CC BY
18
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
УДК 502.1:602.3
Хвойные бореальной зоны. 2018. Т. XXXVI, № 6. С. 568-573
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ОЧИЩЕННОЙ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ
П. Н. Бондарь, И. В. Леконцева
Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31
E-mail: [email protected]
Эффективность обработки нефтезагрязненных почв микробиологическими препаратами оценивалась по фитотоксичности и ферментативной активности очищенной почвы. Фитотоксичность оценивалась по энергии прорастания и всхожести семян кресс-салата и морфометрическим показателям растений: длина наземной части и длина корней. Оценка биологической активности почвы после ремедиации производилась по потенциальной и актуальной целлюлозолитической и уреазной активностей почвы.
В работе были использованы способные к нефтеокислению штаммы грибов Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и штаммы углеводородокисляющих бактерий Bacillus subtilis «2сп» и Bacillus cereus «12М» в различных комбинациях - монокультуры, смешанные культуры и консорциумы.
Установлено, что содержание нефти в почве в концентрациях до 10 % оказывает фитотоксическое действие на растения, так, энергия прорастания кресс-салата составила 50 %, всхожесть - 72,5 %. После проведения биоремедиации нефтезагрязненной почвы жизнеспособность и выживаемость растений увеличились на 50 и 28 % соответственно. Использование микроорганизмов для биоремедиации оказало и положительное влияние на морфометрические показатели растений.
Исследование потенциальной целлюлозолитической способности загрязненной почвы показало, что интенсивность микробиологических процессов в почве сильно подавлена, что в результате и приводит к низким темпам разложения целлюлозы всего менее 10 % по сравнению с 98 % в контрольном варианте. В то время как актуальная целлюлозолитическая активность оказалась выше потенциальной. Так, разрушение целлюлозы при использовании штаммов B. cereus +T. koningii, B. subtilis, B. cereus + T. asperellum составило 20, 91 и 95 % соответственно, контрольный вариант - 100 %. Уреазная активность наблюдалась во всех образцах, при этом в нативной почве она оказалась менее выражена, что может свидетельствовать об активизации процессов превращения азотсодержащих соединений и восстановлении экологического равновесия после биоремедиации.
По совокупности параметров для создания биопрепаратов в целях рекультивации почвы от нефтезагряз-нений с последующим выращиванием растений были рекомендованы следующие штаммы: консорциумы B. cereus + T. koningii, B. cereus + T. asperellum, B. subtilis + T. koningii и смешанная культура B. subtilis. + B. cereus.
Ключевые слова: нефть, почва, фитотоксичность, биологическая активность, грибы рода Trichoderma, бактерии рода Bacillus, биоремедиация.
Conifers of the boreal area. 2018, Vol. XXXVI, No. 6, P. 568-573
ENVIRONMENTAL ASSESSMENT OF THE CONDITION CLEARED FROM OIL POLLUTION OF FOREST SOIL WITH APPLICATION OF MICROORGANISMS
P. N. Bondar, I. V. Lekonceva
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsky Rabochy Av., Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation E-mail: [email protected]
The treatment efficiency of oil-contaminated soils with microbiological preparations was evaluated by phytotoxicity and enzymatic activity of the purified soil. Phytotoxicity was estimated by the germination energy and germination of cress seeds and morphometric parameters ofplants: the length of the ground part and the length of roots. Evaluation of the biological activity of the soil after remediation was made according to the potential and actual cellulolytic and urease activity of the soil.
In this work, the Trichoderma asperellum "TH-11" and Trichoderma koningii "TSL-06" strains capable of oil-oxidation and the hydrocarbon-oxidizing bacteria strains Bacillus subtilis "2sp" and Bacillus cereus "12M" were used in various combinations - monocultures, mixed cultures and consortiums, and mixed cultures and consortiums.
It has been established that the oil content in the soil in concentrations up to 10 % has a phytotoxic effect on plants, so the germination energy of cress was 50 %, germination rate is 72.5 %. After the bioremediation of oil-contaminated soil, the viability and survival of plants increased by 50 % and 28 %, respectively. The use of microorganisms for bioremediation also had a positive effect on the morphometric parameters of plants.
The study of the potential cellulolytic capacity ofpolluted soil showed that the intensity of microbiological processes in the soil is strongly suppressed, which results in a low rate of cellulose decomposition of less than 10 % compared to 98 % in the control variant. At the same time, actual cellulolytic activity was higher than potential. Thus, the destruction of cellulose using strains of B. cereus + T. koningii, B. subtilis, B. cereus + T. asperellum was 20 %, 91 % and 95 %, respectively, the control variant - 100 %. Urease activity was observed in all samples, while in native soil it turned out to be less pronounced, which may indicate activation of the processes of transformation of nitrogen-containing compounds and restoration of ecological balance after bioremediation.
The following strains were recommended for the reclamation of soil from oil pollution with subsequent cultivation of plants for the creation of biological products for the following purposes: B. cereus + T. koningii, B. cereus + T. koningii, B. subtilis + T. koningii consortia and mixed culture B. subtilis. + B. cereus.
Keywords: oil, soil, phytotoxicity, biological activity, fungi of the genus Trichoderma, bacteria of the genus Bacillus, bioremediation.
ВВЕДЕНИЕ
Леса занимают самую большую площадь (около 40 %) среди всех наземных экосистем. В них распространено более половины мирового разнообразия видов флоры и фауны, обитающих на суше планеты. Несмотря на то, что Сибирь осталась одной из самых лесных территорий нашей планеты, леса региона испытывают сильнейший пресс из-за различных экологических проблем связанных, прежде всего, с антропогенной деятельностью. В регионе сосредоточены большие запасы углеводородов (нефть и газ) в Томской и Иркутской областях, на юге Якутии и в Красноярском крае. На экологическое состояние обширных территорий лесов Сибири непосредственно влияют: разведка, добыча, транспортировка и переработка минерально-сырьевых и топливно-энергетичес-ких ресурсов, а также строительство и производство энергии [1].
Основное количество поступающей в таежные ландшафты нефти сосредотачивается в подстилке и верхнем минеральном горизонте почвы. Загрязнение подстилки - важнейшего биогеоценотического компонента таежных экосистем - вызывает необратимые последствия, включая уничтожение банка семян и зачатков, практически полную гибель почвенного микробного и животного населения, сосредоточенного почти исключительно в этом горизонте, и выпадение мохово-лишайникового яруса. Последствия от загрязнения подстилки усугубляются ее высокой нефтеемко-стью - до 20 %. Последующие изменения в почве приводят к угнетению и гибели древесного яруса. В результате нефтезагрязнения на месте таежных почв формируются так называемые таежные хемоземы [2].
Поскольку на современном уровне развития нефтяной промышленности не представляется возможным полностью исключить её негативное воздействие на окружающую среду, возникает необходимость разработки методов и технологии восстановления почв, загрязненных нефтяными углеводородами [3]. Наиболее перспективным методом очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами признан биологический метод, особенно с применением им-
мобилизации природных углеводородокисляющих микроорганизмов на сорбент. Внесение закрепленных клеток предотвращает вымывание их из зоны загрязнения, что значительно увеличивает эффективность биодеструкции.
Опыт многолетних исследований в области почвенной экологии показал, что для осуществления широкомасштабного мониторинга экологического состояния почв урбанизированных и техногенных ландшафтов, следует в первую очередь оценивать изменения интегральных показателей состояния почв, к которым относится их биогенность (биологическая активность).
Среди многих методов интегральной оценки биологической активности почв (микробиологических, зоологических, геоботанических, биохимических, оценки дыхания почвы, или эмиссии почвой СО2 и других) наиболее адекватны методы определения ферментативной активности почв и оценки фитоток-сичности почв по прорастанию семян. Оба метода обладают высокой чувствительностью к влиянию на биологическую активность агрохимических, агротехнических и техногенных факторов, отличаются простотой исполнения и низкой ошибкой эксперимента.
В связи с этим целью данной работы является оценка фитотоксичности и ферментативной активности очищенной от нефтезагрязнений почвы после биоремедиации с применением микроорганизмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Для проведения исследований были отобраны 2 штамма углеводородокисляющих бактерий Bacillus subtilis «2сп» и Bacillus cereus «12М» из коллекции культур кафедры химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного университета науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева и 2 штамма грибов Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» из коллекции культур Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного технологическо-
го университета, нефть Куюмбинского месторождения р = 0,834 г/см3, карбамидный полимерный сорбент «Унисорб» научно-производственной фирмы «Экосорб», лесная почва г. Красноярска, кресс-салат «Забава». Моделирование нефтяных загрязнений почвы проводилось в концентрациях 5 и 10 % (по массе) нефти [4].
Для оценки фитотоксичности очищенной почвы проводили почвенный эксперимент в пластиковых контейнерах, в загрязненную нефтью почву вносился сорбент, инокулированный суспензией микроорганизмов. По истечении трех месяцев применения биопрепарата в контейнеры с незагрязненной и загрязненной почвой производили посев воздушно-сухих семян кресс-салата (по 10 штук), увлажняли до 60 % от полной влагоемкости почвы. Увлажнение производилось каждые 2 дня. Эксперимент проводился в условиях естественной освещенности при комнатной температуре. Эффективность обработки нефтезагряз-ненных почв микробиологическими препаратами оценивали по энергии прорастания и всхожести семян кресс-салата на 7-й и 14-й день соответственно и морфометрическим показателям растений (длина наземной части и длина корней).
Оценку биологической активности почвы после ремедиации определяли по целлюлозолитической и уреазной активностей почвы. Целлюлозоразлагаю-щую активность почв определяли аппликационным методом А. Ф. Захарченко и А. Н. Петровой [5; 6]. Способность почвенной микрофлоры к целлюлозо-разложению устанавливали через компостирование почвы в чашках Петри с полосками фильтровальной бумаги (аналога целлюлозы) при оптимальных условиях (влажность 60 % от полной влагоемкости; температура 28оС) в течение 8 недель (потенциальная целлюлозоразрушающая активность). Для определения актуальной целлюлозоразлагающей активности почвы полоски хлопчатобумажной ткани в трехкратной повторности вставляли в почву вертикально так, чтобы ткань плотно прилегала к ровной свежеочи-щенной стенке почвенного разреза. Период экспозиции - 8 недель. По разности весов до и после компостирования фильтровальной бумаги (потенциальное целлюлозоразложение) и экспонирования хлопчатобумажной ткани в почве (актуальное целлюлозо-разложение) высчитывался процент разложившейся клетчатки [5]. Интенсивность процесса разрушения определяли по шкале разрушения целлюлозы [6].
Определение уреазной активности почвы проводили экспресс-методом определения уреазы, который позволяет быстро определить биохимический потенциал почв, оценить их самоочищающую способность. К внутренней поверхности крышки чашки Петри прикрепляется полоска фильтровальной бумаги, пропитанная раствором универсального индикатора. В чашку Петри помещается навеска почвы массой 50 г, затем добавляется мочевина (0,5 г), предварительно растворенная в небольшом количестве воды. Почва и мочевина тщательно перемешиваются, затем увлажняются дистиллированной водой до пастообразного состояния и равномерно распределяются по дну чашки. Чашку закрывают крышкой. Между по-
верхностью почвы и крышкой чашки должно оставаться небольшое воздушное пространство, в котором и будет происходить реакция. Результаты снимали через 4 и 8 недель экспозиции [6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Эффективность обработки нефтезагрязненных почв микробиологическими препаратами оценивали по энергии прорастания и всхожести семян кресс-салата и морфометрическим показателям растений.
Исследования показали, что содержание нефти в почве в концентрациях до 10 % оказывает фитоток-сическое действие на растения, так, энергия прорастания кресс-салата составила 50 %, всхожесть - 72,5 %. После проведения биоремедиации нефтезагрязненной почвы с применением микробных иммобилизирован-ных препаратов наблюдалось повышение жизнеспособности и выживаемости растений даже по сравнению с нативной почвой. Наибольшее положительное влияние на данные показатели оказали препараты на основе ранее рекомендованных консорциумах: B. cereus + T. koningii, B. cereus + T. asperellum, B. subtilis + T. koningii. По сравнению с нефтезагряз-ненным контролем энергия прорастания увеличилась на 50 %, всхожесть на 28 % (рис. 1, 2).
При оценке действия биоремедиации загрязненной почвы на морфометрические показатели растений в условиях естественной освещенности, установлено достоверное увеличение таких параметров как длина наземной части и длина главного корня растения. Максимальный эффект (в среднем в 2,5 раза) наблюдался при использовании консорциумов В. subtilis + B. cereus + T. asperellum», B. cereus» + T. asperellum, B. subtilis + T. asperellum, а также монокультуры B. cereus и смешанную культуру B. subtilis + B. cereus (рис. 3).
По совокупности параметров, таких как, степень деградации углеводородов и фитотоксичность для создания биопрепаратов в целях рекультивации почвы от нефтезагрязнений и выращивания растений можно рекомендовать следующие штаммы: консорциумы B. cereus + T. koningii, B. cereus + T. asperellum, B. subtilis + T. koningii и смешанную культуру B. subtilis + B. cereus.
Показатели биохимической активности почвы необходимы для характеристики ее как биологической системы и оценки степени ее изменения под влиянием антропогенного воздействия, в особенности повреждения токсикантами и техногенными перегрузками. Для контроля за биологическим состоянием почвы важно отобрать наиболее интегральные показатели, поддающиеся инструментальному измерению. Сущность основных почвенно-биологических процессов
в почве заключается в превращении органических веществ. Для оценки их интенсивности многие авторы используют ферментативную активность почвы. На основе обобщения соответствующих данных предложена система оценки биологической активности почвы, включающая, в том числе, показатели ферментативной активности почвы в цикле углерода
(дегидрогеназа, целлюлаза) и азота (уреаза, нитрат- нитритредуктаза).
Рис. 1. Показатели прорастаемости кресс-салата при 5%-ном загрязнении почвы нефтью
но
100 90
□ Энергия прорастания (7 сутки) ИВсхожесть (14 сутки) Рис. 2. Показатели прорастаемости кресс-салата при 10%-ном загрязнении почвы нефтью
Рис. 3. Морфометрические показатели кресс-салата при загрязнении почвы нефтью в различных концентрациях
Целлюлозоразлагающая активность почв является отражением минерализационных и деструкционных процессов, осуществление которых главным образом обуславливается определенным уровнем и соотношением активности ферментов [7].
Актуальная активность более изменчива и характеризует истинную динамику процессов в почве. Потенциальная активность более стабильна, но она в меньшей степени характеризует действительную интенсивность процессов, а в большей - определенные биологические свойства почвенного типа.
Для исследования ферментативной активности почвы использовали ранее рекомендованные штаммы и монокультуры бактерий и микромицетов с загрязнением почвы нефтью в концентрации 10 %.
Установлено, что за 2 месяца лабораторного исследования потенциальной целлюлозолитической способности техногенно загрязненной почвы интенсивность микробиологических процессов в почве сильно подавлена, что в результате и приводит к низким темпам разложения целлюлозы всего менее 10 % по сравнению с 98 % в контрольном варианте (рис. 4).
Анализ полученных данных показал, что актуальная активность целлюлозоразлагателей за аналогич-
ный период времени оказался выше потенциальной. Так, разрушение целлюлозы при использовании штаммов В. свгвш' + Т. коп^И, В. зиЫШз, В. свгвш' + Т. а8рете11иш составило 20, 91 и 95 % соответственно, контрольный вариант - 100 % (рис. 5).
Одним из надежных индикаторов состояния почв является активность уреазы. Это фермент, играющий важную роль в превращении азотсодержащих соединений, его активность определяет важные этапы превращения азотсодержащих веществ в почве. В условиях антропогенного пресса возможно изменение активности данного фермента. В результате может произойти нарушение одной из главных функций почв -поддержание экологического равновесия всей урбо-экосистемы. В этой связи необходимо исследование активности данного фермента.
Мочевина в почву попадает в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение, она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот. Продукт гидролиза мочевины - аммиак -служит непосредственным источником азотного питания для высших растений.
Рис. 4. Потенциальная целлюлозоразрушающая активность
Рис. 5. Актуальная целлюлозоразрушающая активность
Существует достаточно много методик, которые позволяют оценить активность уреазы в почве. Экспресс-метод определения уреазы позволяет быстро определить биохимический потенциал почв, оценить их самоочищающую способность.
Результаты эксперимента показали, что уреазная активность наблюдается во всех образцах, при этом в нативной почве она оказалась менее выражена. Через 4 недели экспозиции в образцах она составила в среднем 50 %, а через 8 недель экспозиции - 80 %. Можно сделать вывод о том, что после очистки почвы с применением микроорганизмов в почве активизируются процессы превращения азотсодержащих соединений и экологическое равновесие восстанавливается.
ВЫВОДЫ
В результате проведения экспериментальных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Содержание нефти в почве в концентрациях до 10 % оказывает фитотоксическое действие на растения, так, энергия прорастания кресс-салата составила 50 %, всхожесть - 72,5 %. После проведения биоремедиации нефтезагрязненной почвы с применением микробных препаратов жизнеспособность и выживаемость растений увеличились на 50 и 28 % соответственно.
2. Использование микроорганизмов для биореме-диации оказало положительное влияние на морфо-метрические показатели растений, такие как длина наземной части и длина главного корня. Максимальный эффект составил в среднем в 2,5 раза.
3. Биологическая активность почвы, как интегральный показатель экологического состояния почвы после техногенного загрязнения, показала, что при использовании штаммов В. свгвш +Т. koningii, В. зиЫШз, В. свгвш + Т. а'рвгвПиш разрушение целлюлозы в почве достигало 20, 91 и 95 %, контрольный вариант - 100 %. Уреазная активность наблюдалась во всех образцах, при этом в нативной почве она оказалась менее выражена.
4. По совокупности параметров, таких как, степень деградации углеводородов и фитотоксичность для создания биопрепаратов в целях рекультивации почвы от нефтезагрязнений с последующим выращиванием растений можно рекомендовать следующие штаммы: консорциумы В. свгвш + Т. Ыт^и, В. свгвш + Т. а'рвгвПиш, В. 8иЫШ' + Т. koningii и смешанную культуру В. зиЫШ' . + В. свгвш.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Брюханов А. В. Экологическая оценка состояния лесов в Сибири: тревожные результаты // Устойчивое лесопользование. Всемирный фонд охраны дикой природы. 2009. № 2 (21). С. 21-31.
2. Аветов Н. А., Шишконакова Е. А. Загрязнение нефтью почв таежной зоны Западной Сибири // Бюл-
летень Почвенного ин-та им. В. В. Докучаева. 2011. Вып. 68. С. 45-55.
3. Сулейманов Р. Р., Габбасова И. М., Ситдиков Р. Н. Изменение свойств нефтезагрязненной серой лесной почвы в процессе биологической рекультивации // Известия РАН. Сер. Биологическая. 2005. № 1. С. 109-115.
4. Федорова О. С. Получение комбинированного биопрепарата для борьбы с нефтяными загрязнениями на основе иммобилизованной аборигенной микрофлоры : дис. ... канд. техн. наук 11.28.05: защищена 29.12.05. Красноярск, 2005. 183 с.
5. Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимологии. М. : Наука, 2005. 252 с.
6. Федорец Н. Г., Медведева М. В. Методика исследования почв урбанизированных территорий. Петрозаводск : Карельский науч. центр РАН, 2009. 84 с.
7. Безуглова О. А. О возможности использования препарата «Тамир» на нефтезагрязненных почвах // Микробиологические препараты «Байкал ЭМ-1», «Тамир», «ЭМ-курунга»: практическая биотехнология в сельском хозяйстве, экологии, здравоохранении : сб. тр. М., 2006. С. 202-204.
REFERENCES
1. Bryukhanov, A. V. Ekologicheskaya otsenka sostoyaniya lesov v Sibiri: trevozhnyye rezul'taty // Ustoychivoye lesopol'zovaniye. Vsemirnyy fond okhrany dikoy prirody. 2009. № 2 (21). S. 21-31.
2. Avetov N. A., Shishkonakova E. A. Zagryazneniye neft'yu pochv tayezhnoy zony Zapadnoy Sibiri // Byulleten' Pochvennogo in-ta im. V. V. Dokuchayeva. 2011. Vyp. 68. S. 45-55.
3. Suleymanov R. R., Gabbasova I. M., Sitdikov R. N. Izmeneniye svoystv neftezagryaznennoy seroy lesnoy pochvy v protsesse biologicheskoy rekul'tivatsii // Izvestiya RAN. Ser. Biologicheskaya. 2005. № 1. S. 109115.
4. Fedorova O. S. Polucheniye kombinirovannogo biopreparata dlya bor'by s neftyanymi zagryazneniyami na osnove immobilizovannoy aborigennoy mikroflory : dis. ... kand. tekhn. nauk 11.28.05: zashchishchena 29.12.05. Krasnoyarsk, 2005. 183 s.
5. Khaziyev F. Kh. Metody pochvennoy enzimologii. M. : Nauka, 2005. 252 s.
6. Fedorets N. G., Medvedeva M. V. Metodika issledovaniya pochv urbanizirovannykh territoriy. Petrozavodsk : Karel'skiy nauch. tsentr rAn, 2009. 84 s.
7. Bezuglova O. A. O vozmozhnosti ispol'zovaniya preparata "Tamir" na neftezagryaznennykh pochvakh // Mikrobiologicheskiye preparaty "Baykal EM-1", "Tamir", "EM-kurunga": prakticheskaya biotekhnologiya v sel's-kom khozyaystve, ekologii, zdravookhranenii : sb. tr. M., 2006. S. 202-204.
© Бондарь П. Н., Леконцева И. В., 2019
Поступила в редакцию 14.11.2018 Принята к печати 10.12.2018
