CC BY
19
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
среды. Хорошо известно, что переохлаждение вызывает характерный для любого стресса гормональный сдвиг, ухудшает двигательные и когнитивные функции, модулирует продукцию IL-ip, TNFa, IL-6, IL-10. Роль опио-идных пептидов в регуляции функций клеток иммунной системы при стрессе заслуживает особого внимания, поскольку секретируемые при стрессе в периферическую кровь опиоидные пептиды, оказывают стресс-протективный, обезболивающий и иммунорегулятор-ный эффекты.
Цель и задачи. Исследовать влияние блокады опиат-ных рецепторов на уровень кортикостерона в плазме крови, продукцию активных форм кислорода, IL-ip, TNFa, IL-10 перитонеальными макрофагами при остром холо-довом стрессе у мышей in vivo.
Материалы и методы. Эксперимент выполнен на белых мышах самцах массой тела 20-22 г. Мыши подвергались острому переохлаждению при -20 °С в течение 10 или 60 минут. Антагонист опиатных рецепторов налок-сона гидрохлорид вводили в дозе 0,2 мг/кг подкожно за 20 мин до стресса. Через 1 час после окончания стрес-сорного воздействия мышей выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Оценку продукции активных форм кислорода перитонеальными макрофагами осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции. Для определения продукции цитокинов перитонеальные макрофаги культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки, 100 ЕД/мл гентамицина, в 24-луночных планшетах, содержащих 2,5 х 106 клеток на лунку. Через 24 часа супернатанты собирали в пробирки «Эппендорф», замораживали и хранили при -20 °С. Определение концентрации цитокинов в супернатантах клеточных культур проводили с использованием иммуноферментных тест-систем R&D (США). Концентрацию кортикосте-рона в плазме крови определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем Enzo (США). Статистическая обработка результатов проведена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и LSD-критерия для межгруппового сравнения. Все данные на рисунках представлены в виде средней и ее стандартной ошибки.
Результаты. Установлено, что экспозиция мышей при -20 °С в течение 10 мин приводила к угнетению продукции АФК макрофагами, эффект нивелировался на фоне введения налоксона. В группе животных, подвергнутых 60 мин стрессу, напротив, наблюдалась налоксон-зависимая стимуляция продукции АФК. Оба варианта холодового стресса не оказывали значимого влияния на продукцию IL-ф. Продукция TNFa на фоне 60 мин охлаждения налоксон-зависимо стимулировалась как в спонтанных, так и в зимозан-сти-мулированных культурах. Продукция макрофагами IL-10 усиливалась независимо от продолжительности холодового воздействия, в условиях стимуляции и без нее, и отменялась на фоне блокады опиатных рецепторов.
Заключение. Таким образом, направленность действия острого холодового стресса на функции макрофагов зависела как от исследуемого параметра, так и времени воздействия, при этом блокада опиатных рецепторов существенно модифицировала иммунорегуляторные эффекты переохлаждения.
Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-96002-р-а.
ВЛИЯНИЕ СИСТЕМНОЙ БЛОКИРОВКИ TNF НА РОСТ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ MCA 205 ФИБРОСАРКОМЫ IN VIVO
Гоголева В.С.1, 2, Атретханы К.-С. Н.1, 2,
Носенко М.А.1, 2, Недоспасов С.А.1, 2 3, Друцкая М.С.1, 2
1ФГБУН«Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва, Россия
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Фактор некроза опухолей (TNF) — цитокин с широким спектром действия, выполняющий важную роль в иммунной регуляции и воспалении. На данный момент блокаторы TNF широко применяются в терапии аутоиммунных заболеваний (Drutskaya M.S. et al., 2010). Роль TNF в развитии опухолей неоднозначна (Balkwill F., 2009). Одной из функций TNF в опухолевом микроокружении является поддержание метастазирования. При этом 90% случаев смерти онкологических больных связано именно с возникновением метастазов, а не первичной опухолью (Lambert A.W et al., 2017). Изучение роли TNF в метастазировании актуально не только с точки зрения понимания молекулярных механизмов метастатического каскада, но может также иметь клиническое значение.
Цель. Исследование роста и метастазирования перевиваемой опухолевой линии МСА 205 фибросаркомы у мышей на фоне системной анти-TNF терапии.
Работу проводили на гуманизированных по TNF мышах, которым каждые три дня вводили блокаторы TNF инфликсимаб или этанерцепт, а контрольной группе — PBS. Опухолевые клетки МСА 205 фибросаркомы вводили через неделю после начала применения блокаторов TNF. Объем опухоли измеряли каждые 3-5 дней. В конце эксперимента проводили анализ различных популяций спленоцитов методом проточной цитофлуориметрии, оценивали уровень экспрессии генов в опухоли методом ПЦР в реальном времени, осуществляли иммуногистохи-мический анализ опухолевых образцов, а также изучали развитие миелоидных клеток in vitro на фоне нейтрализации TNF.
В ходе данной работы было обнаружено, что фармакологическая блокировка TNF приводит к замедлению роста опухолей у самок, что коррелирует с уменьшением накопления миелоидных супрессорных клеток, обладающих проопухолевой активностью (Atretkhany K.S. et al., 2016). Кроме того, мы обнаружили, что нейтрализация TNF влияет на развитие миелоидных клеток: при дифференцировке in vitro в присутствии блокаторов TNF моноцитарная популяция незрелых миелоидных клеток в большей степени подвержена клеточной смерти. Системная нейтрализация TNF у самцов не влияла на первичный рост опухоли, но на более позднем этапе предотвращала возникновение метастазов. При нейтрализации TNF происходило понижение экспрессии анги-огенных и супрессорных белков, таких как Hif1a, Vegfa, Fgf2 и Icam1, в опухолевых образцах. Иммуногистохими-ческий анализ показал, что нейтрализация TNF может приводить к подавлению ангиогенеза.
Таким образом, мы обнаружили, что TNF необходим для роста перевиваемой опухолевой линии MCA 205 фи-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
бросаркомы in vivo. Кроме того, TNF способствует выживанию миелоидных клеток, а также играет важную роль в ангиогенезе и метастазировании.
Работа была осуществлена при поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ НШ-10014.2016.4
ДЕФИЦИТ АРГИНИНА, ВЫЗВАННЫЙ АКТИВНОСТЬЮ СТРЕПТОКОККОВОЙ АРГИНИНДЕИМИНАЗЫ, СНИЖАЕТ ПРОДУКЦИЮ МАКРОФАГАМИ ОКСИДА АЗОТА
Головин А.С.1, Бурова Л.А.1, Соколов А.В.1, 2, Старикова Э.А.1, Фрейдлин И.С.1, 2' 3
1ФГБНУ«Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Ключевым компонентом врожденного иммунитета, контролирующим агрессию патогенных стрептококков (Streptococcus pyogenes) в организме, являются макрофаги. Одним из механизмов антибактериальной активности этих клеток служит продукция оксида азота (NO). Продукция оксида азота макрофагам опосредована ферментом NO-синтазой II, субстратом которого является аргинин. NO является важной внутри и межклеточной сигнальной молекулой, регулирующей пролиферацию и дифференцировку клеток адаптивного иммунитета, а также, обладает бактерицидной активностью. Аргинин используется в качестве субстрата бактериальным ферментом аргининдеиминазой (АД), который продуцирует S. pyogenes. Дефицит аргинина, вызванный действием ар-гининдеиминазы S. pyogenes, может приводить к дизрегу-ляции воспаления и нарушению формирования адекватного иммунного ответа.
Цель. Оценить влияние стрептококковой АД на продукцию NO макрофагами линии J774.
Материалы и методы. Эксперименты проводили на модельной системе мышиных макрофагов перевиваемой линии J774. В работе использовали супернатанты разрушенных ультразвуком S. pyogenes M49-16 и его изоген-ного мутанта с делецией гена АД M49-16delAD (любезно предоставлены проф. Суворовым А.Н., отдел молекулярной микробиологии, ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург), содержащие биологически активные внутриклеточные компоненты бактерий. Клетки линии J774 вносили в планшет и добавляли в лунки супернатанты разрушенных стрептококков исходного или мутантного штамма. Для индукции синтеза NO в лунки планшета вносили ЛПС. В некоторые лунки вносили аргинин дополнительно. После 24 часов инкубации измеряли концентрацию оксида азота в надосадке с помощью реактива Грисса. Количество аргинина в экспериментальных пробах определяли с помощью модифицированной реакции Сукагуши.
Результаты. Предварительно проводили подбор концентрации супернатанта M49-16, в которой он обладал максимальной способностью гидролизовать аргинин. Для этого оценивали количество аргинина в экспериментальных пробах после инкубации с различными разведениями супернатанта исходного штамма. Для дальнейшей работы было выбрано оптимальное разведение супер-натантов разрушенных стрептококков 1 мкл/100 мкл культуральной среды. В этом разведении наблюдалось
достоверное снижение количества аргинина в экспериментальных пробах, содержащих супернатант исходного штамма (p < 0,001). Количество аргинина в пробах с су-пернатантом штамма M49-16delAD достоверно не снижалось. Исследование показало, что супернатант S. pyogenes M49-16 достоверно подавлял индуцированную ЛПС продукцию NO клетками линии J774 (p < 0,0001). При этом продукция NO в присутствии супернатанта S. pyogenes M49-16delAD не изменялась. Добавление аргинина приводило к трехкратному увеличению продукции NO клетками линии J774, инкубированными в присутствии су-пернатанта исходного штамма (p < 0,0001). Продукция NO клетками, инкубированными в присутствии суперна-танта M49-16delAD, при добавлении аргинина достоверно не отличалась от контрольного уровня.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о способности стрептококковой АД приводить к снижению продукции NO клетками линии J774 за счет депле-ции аргинина в культуральной среде.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-04-00150.
ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ МАКРОФАГОВ ПЕЧЕНИ НА ДЕЙСТВИЕ ВОДОРАСТВОРИМОГО СОЕДИНЕНИЯ КРЕМНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Гордова В.С., Григорьева Е.А., Сергеева В.Е., Смородченко А.Т.
ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия Институт вегетативной анатомии, клиника Шарите, университет Гумбольдта, Берлин, Германия
Макрофаги печени — особая популяция резидентных макрофагов, которым в последнее время, в связи с изучением иммунных функций печени, уделяется большое внимание. Нами уже было изучено влияние длительного поступления в организм с питьевой водой соединения кремния на макрофаги тимуса, селезенки, лимфоидных узелков тонкого кишечника и прилежащих к ним кишечных ворсинок и показано, что макрофаги уменьшаются в размерах, в них меняется содержание нейромедиатор-ных биогенных аминов, на их цитоплазме увеличивается экспрессия MHC II. Однако вопрос, является ли действие кремния, поступающего с питьевой водой идентичным для всех популяций макрофагов, остается открытым.
Цель. Изучение макрофагов печени лабораторных крыс на длительном сроке поступления в организм водорастворимого соединения кремния.
Материалы и методы. Изучали печень 10 нелинейных крыс-самцов. Контрольная группа (5 крыс), получала ad libitum стандартизованную питьевую воду, подопытная (5 крыс), получала ad libitum ту же воду с добавлением де-вятиводного метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. Через девять месяцев животные были выведены из эксперимента, макрофаги в парафиновых срезах печени выявляли непрямым иммуногисто-химическим методом. Первичные антитела — мышиные антитела против CD68 (clon ED1, Abcam, Cambrige, UK), вторичные антитела — меченные биотилином козьи антитела (Vector Laboratories, U.S.). Для визуализации позитивного окрашивания срезы инкубировались с авидин-биотиновым комплексом и диамино-бензидином (Vector Laboratories, U.S.). Изучали макрофаги в десяти полях зрения (х400, х900), о степени экспрессии CD68 судили
