CC BY
18DOI: 10.17516/1998-2836-0293 УДК 544.77.052.5
Effect of the Biosorbent "Unisorb-Bio" with Immobilized Microflora of the Genera Bacillus and Trichoderma on Soil Restoration Under Conditions of Oil Pollution
Olga S. Fedorova, Polina N. Bondar and Tat'iana V. Riazanova*
Siberian State University of Science and Technology named after Academician M. F. Reshetnev Krasnoyarsk, Russian Federation
Received 19.10.2021, received in revised form 18.04.2022, accepted 21.04.2022
Abstract. The article uses the example of artificially polluted soil to consider the effect of a urea sorbent - biological product "Unisorb-Bio" with an immobilized mixed culture of Bacillus bacteria and Trichoderma micromycetes on the biodegradation of oil, followed by phyto-control of the soil with a test culture of cress-salad.
It was shown that during 9 weeks of exposure of "Unisorb-Bio" with immobilized oil-oxidizing strains, the oil content in the soil decreased by 10 times, which is 5 times higher compared to the control. The low level of soil toxicity after processing it with "Unisorb-Bio" is indicated by the results of the test control, which showed that the sowing quality (germination energy, seed germination) of cress-salad is 72.5 %. The observed sowing qualities and morphophysiological indicators give grounds to conclude that the biological product "Unisorb-Bio" with immobilized microflora is able to restore the soil even with a high level of initial contamination.
Keywords: oil, soil, oil pollution, biological product "Unisorb-Bio", bioremediation, phytocontrol, cress-salad (Lepidium sativum).
Citation: Fedorova, O.S., Bondar, P.N. and Riazanova, T. V. Effect of the biosorbent "Unisorb-Bio" with immobilized microflora of the genera Bacillus and Trichoderma on soil restoration under conditions of oil pollution. J. Sib. Fed. Univ. Chem., 2022, 15(2), 289-297. DOI: 10.17516/1998-2836-0293
© Siberian Federal University. All rights reserved
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0). Corresponding author E-mail address: tatyana-htd09@mail.ru
*
Влияние биосорбента «Унисорб-Био» с иммобилизованной микрофлорой родов Bacillus и Trichoderma на восстановление почвы в условиях нефтяного загрязнения
О. С. Федорова, П. Н. Бондарь, Т. В. Рязанова
Сибирский государственный университет науки и технологий
имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, Красноярск
Аннотация. В статье на примере искусственно загрязненной почвы рассмотрено влияние карбамидного сорбента - биопрепарата «Унисорб-Био» с иммобилизованной смешанной культурой бактерий рода ВacШus и микромицетов рода Trichoderma на биодеструкцию нефти с последующим фитоконтролем почвы тест-культурой кресс-салата.
Показано, что за девять недель экспонирования «Унисорб-Био» с иммобилизованными нефтеокисляющими штаммами содержание нефти в почве снизилось в 10 раз, что в 5 раз выше по сравнению с контролем. О низком уровне токсичности почвы после обработки ее «Унисорб-Био» свидетельствуют результаты тест-контроля, которые показали, что посевные качества (энергия прорастания, всхожесть семян) у кресс-салата составляют 72,5 %. Наблюдаемые посевные качества и морфофизиологические показатели дают основание сделать вывод о том, что биопрепарат «Унисорб-Био» с иммобилизованной микрофлорой способен восстановить почву даже с высоким уровнем начального загрязнения.
Ключевые слова: нефть, почва, загрязнение нефтью, биопрепарат «Унисорб-Био», биоремедиация, фитоконтроль, кресс-салат.
Цитирование: Федорова, О. С. Влияние биосорбента «Унисорб-Био» с иммобилизованной микрофлорой родов ВасШш и Trichoderma на восстановление почвы в условиях нефтяного загрязнения / О. С. Федорова, П. Н. Бондарь, Т. В. Рязанова // Журн. Сиб. федер. ун-та. Химия, 2022, 15(2). С. 289-297. DOI: 10.17516/1998-2836-0293
В настоящее время нефть - основной источник получения энергии человеком, но добыча и переработка нефти приводят к загрязнению окружающей среды. Для решения проблемы загрязнения природной среды, особенно почвы, нефтепродуктами могут применяться различные физические, физико-химические, химические и биотехнологические методы. Наиболее перспективным и безопасным принципом ликвидации нефтезагрязнений является как биодеградация с использованием интродуцированной нефтеокисляющей микрофлоры, так и интенсификация процессов естественного очищения почв и воды. Использование аборигенных, адаптированных или отобранных консорциумов микроорганизмов для биоремедиации может быть эффективным подходом, поскольку большинство химических соединений нефти и нефтепродуктов биодеградируемы, а микроорганизмы-деструкторы весьма разнообразны и широко распространены [1-4].
Происходящее в результате загрязнения почвы нарушение в ней воздушного режима, усиление деятельности анаэробных микроорганизмов, а также изменение водного баланса в системе «почва - растение» и образование токсичных продуктов окисления углеводородов приводят к подавлению роста растений, появлению у них морфологических и физиологических изменений, которые служат индикаторными признаками нефтяного загрязнения [5-7].
Для устранения последствий негативного влияния нефтегенных веществ на почву разработан широкий спектр методов, которые отличаются по способу деструкции нефтепродуктов, аппаратурному оформлению, длительности и эффективности процесса и экономическим затратам. Одной из распространенных технологий, которая практически применяется при всех способах очистки нефтезагрязненных почв, является биоремедиация, эффективность и длительность которой зависят от уровня начального загрязнения, применяемых методов сбора и ликвидации загрязнений, климатических условий и других факторов, вследствие чего интенсификация данного процесса представляет важную экологическую и технологическую задачу [8-11].
Установлено, что для биологической очистки нефтезагрязненных почв значительному ускорению разложения нефтепродуктов способствует применение штаммов нефтеразруша-ющих микроорганизмов, которые всегда есть в микробиоценозе. Однако их рост при избытке содержания углерода лимитируется недостатком кислорода, азота и фосфора, что требует первоначального анализа состава почв и загрязнителя, периодического внесения из вне недостающих источников биогенных элементов, а также стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечение доступности кислорода и воды, что усложняет технологию очистки от нефтяного загрязнения и значительно удорожает данный процесс.
Одни из главных и приоритетных направлений в области охраны окружающей среды и рационального природопользования - разработка и внедрение инновационных технологий восстановления почв методом биоремедиации.
Экспериментально установлено, что в почве, загрязненной нефтепродуктами в концентрации менее 1 %, накапливается разнообразное сообщество углеводородокисляющей микрофлоры, которое обеспечивает ее самоочищение. В этом случае экономически преимущественны биотехнологические разработки на основе стимуляции процессов жизнедеятельности аборигенной микрофлоры, внесение лимитирующих компонентов среды и создание условий для интенсификации процессов биоокисления в условиях in situ. Но при интенсивном загрязнении почвы (свыше 5 %) нефтепродукты ингибируют ферментативные активности практически всех микроорганизмов. В этом случае перспективным может быть применение сорбентов и биопрепаратов, в частности «Унисорб-Био» - карбамидного сорбента типа «Унисорб» с иммобилизованной аборигенной микрофлорой, обладающего комбинированным действием: сбор, сорбция нефти, перевод ее из объемного в пленочное состояние, наличие в составе биогенных компонентов (углерод, азот, фосфор, микроэлементы) и биоокисление углеводородов in situ с участием привнесенной микрофлоры и активированной аборигенной.
Иммобилизация микрофлоры на пористом материале, помимо закрепления микроорганизмов в загрязненной экосистеме, способствует повышению ферментативной активности и устойчивости их к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды и ускоряет процессы биодеградации нефтяных углеводородов [12-14]. Следует отметить еще одно важное
свойство, которое придает микрофлоре иммобилизация, - она предотвращает ее вымывание из зоны загрязнения, что значительно увеличивает эффективность биодеструкции.
Истощение ресурсов экосистемы, связанное с нефтяным загрязнением, определенным образом влияет на видовой состав растительного сообщества. Наиболее нефтетолерант-ными видами растений являются (по степени уменьшения): ежа сборная, полевица белая, тимофеевка луговая, овсяница луговая, костер безостый, бекмания восточная, а из бобовых - люпин многолетний, лядвенец рогатый, клевер шведский, клевер луговой, ползучий [15-17].
Кроме того, эти растения, в особенности бобовые, могут создавать в прикорневой зоне особую микрофлору, которая способна к деградации самых разнообразных загрязнителей, причем процессы разрушения токсичных веществ протекают здесь гораздо быстрее, чем в почве без растений. Для осуществления мониторинга экологического состояния почв в первую очередь оценивают изменения интегральных показателей состояния почв, к которым относится биологическая активность, в частности оценка фитотоксичности. Основными параметрами, изучаемыми в процессе биотестирования на фитотоксичность, являются всхожесть и энергия прорастания семян. Прорастание семян - наиболее уязвимый этап индивидуального развития высших растений. Эта фаза развития растения представляет собой наиболее привлекательный объект тестирования [18-19].
Экспериментальная часть
Объектами исследования были карбамидный сорбент «Унисорб-Био» - биопрепарат, полученный методом капельного орошения сорбента типа «Унисорб» («Сорбенты полимерные» по ТУ 2223-001-02067907-1996, с изменениями № 1 2006 г., производство ООО «НПФ» ЭКОСОРБ») суспензией аборигенных штаммов Bacillus cereus «12М», Bacillus subtilis «2сп», Trichoderma koningii «ТСЛ-06», Trichoderma asperellum «TH-11». Условия получения модифицированных сорбентов приведены в [14]. Молекулярно-генетическая идентификация выделенных штаммов выполнена на основании ПЦР-амплификации и секвенирования гена 16S рРНК с использованием стандартных методов молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, определение и анализ нуклеотидных последовательностей). Для уточнения видовой принадлежности чистых культур проводили анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Секвенирование проводили в институте Микробиологии РАН (г. Москва).
Для получения биомассы жидкофазное культивирование производили на минеральных средах, содержащих разный набор солей и одинаковый процент нефти (1 % от объема среды). Культивирования производились на среде для бактерий рода Bacillus, г/л: NH4NO3 - 1,0; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO47H2O - 0,2; CaCl - 0,02; FeCl3 - две капли.
Состав среды для грибов рода Trichoderma г/л: K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,5; NaNO3 - 2,0; FeSO4 - 0,01; KCl - 0,5. Полученную активную биомассу, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, использовали для иммобилизации.
Испытания проводили в нестерильных условиях, моделирующих естественные, в двух по-вторностях, в контейнерах с искусственно внесенной нефтью. Навеску загрязненной нефтью почвы 200 г помещали в пластиковый контейнер объемом 500 см 3, затем вносили в количе-
стве, % от а.с.м. почвы, нефть - 5 и 10 и «Унисорб-Био» - 1, содержащий разные комбинации исследуемых штаммов в количестве 108 кл/г сорбента.
Почву увлажняли до относительной влажности 60-65 %. После внесения всех компонентов все тщательно перемешивали. Полив и рыхление почвы осуществляли через каждые три дня. В качестве контроля использовали почву, загрязненную нефтью, без внесения биопрепарата.
Эксперимент проводили в течение девяти недель при 30-33 °C.
По завершении процесса экспонирования определяли степень деструкции нефти гравиметрически, после экстракции УВ хлороформом [20].
По истечении девяти недель применения иммобилизованного биопрепарата в контейнеры с незагрязненной и загрязненной почвой производили посев воздушно-сухих семян кресс-салата (по 10 штук), увлажняли до 60 % от полной влагоемкости почвы. Увлажнение осуществляли каждые 2 дня. Эксперимент проводился в условиях естественной освещенности при комнатной температуре в двух повторностях. Энергию прорастания и всхожесть семян учитывали на 7-й и 14-й день соответственно. Морфологическую оценку состояния растений проводили на 21-е сутки.
По окончании опыта растения осторожно отделяли от земли, просушивали, стряхивали остатки почвы и определяли морфометрические показатели растений: длину наземной части и длину корней [21].
Обсуждение результатов
О том, насколько эффективно прошла биодеструкция нефти в условиях модельных опытов с использованием разных штаммов иммобилизованной микрофлоры, можно судить по результатам изменения содержания остаточной нефти в почве после обработки ее «Унисорб-Био» с иммобилизованными смешанными и монокультурами рода Bacillus и грибов рода Trichoderma.
Максимальное снижение содержания нефти в почве, при ее начальной концентрации 5 %, за 9 недель инкубирования наблюдалось при использовании монокультуры Bacillus subtilis «2сп» и смешанной культуры Bacillus subtilis «2сп» + Bacillus cereus «12М», оно составило 87,5 %, что выше по сравнению с контрольным вариантом в 1,5 раза (рис. 1).
Подобный характер имеет динамика изменения содержания нефти в почве и при более высоком уровне начального загрязнения. Так, при ее начальной концентрации 10 % максимальное снижение содержания нефти за 9 недель инкубирования наблюдалось при использовании смешанной культуры Bacillus subtilis «2сп» + Bacillus cereus «12М», и эффективность очистки почвы с применением бактериальных штаммов по сравнению с контролем была выше в 1,4 раза.
В случае применения монокультур штаммов Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» количество остаточной нефти после 9 недель культивирования при ее начальном содержании 5 % снизилось на 80,7 и 85,7 % соответственно, а при концентрации нефти в почве 10 % - на 78 и 84 % соответственно. По сравнению с контрольными вариантами биодеструкция с применением микромицетов была выше в 1,4 и 1,2 раза при начальной концентрации 5 и 10 % соответственно.
Применение консорциума бактерий рода Bacillus и грибов рода Trichoderma показало, что максимальная степень биодеструкции составила 88,8 % при внесении биосорбента с им- 293 -
Рис. 1. Изменение содержания нефти в почве в результате воздействия штаммов рода Bacillus при начальном загрязнении почвы 5 %
Fig. 1. Changes in the oil content in the soil as a result of exposure to strains of the genus Bacillus during initial soil contamination 5 %
мобилизованными смешанными культурами Bacillus subtilis «2сп» + Trichoderma koningii «ТСЛ-06» при любой степени начального загрязнения. По сравнению с контрольным вариантом эффективность очистки почвы с использованием консорциума микроорганизмов была выше в 1,5.
Следует отметить, что за счет проведения опыта при повышенных температурах и выравнивания соотношения биогенных элементов С: N: Р в почве в результате внесения полимерного сорбента, вероятно, активизировалась собственная мезофильная микрофлора и степень биодеструкции в контрольных вариантах была достаточно высока. C 166: N 20: P1 в молярном эквиваленте (в весовом - C 62: N 9: P1).
По результатам видно, что бактерии рода Bacillus и грибы рода Trichoderma способны подвергать деструкции нефть, содержащуюся в почве. Максимальное снижение содержания нефти при ее начальной концентрации 5 % наблюдалось при использовании монокультуры Bacillus subtilis «2сп», при начальной концентрации 10 % - у смешанной культуры Bacillus subtilis «2сп» + Bacillus cereus «12М». Эти результаты хорошо согласуются с морфометрической оценкой состояния растений, выросших на почве после биоремедиации.
При оценке действия биоремедиации загрязненной почвы на морфометрические показатели растений в условиях естественной освещенности установлено достоверное увеличение таких параметров, как длина наземной части и длина главного корня растения.
По совокупности морфометрических показателей лучшие результаты имели следующие штаммы: консорциумы Bacillus cereus «12М» + Trichoderma koningii «ТСЛ-06», Bacillus cereus «12М» + Trichoderma asperellum «TH-11», Bacillus subtilis «2сп» + Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и смешанную культуру Bacillus subtilis «2сп» + Bacillus cereus «12М», их показатели превышали показатели растений на нативной почве по длине надземной части примерно в 2 раза, в то же время по длине главного корня различия были менее существенны.
Таким образом, результаты моделирования почвенного загрязнения и обработки почвы иммобилизованной микрофлорой показали, что содержание нефти в почве в концентрциях выше 5 % оказывает фитотоксическое действие на растения, так, энергия прорастания кресс-салата составила 50 %, всхожесть - 72,5 %. После проведения биоремедиации нефтезагряз-ненной почвы с применением «Унисорб-Био» с иммобилизованными бактериальными культурами рода Bacillus и грибов рода Trichoderma наблюдалось повышение жизнеспособности и выживаемости растений на 50 и 28 % соответственно. Применение микроорганизмов для биоремедиации оказало положительное влияние на морфометрические показатели растений (максимальный эффект составил в среднем в 2,5 раза).
Результаты позволяют оценить степень снижения токсичности и перспективы использования смешанных микробных ассоциаций для решения экологических задач методами биотехнологии.
По совокупности параметров, таких как степень деградации углеводородов и фитотоксич-ность, для создания биопрепаратов в целях рекультивации почвы от нефтезагрязнений с последующим выращиванием растений можно рекомендовать следующие штаммы: консорциумы
Bacillus cereus «12М» + Trichoderma koningii «ТСЛ-06», Bacillus cereus «12М» + Trichoderma asperellum «TH-11», Bacillus subtilis «2сп» + Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и смешанную культуру Bacillus subtilis «2сп» + Bacillus cereus «12М».
Список литературы / References
1. Деградация и охрана почв. Под общей ред. акад РАН Г. В. Добровольского. М.: Изд-во МГУ, 2002. 654 [Soil degradation and protection. Under the general ed. akad RAS G. V. Dobrovolskogo. M.: MSU Publishing House, 2002. 654 (In Russ.)]
2. Васильева, Г. К. Стрижакова Е. Р., Барышникова Е. А. Использование сорбентов для повышения эффективности биоремедиации загрязненных почв. Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья. Матер. IV-й межд. конф. Белгород 2012. 194-200 [Vasilyeva, G. K. Strizhakova E. R., Baryshnikova E. A. The use of sorbents to increase the efficiency of bioremediation of contaminated soils. Sorbents as a factor of quality of life and health. Mater. ivth international conf. Belgorod 2012. 194-200]
3. Салахова Г. М. Изменение эколого-физиологических параметров растений и ри-зоферной микробиоты в условиях нефтяного загрязнения и рекультивации почвы / Са-лахова, Гульнара Мирзалифовна: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.16, 03.00.12. Уфа, 2007. 194 [Salakhova G. M. Changes in the ecological and physiological parameters of plants and rhizosphere microbiota in the conditions of oil pollution and soil recultivation / Salakhova, Gulnara Mirzalifovna: dis. ... cand. biol. nauk: 03.00.16, 03.00.12. Ufa, 2007. 194 (In Russ.)]
4. Зволинский В. П., Батовская Е. К., Черных Н. А. Влияние нефти и нефтепродуктов на свойства почв и почвенные микроорганизмы. Агрохимический вестник 2005. № 2, 22-25. [Zvolinsky V. P., Batovskaya E. K., Chernykh N. A. Influence of oil and petroleum products on soil properties and soil microorganisms. Agrochemical Bulletin 2005, no. 2, 22-25. (In Russ.)]
5. Коршунова Т. Ю. Четвериков С. П., Бакаева М. Д., Кухина Е. В., Рафикова Г. Ф., Четверикова Д. В., Логинов О. Н. Микроорганизмы в ликвидации последствий нефтяного загрязнения (обзор). Прикладная биохимия и микробиология 2019. Т. 55, № 4, 338-349. [Kor
shunova T. Yu. Chetverikov S. P., Bakaeva M. D., Kuzina E. V., Rafikova G. F., Chetverikova D. V., Loginov O. N. Microorganisms in the elimination of the consequences of oil pollution (review). Applied Biochemistry and Microbiology 2019. Vol. 55, no. 4, 338-349. (In Russ.)]
6. Яковлев А. Л., Савенок О. В. Нарушения экологической безопасности при интенсификации добычи нефти на месторождениях Краснодарского края. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе 2017. N° 1, 50-54. [Yakovlev A. L., Savenok O. V. Violations of environmental safety in the intensification of oil production in the fields of the Krasnodar Territory. Environmental protection in the oil and gas complex 2017. No. 1, 50-54. (In Russ.)]
7. Замотаев И. В., Иванов И. В., Михеев П. В., Никонова А. Н. Химическое загрязнение и трансформация почв в районах добычи углеводородного сырья (обзор литературы). Почвоведение 2015. № 11, 1505-1518. [Zamotaev I. V., Ivanov I. V., Mikheev P. V., Nikonova A. N. Chemical pollution and soil transformation in areas of hydrocarbon production (literature review). Soil Science 2015. No. 11, 1505-1518. (In Russ.)]
8. Кузнецов А. Е. [и др.]. Прикладная экобиотехнология. Учебное пособие: в 2 т. Т. 2. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2017. 485 [Kuznetsov A. E. [et al.]. Applied ecobiotechnology. Textbook: in 2 t. T. 2. M.: BINOM. Laboratory of Knowledge, 2017. 485 (In Russ.)]
9. Зиннатшина Л. В. Экологическая оценка влияния натуральных сорбентов на эффективность биоремедиации нефтезагрязненной серой лесной почвы / Зиннатшина, Лидия Викторовна: дис. ...канд. биол.наук: 03.02.08, 03.02.13. Пущино, 2019. 161 [Zinnatshina L. V. Ecological assessment of the effect of natural sorbents on the efficiency of bioremediation of oil-contaminated gray forest soil / Zinnatshina, Lidiya Viktorovna: dis. .. .cand. biol.Sciences: 03.02.08, 03.02.13. Pushchino, 2019. 161]
10. Коновалова Е.А., Лазыкин А. Г., Гаврилов К. Е. Сравнительная характеристика сорбентов, используемых в составе биопрепаратов для очистки почвы от нефтезагрязнений. Наука вчера, сегодня, завтра: сб. ст. по матер. XXXIVмеждунар. науч.-практ. конф. Новосибирск: СибАК 2016. № 5(27), Часть I, 6-17. [Konovalova E. A., Lazykin A. G., Gavrilov K. E. Comparative characteristics of sorbents used in the composition of biological products for soil purification from oil pollution. Science yesterday, today, tomorrow: sat. st. on mater. XXXIV International scientific and practical conference. Novosibirsk: SibAK 2016. No. 5 (27), Part I, 6-17. (In Russ.)]
11. Зиннатшина Л. В., Стрижакова Е. Р., Даньшина А. В., Васильева Г. К. Влияние сорбентов на скорость биоремедиации и свойства почвы, загрязненной смесью нефтепродуков. Естественные и технические науки 2018. № 9, 24-30 [Zinnatshina L. V., Strizhakova E. R., Danshina A. V., Vasilyeva G. K. The effect of sorbents on the rate of bioremediation and properties of soil contaminated with a mixture of petroleum products. Natural and Technical Sciences 2018. No. 9, 24-30]
12. Рязанова Т. В., Федорова О. С. Динамика микробиоценоза гетеротрофов в модельных опытах с применением биосорбента на основе смешанной бактериальной культуры. Системы. Методы. Технологии 2017. № 1(3), 157-164. [Ryazanova T. V., Fedorova O. S. Dynamics of the microbiocenosis of heterotrophs in model experiments using a biosorbent based on a mixed bacterial culture. The system. Methods. Technologies 2017. No. 1(3), 157-164. (In Russ.)]
13. Рязанова Т. В. Федорова О. С. Получение биосорбента на основе аборигенной микрофлоры для очистки нефтезагрязненных территорий. Всероссийская научно-практическая конференция «Новые экологобезопасные технологии для устойчивого развития регионов Сиби-
ри» 2005. 65-70. [Ryazanova T. V. Fedorova O. S. Obtaining a biosorbent based on native microflora for cleaning oil-contaminated territories. All-Russian Scientific and Practical Conference "New environmentally safe technologies for sustainable development of the Siberian regions" 2005. 65-70. (In Russ.)]
14. Рязанова Т. В. Федорова О. С., Марченко Р. А., Шуркина В. И. Модификация нефтесор-бентов материалами растительного происхождения. Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья 2017. 327-329. [Ryazanova T. V. Fedorova O. S., Marchenko R. A., Shurkina V. I. Modification of oil sorbents with plant-based materials. New achievements in chemistry and chemical technology of plant raw materials 2017. 327-329. (In Russ.)]
15. Зволинский В. П., Батовская Е. К., Черных Н. А. Влияние нефти и нефтепродуктов на свойства почв и почвенные микроорганизмы. Агрохимический вестник 2005. № 2, 22-25. [Zvolinsky V. P., Batovskaya E. K., Chernykh N. A. Influence of oil and petroleum products on soil properties and soil microorganisms. Agrochemical Bulletin 2005, No. 2, 22-25. (In Russ.)]
16. Зволинский В. П., Батовская Е. К., Бондаренко А. Н. Экология нефтезагрязненных почв европейской части России. Земледелие 2007. № 4, 13-14. [Zvolinsky V. P., Batovskaya E. K., Bondarenko A. N. Ecology of oil-contaminated soils of the European part of Russia. Agriculture 2007. No. 4, 13-14. (In Russ.)]
17. Зильберман М. В., Порошина Е. А., Зырянова Е. В. Биотестирование почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Пермь: ФГУ УралНИИ «Экология», 2005. 111 [Zilberman M. V., Poroshina E. A., Zyryanova E. V. Biotesting of soils contaminated with oil and petroleum products. Perm: FSU UralNII "Ecology", 2005. 111 (In Russ.)]
18. Казеев К. Ш., Колесников С. И., Акименко Ю. В., Даденко Е. В. Методы биодиагностики наземных экосистем: монография. Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета, 2016. 356 [Kazeev K. Sh., Kolesnikov S. I., Akimenko Yu. V., Dadenko E. V. Methods of bio-diagnostics of terrestrial ecosystems: monograph. Rostov-on-Don: Southern Federal University Press, 2016. 356 (In Russ.)]
19. Назаров А. В. Влияние нефтяного загрязнения почвы на растения. Вестник Пермского государственного университета. Биология 2007. Т. 5 (10). 134-141. [Nazarov A. V. Influence of oil pollution of the soil on plants. Bulletin of the Perm State University. Biology 2007. Vol. 5 (10). 134-141. (In Russ.)]
20. ПНД Ф 16.1.41-04 «Количественный химический анализ почв. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах почв гравиметрическим методом». [HDPE F 16.1.41-04 " Quantitative chemical analysis of soils. Methods for measuring the mass concentration of petroleum products in soil samples by the gravimetric method". (In Russ.)]
21. Рекомендации по использованию органических, минеральных макро- и микроудобрений, мелиорантов для выполнения обязательных мероприятий по улучшению земель сельскохозяйственного назначения в ростовской области. ФГУ ГЦАС «Ростовский» п. Рассвет, 2011 г. 35 [Recommendations on the use of organic, mineral macro-and micro-fertilizers, ameliorants for the implementation of mandatory measures to improve agricultural land in the Rostov region. FSU GTSAS "Rostov" P. Rassvet, 2011 35 (In Russ.)]
