CC BY
26
УДК [502.521:622.692]:[579.64:631.445.24]
ВЛИЯНИЕ БИОПРЕПАРАТА ПСЕВДОМИН НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ОКУЛЬТУРЕННЫХ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОГО УВЛАЖНЕНИЯ
О.О. Алонге, аспирант, И И. Васенев, д.б.н., О.В. Селицкая, к.б.н.
РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, e-mail: vasenev@timacad.ru
Аннотация. В лабораторных опытах показано, что биопрепарат Псевдомин способен эффективно стимулировать естественную микробиоту незагрязненных и нефтезагрязненных дерново-подзолистых почв. Важным фактором, влияющим на приживаемость интродуцированной популяции бактерий р. Pseudomonas (штамм РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева), служат условия увлажнения почв. В результате исследований установлено, что наилучшая приживаемость бактерий, внесенных с биопрепаратом Псевдомин в дерново-подзолистую окультуренную почву, отмечается при режиме влажности около 60% ПВ.
Ключевые слова: экология почв, биоремедиация почв, загрязнение нефтепродуктами, условия биоремедиации, фактор влажности, микробный метаболизм, устойчивость микробного сообщества.
EFFECT OF PSEUDOMIN BIOPREPARATION ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY AND ECOLOGICAL STATE OF OIL CONTAMINATED CULTIVATED SOD-PODZOLIC SOILS UNDER DIFFERENT SOIL MOISTURE
O.O. Alonge, LL Vasenev, O.V. Selitskaya
Laboratory experiments showed that Pseudomin biopreparation was capable to stimulate efficiently the natural microbio-ta of uncontaminated and especially oil contaminated sod-podzolic soils. The soil moisture condition is the important factor influencing the population of the introduced species of Pseudomonas (RTSA U strain) in the process of bioremediation. The carried out researches established the best survival rate of bacteria introduced into the cultivated sod-podzolic soil with Pseudomin in condition of around 60% of soil total moisture capacity.
Keywords: soil ecology, soil bioremediation, oily contamination, bioremediation conditions, moisture factor, microbial metabolism, microbial coenosis stability.
Постепенное увеличение площади загрязненных нефтепродуктами сельскохозяйственных земель Центрального региона России актуализирует задачи разработки экологически безопасных и экономически эффективных технологий очистки нефтезагрязненных земель с использованием современных биопрепаратов, ускоряющих процессы биоремедиации, разложения углеводородов нефтепродуктов, восстановления плодородия и экологических сервисов агроландшафтов [1, 2]. Эффективность применения биопрепаратов с комплексом микроорганизмов повышенной способности к биодеструкции основных углеводородных компонентов нефтепродуктов зависит от морфогенетических и функционально -экологических особенностей загрязненных почв. К наиболее проблемным почвам относятся подзолистые и дерново-подзолистые, для которых характерны невысокое содержание гумуса и пониженная биологическая активность [3, 4]. Важными факторами регулирования последней служат уровень окультуривания почв и содержание в них доступной микробиоте влаги [5].
Разработанный на кафедре микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева биопрепарат Псевдоним создан на основе штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas putida, выделенных из дерново-подзолистой почвы, длительное время подвергавшейся загрязнению нефтепродуктами АЗС. Псевдоним обладает пролонгированным деградационным последействием на
нефтепродукты, остающиеся в почве после механической и(или) физико-химической очистки. Он успешно прошел испытания в условиях южнотаежной зоны европейской части России и ряда нефтеносных районов Сибири. Однако мало изучена эффективность его действия на нефтезагряз-ненных окультуренных дерново-подзолистых почвах в условиях различных режимов увлажнения, что и определяет цель исследования - изучение влияния биопрепарата Псевдомин на биологическую активность и экологическое состояние окультуренных дерново-подзолистых почв в условиях разного увлажнения.
Исследования проводили в лаборатории агроэколо-гического мониторинга, моделирования и прогнозирования экосистем и на кафедре микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.
Для проведения лабораторных исследований по изучению эффективности действия препарата использовали усредненные образцы пахотного горизонта (0-24 см) окультуренной дерново-подзолистой среднесуглинистой почвы с полевых участков опыта точного земледелия РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (табл. 1).
В качестве загрязнителя в модельных лабораторных опытах использовали дизельное топливо (на 75% состоящее из легких углеводородов, в основном алканов, которые ассимилируются многими микроорганизмами), плотность не более 840 кг/м3, температура вспышки 40°С, температура застывания -35°С.
1. Характеристика пахотных горизонтов исследуемых дерново-подзолистых почв
Наименование
Сорг, %
pHK
Нг,
мг-экв/100 г почвы
Р2О5, мг/кг почвы
К2О, мг/кг почвы
Усредненные данные пахотных горизонтов исследуемых почв
2,4
3,7
173,0
107,0
Усредненные данные для дерново-подзолистых почв Московской области [6]
2,0
5,9
1,2
181,0
128,0
2. Схема и условия проведения опыта
Варианты опыта Фоновое содержа- Количество внесен- Остаток нефтепро-
ние нефтепродуктов, мг/г ных нефтепродуктов, мг/г дуктов, мг/г (после 7 недель опыта)
1 -а H Незагрязненная почва 0,00 0,01
2 0 40 Щ 0х Загрязненная почва 0,01 48,00 4,15
3 S ^о Я ^ Незагрязненная почва + Pseudomonas 0,00 0,01
4 ч m Загрязненная почва + Pseudomonas 48,00 3,64
5 -а H Незагрязненная почва 0,00 0,01
6 0 40 Загрязненная почва 0,01 48,00 24,7
7 S Незагрязненная почва + Pseudomonas 0,00 0,01
8 ч m Загрязненная почва + Pseudomonas 48,00 11,0
*Работа выполнена при частичной поддержке грантов РФФИ № 11-04-01376 и Правительства Российской Федерации № 11.G34.31.0079.
В работе использовали чистые культуры штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, отнесенные к роду Pseudomonas putida st. 91-96, впервые выделенные из нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы на кафедре микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. Бактерии рода Pseudomonas относятся к грамотрицатель-ным неспорообразующим аэробным микроорганизмам, являются мезофиллами и наиболее активно развиваются при температуре 27-30°C.
Почвы, предварительно высушенные до воздушно-сухого состояния и просеянные через сито (диаметр отверстий 1 мм), помещали в 2 разные емкости для перемешивания и последующего увлажнения по 2 режимам, соответствующим 60 и 30% полной влагоемкости (ПВ). Согласно схеме опыта в каждую емкость помещали 4,8 кг почвы. В варианты с загрязнением дизельное топливо вносили в расчете на концентрацию 48 мг/г почвы, что соответствует 5% ее воздушно-сухой массы. В варианты с инокуляцией бактерий вносили по 10 мл трехсуточной суспензии Pseudomonas putida, титр которого составлял 1,6х10' КОЕ/мл. После этого влажность почвы доводили до 26 и 13% (что соответствует 60 и 30% ПВ). Почву перемешивали и помещали в пластиковые сосуды по 400 г, и затем поддерживали эту влажность, каждый день контролируя ее весовым методом. Общее число вариантов опыта - 8 (табл. 2), повторность трехкратная.
Биологическую активность почвы определяли методом микробиологического посева (подсчет колоний на питательных средах) и измерением дыхания почвы на газовом хроматографе, гумус по И.В. Тюрину в модификации Симакова, рНКс1 потенциометрическим методом, подвижные формы фосфора и обменный калий по Кирсанову, гидролитическую кислотность по Каппену в модификации ЦИНАО. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistic 8.0».
Во всех вариантах опыта с первой по двенадцатую неделю наблюдали общую тенденцию постепенного разложения и усвоения углеводородов дизельного топлива микроорганизмами почвы (табл. 3), что сопровождается увеличением базального дыхания (БД) почвы. Угнетающее действие дизтоплива на почвенные микроорганизмы диагностируется значениями отношения «БД с дизтопливом / БД без дизтоплива» меньше
1. Чем выше это отношение, тем интенсивнее происходит разложение дизтоплива.
Микробное разложение дизельного топлива в почве сопровождается значительным возрастанием скорости базального дыхания (в 1,5-5,7 раза по сравнению с контролем), что не диагностирует его ингибирующее влияние на гетеротрофные микроорганизмы. При сравнении вариантов 4 и 8 (рис. 1) видно, что наибольшее значение БД зафиксировано в почве на 6 неделе после внесения дизтоплива и биопрепарата в варианте 4 (в 5,6 раз больше контроля). Это свидетельствует о положительной динамике активности микробного сообщества загрязненной почвы с внесением микробного препарата при влажности 26%.
Режим увлажнения исследуемой почвы во многом определяет скорость микробиологических процессов в ней. Относительно интенсивное выделение СО2 при влажности почвы в 26% (рис. 1) свидетельствует о более активных микробиологических процессах, с использованием дизтоплива в качестве пищевого субстрата. Низкая интенсивность дыхания почвы при влажности 13% говорит о замедлении почвенного метаболизма и снижении способности микроорганизмов к активной деструкции внесенного нефтепродукта при лимитирующем влиянии фактора увлажнения. Наблюдаемая в опыте общая тенденция снижения значения базального дыхания почв с 1 по 12 неделю позволяет судить о скорости истощения субстратного потенциала на фоне других факторов, влияющих на устойчивость микробного сообщества. Сохранение значительной интенсивности выделения СО2 в загрязненных почвах с влажностью 13% определяется устойчивым доступом воздуха в почву с повышенной порозностью аэрации.
14
12
i О 6
2. 4
т
3 6 12
Сроки наблюдения (недели)
■ Загрязненная почва + Pseudomonas (Влажность 2694)
Загрязненная почва + Pseudomonas (Влажность 13%)
Рис. 1. Динамика интенсивности дыхания микроорганизмов дерново-подзолистой почвы при загрязнении дизельным топливом и инокуляции Pseudomonas
3. Скорость базального дыхания микроорганизмов в исследуемой почве
Варианты опыта БД мкг С02/г-час по срокам наблюдения (недели)
1 3 6 12
1 Влажность 26% Незагрязненная почва 3,74 1,94 2,16 1,83
2 Загрязненная почва 1,90±0,37* 1,75±0,30* 3,34±0,75* 0,91±0,17*
3 Незагрязненная почва + Pseudomonas 9,89±1,82* 2,37±0,62* 2,16±0,55* 1,20±0,23*
4 Загрязненная почва + Pseudomonas 9,24±1,68* 10,96±2,20* 12,17±2,28* 5,17±1,00*
5 Влажность 13% Незагрязненная почва 2,29 1,04 1,60 1,65
6 Загрязненная почва 9,58±2,23* 4,72±1,33* 4,78±1,27* 3,30±0,81*
7 Незагрязненная почва + Pseudomonas нд 4,03±1,16* 2,23±0,70* 1,67±1,07*
8 Загрязненная почва + Pseudomonas нд 6,15±1,69* 4,74±1,29* 3,33±0,82*
* - М±5 различие существенные при 99,95% уровне значимости, нд - нет данных.
4. Влияние загрязнения дизтопливом на микроорганизмы, использующие органические формы азота (среда МПА)
Варианты опыта (КОЕ/г) х 107 по срокам
наблюдения (недели)
1 3 5
1 Влажность 26% Незагрязненная почва 4,5 4,2 3,2
2 Загрязненная почва 16,3±9,3* 10,5±5,9* 1,4±0,8*
3 Незагрязненная почва + Pseudomonas 3,0 2,1 9,5
4 Загрязненная почва + Pseudomonas 11,1±6,3* 18,2±10,3* 10,4±5,9*
5 Влажность 13% Незагрязненная почва 3,7 7,3 0,1
6 Загрязненная почва 5,4±3,9* 5,5±4,1* 1,9±1,4*
7 Незагрязненная почва + Pseudomonas 4,7 8,8 2,0
8 Загрязненная почва + Pseudomonas 7,2±5,3* 8,1±5,9* 0,8±0,6*
* - M ±8 различие существенные при 99,95% уровне значимости.
5. Оценка воздействия дизтоплива на устойчивость микробного сообщества почвы по величине микробного метаболического коэффициента (ОК по Ананьевой [7]
QR=БД/СИД QR=БД/СИД Степень
(Qr с дизтопливом / Qr без дизтоп- нарушения
лива)
0,1-0,2 1,0 Отсутствует
0,2-0,3 1-2 Слабая
0,3-0,5 2-5 Средняя
0,5-1,0 5-10 Сильная
> 1,0 > 10 Катастрофическая
Рис. 2. Динамика отношения метаболического коэффициента (Ок) в нефтезагрязненной дерново-подзолистой почве
Для оценки степени нарушения равновесия в микробном сообществе, мы пользовались критериями Н.Д. Ананьевой (табл. 5). Анализ данных опыта (табл. 6) показывает значительное и дифференцирован-
ное влияние дизельного топлива и инокуляции Pseudomonas на состояние и устойчивость микробного сообщества во всех вариантах их внесения.
Степень нарушения почвы оказывается больше при низкой влажности. Наибольшая (катастрофическая) величина микробного метаболического коэффициента Qr была зафиксирована в почве на 3 неделе после внесения дизельного топлива в варианте 6 при влажности 13% (рис. 2). При влажности 26% микробный метаболический коэффициент значительно ниже, что свидетельствует о меньшей степени нарушения почвы, активизации микробиологических процессов, в том числе, и деструкции дизтоплива.
По данным подсчета на МПА (табл. 6) колоний микроорганизмов, использующих органические формы азота, на первой неделе после закладки опыта наблюдалось значительное (в 1,4-3,7 раза) увеличение численности углеводо-родокисляющих микроорганизмов в вариантах опыта с загрязнением и инокуляцией Pseudomonas, что позволяет судить об успешной интродукции биопрепарата в микробное сообщество и активизации действия почвенной микробио-ты, способной использовать дизтопливо в качестве дополнительного источника энергии. В дальнейшем этот показатель плавно снижался к 5 неделе, в связи с истощением субстрата.
Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в вариантах опыта с влажностью 26% значительно больше, чем при влажности 13%, что подтверждает повышение эффективности действия биопрепарата при оптимизации режима влажности на уровне 60% от ПВ. Следует также отметить возможность частного подавления активности и численности микробного сообщества в результате угнетающего действия нефтепродуктов и конкуренции между различными микроорганизмами.
6. Оценка устойчивости микробного сообщества почвы по метаболическому коэффициенту (Ок)
Варианты опыта Сроки наблюдения (недели)
1 3 6 12
1 Влажность 26% Незагрязненная почва 0,30 0,22 0,13 0,62
2 Загрязненная почва 0,22±0,07* 0,27±0,11* 0,20±0,51* 0,17±0,05*
3 Незагрязненная почва + Pseudomonas 0,79±0,14* 0,29±0,10* 0,15±0,05* 0,17±0,06*
4 Загрязненная почва + Pseudomonas 0,51 0,95 0,42 0,40
5 Влажность 13% Незагрязненная почва 0,24 0,27 0,07 0,26
6 Загрязненная почва 0,46±0,15* 1,16±0,36* 0,35±0,12* 0,54±0,22*
7 Незагрязненная почва + Pseudomonas нд 0,63±0,21* 0,13±0,04* 0,22±0,08*
8 Загрязненная почва + Pseudomonas нд 0,96 0,28 0,63
* - M±ó различие существенные при 99,95% уровне значимости, нд - нет данных.
Таким образом, в результате исследований установлено угнетающее действие применяемых концентраций (5%) дизтоплива на исследуемые окультуренные дерново-подзолистые почвы в условиях увлажнения, близким к оптимальным (60% от ПВ), и возможность артефактно значительного повышения биологической активности .загрязненных почв в условиях ограниченного увлажнения. Исследование показало, что приживаемость интродуциро-ванной популяции бактерий р. Pseudomonas во многом зависит от влажности почвы. В частности установлено, что лучшие условия для приживаемости бактерий, внесенных с биопрепаратом, отмечены при режиме влажности 60% от полной влагоем-кости, что соответствует 26% влажности почвы. При влажности почвы, равной 13% (30% от ПВ),
условия увлажнения значительно лимитируют развитие микробиоты, и приживаемость препарата снижается. Успешная интродукция биопрепарата Псевдомин достоверно (в 1,5-5,7раза) повышает скорость базального дыхания окультуренной дерново-подзолистой почвы, диагностируя снятие отрицательного эффекта дизтоплива на почвенную микро-биоту. Биологическая активность загрязненных пахотных горизонтов окультуренной дерново-подзолистой почвы значительно возрастает при ее инокуляции бактериями Pseudomonas putida. В этом случае, внесение нефтепродукта активизирует деятельность углеводородокисляющих микроорганизмов исследуемой окультуренной дерново-подзолистой
почвы.
Литература
1. Керимов С.В., Васенев И.И. Агроэкологическая группировка почв нефтепромыслового района Зых-Говсаны // Достижения науки и техники АПК, 2010, № 9. - С. 17-19.
2. Карасева Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алешина Н.Ю., Карасев С.Г. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью // Биотехнология, 2005, № 2. - С. 67-72.
3. Vasenev V.I., Stoorvogel J.J., Vasenev I.I. Spatial distribution of topsoil and subsoil organic carbon in urban and nonurban areas in Moscow region // Catena. 2013 (in print).
4. Vasenev I.I., Vizirskaya M.M., Vasenev V.I., Valentini R., Raskatova T.V. Comparative analysis of principal factors of spatial-temporal variability of CO2 emission from Moscow urban soils with various levels of anthropogenic impact // Izvestia of Timiryazev Agricultural Academy. 2012, Special Issue. - P. 43-54.
5. Васенев И.И., Бузылев А.В., Курбатова Ю.А. и др. Агроэкологическое моделирование и проектирование. - М.: РГАУ-МСХА, 2010. - 260 с.
6. Почвы Московской области и их использование / Под ред. Л.Л. Шишова и Н.В. Войтович. В 2-х томах. - М.: Почвенный институт им. В.В. Докучаева, 2002, Т. 1. - 500 с.
7. Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивости почв. - М.: Наука, 2003. - 223 с.
