000-0002-0799-3397 614081, Пермь, ул. Голева, 13; gein@iegm.ru; (342) 2108759
профессор кафедры микробиологии и иммунологии
ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Тендрякова Светлана Петровна, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии Филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13
доцент кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
About the authors
Sharav'eva Irina Leonidovna, candidate of biology,
recercher of the laboratory of biochemistry of
development of microorganisms
«Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms
UB RAS» - a branch of the FSBIS of the Perm Federal
Research Center of the UB RAS.
ORCID: 0000-0002-3881-7943
13, Golev str., Perm, Russia, 614081
Gein Sergey Vladimirovich, doctor of medicine, professor, deputy director for research «Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS» - a branch of the FSBIS of the Perm Federal Research Center of the UB RAS. ORCID: 0000-0002-0799-3397 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; gein@iegm.ru; (342) 2108759
professor of Department of microbiology and
immunology
Perm State University.
15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Tendryakova Svetlana Petrovna candidate of chemistry, senior recercher of the laboratory of ecological immunology
«Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS» - a branch of the FSBIS of the Perm Federal Research Center of the UB RAS. 13, Goleva str., Perm, Russia, 614081
associate professor of the Department of microbiology and immunology Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Информация для цитирования:
Шаравьева И.Л., Гейн С.В., Тендрякова С.П. Влияние блокады опиатных рецепторов на функциональную активность перитонеальных макрофагов в условиях острого и хронического переохлаждения // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2018. Вып. 3. С. 336-340. DOI: 10.17072/1994-99522018-3-336-340.
Sharav'eva I.L., Gein S.V., Tendryakova S.P. [Effect of opiate receptor blockade on the functional activity of peritoneal macrophages in acute and chronic cold stress]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 3 (2018): pp. 336-340. (In Russ.). DOI: 10.17072/1994-9952-2018-3-336-340.
