CC BY
0
2024 Т. 54 № 3 / Техника и технология пищевых производств / Food Processing: Techniques and Technology
ISSN2074-9414 (Print) ISSN 2313-1748 (Online)
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2530 https://elibrary.ru/KEDBNI
Оригинальная статья https://fptt.ru
Влияние биологически активных веществ на тепловой и окислительный стресс модельных объектов СаепогИ.аЬй1Ыз еТедапэ
®
А. С. Фролова* , И. С. Милентьева , А. М. Федорова , Б. С. Миллер , С. Л. Лузянин
Кемеровский государственный университет1*®*, Кемерово, Россия
Поступила в редакцию: 26.06.2024 *А. С. Фролова: frolova.anna.s@mail.ru,
Принята после рецензирования: 14.08.2024 https://orcid.org/0000-0003-3988-8521
Принята к публикации: 03.09.2024 И. С. Милентьева: https://orcid.org/0000-0002-3536-562X
А. М. Федорова: https://orcid.org/0000-0002-8071-4411 Е. С. Миллер: https://orcid.org/0000-0002-7538-8076 С. Л. Лузянин: https://orcid.org/0000-0001-9293-4377
© А. С. Фролова, И. С. Милентьева, А. М. Федорова, Е. С. Миллер,
С. Л. Лузянин, 2024
Аннотация.
Большой проблемой современной медицины является предотвращение заболеваний, связанных со старением. Окислительный стресс организма приводит к развитию и прогрессированию различных заболеваний. Активные формы кислорода играют важную роль в осуществлении жизненно важных физиологических процессов. Повышенный уровень активных форм кислорода приводит к стрессу и патологии, но их пониженный уровень способствует нормальному физиологическому состоянию. Исследования адаптогенов растительного происхождения показали многообещающие результаты в отношении стрессоустойчивости и улучшения гомеостаза. С фармакологической точки зрения растительное сырье является подходящим источником химических соединений для лечения различных заболеваний, в том числе вызванных окислительным стрессом.
Объектами исследования являлись биологически активные вещества, выделенные из экстрактов каллусных, суспензионных и корневых культур лекарственных растений: байкалин и транс-коричная кислота из Scutellaria baicalensis; урсоловая кислота из Thymus vulgaris. Провели оценку нейропротекторной активности биологически активных веществ. Изучили их влияние на экспрессию SOD-3 и HSP-16.2, на накопление карбонилированных белков в организме Caenorhabditis elegans. Проанализировали накопление липофусцина в C. elegans в присутствии данных биологически активных веществ. Нейропротекторная активность всех исследованных биологически активных веществ падала с уменьшением их концентрации от 200 до 10 мкмоль/л. C. elegans в большей степени устойчивы к температурному стрессу после предварительной обработки биологически активными веществами. Нематоды более активно экспрессировали SOD-3, по сравнению с HSP-16.2, в ответ на температурный стресс. Биологически активные вещества продемонстрировали снижение уровня карбонилированных белков при концентрациях 100 мкмоль/л. Наибольшее влияние на снижение уровня карбонилиро-вания белков оказала урсоловая кислота. Наиболее эффективным в ингибировании накопления липофусцина оказалась урсоловая кислота в диапазоне всех испытанных концентраций.
Результаты свидетельствуют о том, что изученные биологически активные вещества способствуют снижению окислительного и теплового стресса. Поэтому целесообразно дальнейшее изучение свойств данных биоактивных соединений для использования в адаптогенных препаратах.
Ключевые слова. Биологически активные вещества, растительное сырье, Caenorhabditis elegans, тепловой стресс, окислительный стресс, байкалин, транс-коричная кислота, урсоловая кислота
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «Разработка биологически активных добавок, состоящих из метаболитов растительных объектов in vitro, для защиты населения от преждевременного старения» (проект FZSR-2024-0008) с использованием оборудования ЦКП «Инструментальные методы анализа в области прикладной биотехнологии» на базе КемГУ"011.
Для цитирования: Влияние биологически активных веществ на тепловой и окислительный стресс модельных объектов Caenorhabditis elegans / А. С. Фролова [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2024. Т. 54. № 3. С. 571584. https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2530
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2530 Original article
https://elibrary.ru/KEDBNI Available online at https://fptt.ru/en
Effect of Biologically Active Substances on Thermal and Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans Models
(!)
Anna S. Frolova* , Irina S. Milentyeva , Anastasiya M. Fedorova , Bkaterina S. Miller , Sergey L. Luzyanin
Kemerovo State University^*1, Kemerovo, Russia
Received: 26.06.2024 Anna S. Frolova: frolova.anna.s@mail.ru,
Revised: 14.08.2024 https://orcid.org/0000-0003-3988-8521
Accepted: 03.09.2024 Irina S. Milentyeva: https://orcid.org/0000-0002-3536-562X
Anastasiya M. Fedorova: https://orcid.org/0000-0002-8071-4411 Ekaterina S. Miller: https://orcid.org/0000-0002-7538-8076 Sergey L. Luzyanin: https://orcid.org/0000-0001-9293-4377
© A.S. Frolova, I.S. Milentyeva, A.M. Fedorova, E.S. Miller, S.L. Luzyanin, 2024
Abstract.
Modern medicine strives to prevent age-related diseases. Oxidative stress is associated with development and progression of various diseases. Reactive oxygen species are part of vital physiological processes. High levels of reactive oxygen lead to stress and pathology whereas low ones are associated with healthy physiology. Plant-derived adaptogens demonstrate good results in stress tolerance and homeostasis. Plant materials are a pharmacologically optimal source of chemical compounds to treat various diseases, including those caused by oxidative stress.
The research featured biologically active substances isolated from extracts of callus, suspension, and root cultures of medicinal plants. Baicalin and trans-cinnamic acid were obtained from Scutellaria baicalensis while ursolic acid came from Thymus vulgaris. The biologically active substances were tested for neuroprotective properties, as well as for the impact on the expression of SOD-3 and HSP-16.2. Caenorhabditis elegans served as a model to study the accumulation of carbonylated proteins and lipofuscin.
The neuroprotective activity of all tested substances decreased as their concentration fell from 200 to 10 ^mol/L. C. elegans proved more resistant to thermal stress if pretreated with the biologically active substances. In response to thermal stress, nematodes expressed SOD-3 more actively than HSP-16.2. At 100 ^mol/L, the biologically active substances could reduce the level of carbonylated proteins. Ursolic acid was especially effective against protein carbonylation and lipofuscin accumulation in all concentrations.
Baicalin, trans-cinnamic acid, and ursolic acid made it possible to reduce oxidative and thermal stress, thus demonstrating good prospects for further studies as part of adaptogenic preparations.
Keywords. Biologically active substances, Caenorhabditis elegans, thermal stress, oxidative stress, baicalin, trans-cinnamic acid, ursolic acid
Funding. The research was part of State Assignment FZSR-2024-0008: Biologically active additives with plant metabolites against premature aging: in vitro studies. The experiments were conducted on the premises of the Applied Biotechnology Center for Collective Use, Kemerovo State University"0".
For citation: Frolova AS, Milentyeva IS, Fedorova AM, Miller ES, Luzyanin SL. Effect of Biologically Active Substances on Thermal and Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans Models. Food Processing: Techniques and Technology. 2024; 54(3):571-584. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2530
Введение
Старение сопровождается нарушением регуляции адаптационных процессов. С одной стороны, механизмы физиологической адаптации, такие как обучение и память, пластичность иммунной системы и ремоделирование мышц в зависимости от физических упражнений, притупляются. С другой стороны, с возрастом проявляются заболевания соединитель-
ной ткани и усиливаются некоторые дезадаптивные процессы, включая рак, патологическое ремоделирование сердечно-сосудистой системы и метаболическую дисрегуляцию [1, 2].
Окислительный стресс является важным компонентом, участвующим в развитии и прогрессировании различных заболеваний. Активный кислород, хотя и жизненно важен для нашего организма, наносит
значительный ущерб основным компонентам клеточной системы и нарушает физиологически важные функции белков, липидов, ферментов и дезоксири-бонуклеиновой кислоты, несущих генетический код. Окисление белков способствует модификации каталитической и структурной целостности различных важных белков, что приводит к формированию различных заболеваний, включая диабет, атеросклероз, муковисцидоз и язвенный колит [3].
Первоначально окислительный стресс определялся как нарушение равновесия между прооксидантами и антиоксидантами в биологических системах. Как только появляется этот дисбаланс, клеточные макромолекулы могут быть повреждены преобладающими свободными радикалами. Это приводит к окислительным модификациям генома, белков, структурных углеводов и липидов; в последнем случае происходит перекисное окисление липидов. Оно представляет собой процесс, связанный со свободными радикалами, который в биологических системах может происходить под ферментативным контролем, например, для образования медиаторов воспаления липидного происхождения, или неферментативный процесс. Эта более поздняя форма в основном связана с повреждением клеток в результате окислительного стресса, а при расщеплении гидропероксидов липидов в биологических системах образуется большое разнообразие альдегидов, таких как малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль [4].
Активные формы кислорода играют роль в осуществлении жизненно важных физиологических процессов. Повышенные уровни активных форм кислорода приводят к стрессу и патологии, пониженные уровни активных форм кислорода связаны с нормальными физиологическими состояниями [5, 6]. Окисление клеток предотвращается антиоксидантами, которые присутствуют в организме и играют основную роль в защитном механизме [7]. Антиоксиданты подавляют реакции, вызванные свободными радикалами, и в конечном итоге предотвращают или задерживают повреждение клеток. Антиоксиданты прекращают окислительные цепные реакции, связываясь со свободными радикалами и отдавая им свои электроны, тем самым делая свободные радикалы недоступными для дальнейшей атаки. После отдачи своих электронов антиоксиданты достигают состояния свободных радикалов. Следовательно, они не являются вредными, поскольку обладают способностью адаптироваться к изменениям в электронах, не будучи при этом реактивными [8].
Токсичные активные формы кислорода образуются в результате поступления восстановленного электронами кислорода в митохондрии и способствуют развитию окислительного стресса [9]. Одним из важных белков, каталитически удаляющих 02-, является супероксиддисмутаза (СОД). Супероксид-дисмутаза - это фермент, экспрессируемый геном sod-1-5, который участвует в преобразовании супе-
роксидного анион-радикала в кислород и пероксид водорода. Существует несколько форм супероксид-дисмутазы: СОД-1 (CuZnSOD - гомодимер 32 кДа), СОД-2 (MnSOD - гомотетрамер 96 кДа) и СОД-3 (внеклеточная Cu-Zn - гомотетрамер 135 кДа) [10]. СОД-3 - это гликопротеин, который содержится во внеклеточном матриксе, а также присутствует на поверхности клеток сосудов и в эпителиальных клетках дыхательных путей. Белок закреплен на протеогли-канах гепарина сульфата в гликокаликсе клеточных поверхностей. Экстракт апельсина, содержащий гес-перидин, ванилиновые кислоты, рутин и другие вещества, проверяли на диком штамме Caenorhabditis elegans N2. После 5-дневного воздействия экстрактом в концентрации 200 и 400 мг/мл происходило увеличение уровня активности экспрессии супероксиддисмутаза в 1,7 и 2,9 раза соответственно. В результате транскрипционный анализ показал, что экстракт апельсина активировал экспрессию генов age-1 и daf-16 в пути IIS, генов sek-1 и skn-1 в пути MAPK и генов антиоксидантов, включая SOD-3 и gst-4 [11]. Белок HSP-16.2 является полипептидом, молекулярная масса которого лежит в диапазоне от 12 до 43 кДа. HSP-16.2 относят к классу малых белков теплового шока (sHSP). Белки теплового шока помогают связать неправильно свернутые белки в определенный комплекс sHSP/субстрат. Данная функция помогает изолировать поврежденные белки от других макромолекул. Происходит защита субстрата от деградации. По сравнению с другими классами, при окислительном и тепловом стрессе в первую очередь экспрессиру-ются белки sHSP [12]. В геноме червей C. elegans находится 16 генов, кодирующих 14 sHSP разного рода. Тепловой шок у C. elegans контролируется HSF и факторами транскрипции за счет активации гена HSP-16.2. Этот факт был выявлен в процессе исследования мутагенеза промотера HSP-16.2 [13].
Как продукт окислительного стресса, процесс кар-бонилирования белка, возникающий вследствие нук-леофильной атаки остатков гистидина, лизина и цисте-ина, является чувствительным к сигнальным механизмам, связанным с окислением и восстановлением. Окислительно-восстановительные сигнальные механизмы влияют на аутофагию, пролиферацию клеток, апоптоз и транскрипционный контроль [14]. Процесс является инициирующим фактором митохондриаль-ной дисфункции и стресса, возникающего в эндоплаз-матическом ретикулуме, что показывает механистическую связь между метаболическими болезнями и окислительным стрессом. Процесс образования кар-бонилированных белков является одним из маркеров заболеваний, таких как расстройства Альцгеймера и Паркинсона, диабет, хронические заболевания легких, катарактогенез и других связанных с возрастом болезней [15]. Возникновение патологий происходит, когда увеличивается окислительный стресс и за счет карбонилирования белка накапливается и увеличи-
вается его гидрофобность. Данная физико-химическая модификация, а также неправильное сворачивание белка ведут к выработке агрегатов, имеющих пониженное свойство к деградации [16].
Адаптогены способны ускорять или замедлять ряд функций организма в зависимости от потребностей в данный момент. Исследования адаптогенов растительного происхождения показали многообещающие результаты в отношении стрессоустойчивости и улучшения гомеостаза. Их общими свойствами являются антиоксидантные, ноотропные (которые также известны как эффект улучшения когнитивных функций) и усиление физической выносливости [17]. Обширные исследования лекарственных растений в последние десятилетия предоставили все больше доказательств того, что они проявляют поливалентную неспецифическую фармакологическую активность, влияющую на многие физиологические функции и регуляторные системы человека [18]. Механизм действия адаптогенов связан с осью гипоталамус-гипофиз-надпочечники - функциональной частью нейроэндокринно-иммунного комплекса, известного под общим названием «система стресса». Она регулирует адаптивность, выживаемость и устойчивость организма к стрессу и прогрессированию возрастных нарушений, включая нейродегенеративные заболевания (болезнь Альц-геймера, Паркинсона), атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, метаболические заболевания (диабет 2 типа, ожирение и гипертония), мышечная дегенерация (саркопения), дегенеративные заболевания суставов (остеоартрит), рак и др. [19].
С фармакологической точки зрения растительное сырье является подходящим источником химических соединений для лечения различных заболеваний, в том числе вызванных окислительным стрессом. Антиоксидантная активность растений связана с их химическим составом, а именно наличием биологически активных веществ (полифенолов, витаминов, органических кислот и т.д.). Изучение перспективных биологически активных веществ из растительного сырья актуален для использования при лечении наиболее серьезных заболеваний, в том числе для нормализации окислительно-восстановительного баланса в организме [20, 21].
Для изучения роли окислительного и теплового стресса in vivo использовали C. elegans. Животные C. elegans являются отличной моделью изучения механизмов биологической активности соединений при окислительном стрессе [22]. В организме червя законсервированный сигнальный путь инсулин/инсули-ноподобный фактор роста-1 (IGF-1) контролирует различные метаболические процессы, устойчивость к окислительному стрессу [23]. Данный путь стал основной биологической мишенью при исследовании различных эффектов биологически активных веществ.
Целью данного исследования является изучение влияния биологически активных веществ, выделенных
из экстрактов каллусных, суспензионных и корневых культур лекарственных растений Сибирского федерального округа, на окислительный и тепловой стресс модельных объектов C. elegans.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования в работе являлись:
- Штамм почвенных трансгенных нематод Caenorhabditis elegans CL4176 (dvIs27[myo-3p:A#(1-42):let-851 3'UTR)+rol-6(su1006)], являющийся модельной системой изучения болезни Альцгеймера на нематодах и предоставленный лабораторией разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий, «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)» (Долгопрудный, Россия) [23].
- Штамм Escherichia coli OP50, предоставленный институтом молекулярной биологии имени В. А. Энгель-гардта РАН (Москва, Россия).
- Индивидуальные биологически активные вещества (степень очистки не менее 95 %), выделенные из экстрактов каллусных, суспензионных и корневых культур лекарственных растений Сибирского федерального округа, полученные на предыдущих этапах исследований: байкалин из шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis); транс-коричная кислота из шлемника байкальского (S. baicalensis); урсоловая кислота из тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) [25].
Требования к постановке эксперимента с нематодами. Эксперименты проводили в стандартных условиях, в соответствии с основными рекомендациями по работе с трансгенными нематодами [26]. Популяция взрослых особей C. elegans во всех экспериментах была синхронизирована. Щелочной лизис животных проводили при достижении ими половозрелой стадии развития L4, который в экспериментах составил 72 ч. Эксперименты ставили в 96-луночных планшетах (Эппендорф, США) в жидкой S-среде для культивирования нематод в объеме 150 мкл, при температуре 15 X в климатической камере Binder (Германия). В качестве еды нематод использовали бактерии E. coli ОР-50, которые вносили один раз в начале эксперимента до конечной концентрации 5 мг/мл.
Методика культивирования нематод в жидкой среде. К синхронизованным нематодам в стадии L1, находящимся в S-среде, добавляли ночную бактериальную культуру E. coli OP50, предварительно отмытую от LB-бульона и ресуспендированную в S-среде, до конечной концентрации бактерии 0,5 мг/мл. Вносили по 120 мкл суспензии нематод с бактерией в каждую ячейку 96-луночного планшета, заклеивали планшет пленкой и оставляли на 48 ч на инкубацию при 20 °С. По истечении 48 ч добавляли по 15 мкл 1,2 мМ 5-фтор-2-дезоксиуредин (FUDR) в каждую ячейку планшета для предотвращения репродуктивной функции червей и оставляли на 24 ч при температуре 20 °С до достижения червями стадии L4. Затем добавляли по 15 мкл
тестируемых химических соединений или растительного экстракта в ячейки к нематодам в соответствии со схемой постановки эксперимента.
Методика подготовки биологически активных веществ к работе. Индивидуальные биологически активные вещества растворили в DMSO (ЛенРеактив, Россия) до концентрации 10 ммоль/л. Затем провели титрование каждого биологически активного вещества путем разведения стокового раствора дистиллированной стерильной водой до стоковых концентраций биологически активных веществ 2000, 1000, 500 и 100 мкмоль/л. При изучении нейропротекторной активности биологически активных веществ добавляли по 15 мкл каждого стокового раствора к 135 мкл культивируемых нематод в каждую ячейку 96-луноч-ного планшета в соответствии со схемой постановки эксперимента. Получали рабочую концентрацию тестируемого биологически активного вещества 200, 100, 50 и 10 мкмоль/л соответственно.
Нейропротекторная активность биологически активных веществ в организме С. elegans. Для оценки нейропротекторной активности биологически активных веществ готовили стоковые растворы рутина в диметилсульфоксиде, концентрация раствора составила 200, 100, 50 и 10 мкмоль/л. Нематод распределяли в ячейки планшета, затем добавляли в каждую ячейку по 15 мкл раствора БАВ. Выдерживали планшет 48 ч при температуре 15 °С до достижения нематодами стадии роста L3, затем переносили планшет для инкубирования в термостате при температуре 25 °С для индуцирования экспрессии бета-амилоида Aß(1-42) в мышечных клетках нематод, вызывающих парализацию локомоторной подвижности животных. Проводили мониторинг физиологических изменений, произошедших с мутантными нематодами в условиях индуцирования парализации при температуре 25 °. Подсчет количества парализованных нематод, вели через 18, 40 и 62 ч по методике J. Drake и соавторов [24]. Контрольные нематоды без добавления испытуемых образцов находились в тех же условиях, что и тестируемые соединения. Проводили эксперимент в шестикратной повторности для каждой тестируемой концентрации биологически активных веществ.
Методика оценки влияния индивидуальных БАВ на экспрессию SOD-3 и HSP-16.2 в организме C. elegans. Постановка эксперимента, серия «А» для оценки уровня экспрессии SOD-3 в нематодах. К синхронизованным нематодам в стадии L1, находящимся в S-среде, добавляли ночную бактериальную культуру E. coli 0P50, предварительно отмытую от LB-бульона и ресуспендированную в S-среде, до конечной концентрации бактерий 0,5 мг/мл. Вносили по 900 мкл суспензии нематод стадии L1 с бактериями в каждую ячейку 24-луночного планшета, добавляли по 100 мкл каждого из тестируемых биологически активных веществ и экстрактов лекарственных расте-
ний в ячейку к нематодам, в соответствии со схемой постановки эксперимента, заклеивали планшет пленкой и оставляли на 72 ч при температуре 20 °С до достижения нематодами стадии развития L4, затем переставляли планшет в инкубатор на 35 °С на 5 ч. По истечении 5 ч остужали планшет на льду, переносили испытуемые нематоды в пробирку типа Эппен-дорф, центрифугировали при 1000 g в течение 2 мин., удаляли надосадочную жидкость и немедленно замораживали осадок нематод при температуре -86 °С до времени выделения РНК. Эксперимент проводился с 2-кратным повтором для каждого биологически активного вещества или экстракта с таким расчетом, чтобы получить не менее 1000 нематод для каждого тестируемого условия.
Постановка эксперимента, серия «Б» для оценки уровня экспрессии HSP-16.2 в нематодах. К синхронизованным нематодам в стадии L1, находящимся в S-среде, добавляли ночную бактериальную культуру E. coli OP50, предварительно отмытую от LB-бульона и ресуспендированную в S-среде, до конечной концентрации бактерии 0,5 мг/мл. Вносили по 900 мкл суспензии нематод с бактерией в каждую ячейку 24-луночного планшета и инкубировали 48 ч при температуре 20 °С до достижения нематодами стадии L4. По истечении 48 ч переставляли планшет в инкубатор на 35 °С на 2 ч. По истечении 2 ч остужали планшет до 20 °С, добавляли по 100 мкл биологически активных веществ или экстрактов лекарственных растений в соответствии со схемой постановки эксперимента, продолжали инкубацию нематод в течение 5 суток при температуре 20 °С. После этого переносили испытуемые нематоды в пробирку типа Эппендорф, центрифугировали при 1000 g в течение 2 мин., удаляли надосадочную жидкость и немедленно замораживали осадок нематод при температуре -86 °С до времени выделения РНК. Эксперимент проводили с 2-кратным повтором для каждого экстракта с таким расчетом, чтобы получить не менее 1000 нематод для каждого тестируемого условия.
Методика оценки влияния индивидуальных биологически активных веществ на накопление карбонилированных белков в организме C. elegans. Регистрацию количественных изменений в уровне содержания карбонилированных белков в организме нематод после 5 суток инкубации в присутствии биологически активных веществ проводили на высокопроизводительном, автоматизированном микроскопе ImageXpress Mico XL (Molecular Devices, США), широко используемом для мультипараметрического фе-нотипического скрининга и анализа цифровых изображений объектов в 96-луночных планшетах. Управление процессом съемки и анализа изображений на ImageXpress Mico XL осуществляется через единое программное обеспечение MetaXpress (Molecular Devices, США). Высокоскоростную съемку изображений проводили с использованием сухого объектива с 4-кратным
увеличением в проходящем видимом свете и на канале флуоресцентного красителя Cy3-NHS (коэффициент экстинкции - 150 000 1/моль*см). Для анализа изображений использовали бесплатную программу Cell-Profiler 4.2.1 [27].
Методика измерения накопления липофусцина в присутствии биологически активных веществ. Для измерения накопления липофусцина в организме C. elegans выбран метод спектрофлуориметрического измерения и анализа. Измерения проводились на спектрофотометре BMG Clariostar при 340/420 нм. Автоматически экспортировали результаты измерений в программу Excel. Полученные спектрометрические данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism, версия 9.0.0 (GraphPad Software, Inc., США) с целью получения среднего значения автофлуоресценции липофусцина для шести экспериментальных повторов, а также стандартного отклонения от среднего значения (± SEM). Данные считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и их обсуждение Нейропротекторная активность биологически активных веществ в организме Caenorhabditis е1е-gans. Особенность трансгенного штамма С. elegans СЬ4176 состоит в том, что в геном нематод дикого типа встроен температурно-чувствительный ген бэта-амилоидого пептида АД1-42), экспрессия которого в мышечных клетках при температуре 25 °С вызывает парализацию нормальной локомоторной подвижности животных вследствие нейротоксического действия АД1-42) отложений в мышцах нематод. В ходе выполнения работы были поставлены задачи не только оценить нейропротекторную активность каждого биологически активного вещества в отдельности по сравнению с контрольными нематодами, но также изучить продолжительность защиты парализованных животных от нейротоксичного действия бэта-амилоида Ав(1-42) после обработки биологически активных веществ. Результаты подсчета числа парализованных нематод представлены в таблицах 1-3.
Таблица 1. Среднее число парализованных нематод, шт., в эксперименте по изучению нейропротекторной активности байкалина из Scutellaria baicalensis в организме Caenorhabditis elegans
Table 1. Neuroprotective activity of baicalin from Scutellaria baicalensis in Caenorhabditis elegans: average count of paralyzed
nematodes
Время выдержки, ч Концентрация биологически активных веществ, мкмоль/л Контроль
200 100 50 10
0 11,5 ± 0,3 19,8 ± 0,5 21,0 ± 0,6 18,0 ± 0,5 18,0 ± 0,5
18 0,5 ± 0,1 1,2 ± 0,1 6,0 ± 0,2 5,2 ± 0,2 11,2 ± 0,3
40 0,7 ± 0,1 1,2 ± 0,1 14,5 ± 0,4 3,6 ± 0,1 12,7 ± 0,3
62 2,5 ± 0,1 3,3 ± 0,1 17,5 ± 0,5 2,9 ± 0,1 15,2 ± 0,4
Таблица 2. Среднее число парализованных нематод, шт., в эксперименте по изучению нейропротекторной активности транс-коричной кислоты из Scutellaria baicalensis в организме Caenorhabditis elegans
Table 2. Neuroprotective activity of trans-cinnamic acid from Scutellaria baicalensis in Caenorhabditis elegans: average count
of paralyzed nematodes
Время выдержки, ч Концентрация биологически активных веществ, мкмоль/л Контроль
200 100 50 10
0 17,0 ± 0,4 17,2 ± 0,4 21,5 ± 0,4 14,8 ± 0,3 18,0 ± 0,5
18 2,2 ± 0,1 4,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1 5,8 ± 0,1 11,2 ± 0,3
40 7,5 ± 0,2 7,7 ± 0,2 4,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1 12,7 ± 0,3
62 9,5 ± 0,4 10,5 ± 0,2 10,2 ± 0,2 7,0 ± 0,1 15,2 ± 0,4
Таблица 3. Среднее число парализованных нематод, шт., в эксперименте по изучению нейропротекторной активности урсоловой кислоты из Thymus vulgaris в организме Caenorhabditis elegans
Table 3. Neuroprotective activity of ursolic acid from Thymus vulgaris in Caenorhabditis elegans: average count of paralyzed nematodes
Время выдержки, ч Концентрация биологически активных веществ, мкмоль/л Контроль
200 100 50 10
0 17,5 ± 0,4 20,5 ± 0,4 21,5 ± 0,4 23,8 ± 0,5 18,0 ± 0,5
18 0 0,3 ± 0,1 0,8 ± 0,1 4,8 ± 0,1 11,2 ± 0,3
40 1,0 ± 0,1 2,0 ± 0,1 4,7 ± 0,1 10,0 ± 0,2 12,7 ± 0,3
62 4,0 ± 0,1 3,8 ± 0,1 10,2 ± 0,2 19,3 ± 0,4 15,2 ± 0,4
По окончании эксперимента подсчитывали процент парализованных нематод относительно общего числа животных для каждого тестированного биологически активного вещества в концентрациях 10, 50, 100 и 200 мкмоль/л и сравнивали его с процентом парализованных контрольных нематод, не обработанных биологически активными веществами. Результаты представлены на рисунках 1-3.
Нейропротекторная активность всех испытанных биологически активных веществ является концентра-ционно зависимой. Она падает с умень шением концентрации биологически активных веществ от 200 до 10 мкмоль/л. Показана зависимость продолжительности защиты парализованных нематод в резутьтате нейротоксического действия бэта-амилоидд АД1-42) от длительности инкубации животных в присутствии биологически активных веществ при более высокой температуре 25 °С. Для всех биологически активных веществ нейропротекторная активность снижается при увеличении длительности экспозиции в диатазоне от 18 до 62 часов инкубации.
Наибольшая нейропротекторная активность показана для урсоловой кислоты из T. vulgaris, какдля всего диапазона концентраций от 200 до 10 мкмоль/л, так и при выдерживании от 18 до 62 часов при 25 °С. Урсоловая кислота, единственная из всех испытанных биологически активных веществ, которая при концентрации 200 мкмоль/л полностью ингибирует парализацию нематод при 18-часовой инкубации при температуре 25 °С. Урсоловая кислота единственная из всех испытанных биологически активных веществ проявляет нейропротекторную активность при самой
низкой концентрации 10 мкмоль/л, при которой процент парализованных нематод был в 1,6 раз ниже после 40 ч инкубации при температуре 2 °С, по сравнению с контрольными животными.
Байкалин из X baicalensis по нейропротекторной активности лишь незначительно уступает урсоловой кислоте по количественным показателям значений
1(( -|
ее с а н
и
Р
р
д
в е з и с а а
а &
с
о
н
9( -
7( -У( -
5( -4( -
за -2( -
1( -
й
й
ll
й
2(( 1((
5(
1( Кедсресь
Концентрация биологически активных ееществ, мкмоль/л
18 ч 40 ч 62 ч
Рисунок 2. Нейропротекторная активность транс-коричной кислоты из Scutellaria baicalensis в организме Caenorhabditis elegans
Figure 2. Neuroprotective activity of trans-cinnamic acid from Scutellaria baicalensis in Caenorhabditis elegans
o4
к
о a
е
К
X x
др
дд
a и
е
a
5 ~
Л
6
=
с
H о
s
=T
1(( 1 9( -
7( -ут
5( -4( -3( -2( -1т
Й__.
и
2((
1((
5(
1т
Кедсресь
Кокцектрециябколсвическиактивных веществ, мкмоль/л
18 ч "40 ч "62 ч
к е
а а
К ср
д
а в е и в
с
а
ра
а
п
с
о
о
с и
=т
1(( 9т
7т ут 5(
4т за 2( 1т
I
J 1П J
2((
1((
5(
I
i
1т
Кедсресь
Концентрация биологически активных цеществ,мкмоль/л
18 ч 40 ч 62 ч
Рисунок 1. Нейропротекторная активность байкалина из Scutellaria baicalensis в организме Caenorhabditis elegans
Figure 1. Neuroprotective activity of baicalin from Scutellaria baicalensis in Caenorhabditis elegans
Рисунок 3. Нейропротекторная активность урсоловой кислоты из Thymus vulgarisв организме Caenorhabditis elegans
Figure 3. Neuroprotective activity of ursolic acid from Thymus vulgaris in Caenorhabditis elegans
процентного содержания парализованных нематод в диапазоне концентраций от 200 до 50 мкмоль/л за короткий период инкубации. Байкалин существенно превосходит все испытанные биологически активные вещества по продолжительности защиты от нейротоксического действия АД1-42), включая 62-часовую инкубацию.
Испытания транс-коричной кислоты из S. baicalen-sis продемонстрировали их нейропротекторную активность, по сравнению с контрольными нематодами. Процент парализованных нематод в присутствии этого биологически активного вещества существенно ниже, чем у контрольных животных, как в диапазоне концентраций 200-50 мкмоль/л, так во всем диапазоне времени 18-62-часовой инкубации. При 10 мкмоль/л концентрации биологически активных веществ нейропро-текция наблюдалась лишь при 18-часовой инкубации.
При исследовании влияния на продолжительность жизни природного тритерпеноида, урсоловой кислоты на C. Elegans, H. Negi и соавторы определили, что максимальная продолжительность жизни наблюдается у нематод при концентрации биоло гически активных веществ 25 мкмоль [28]. Z. Yue и соавторы получили экстракт Cornus officinalis, богатый урсоловой кислотой [29]. Данный экстракт исследовали на модельном объекте C. elegans. Результаты показали, что экстракт C. officinalis может увеличить продолжительность жизни и усилить антиоксидантную ферментативную активность C. elegans, подвергшихся воздействию ультрафиолета B, при одновременном снижении уровня активных форм кислорода. Экстракт C. officinalis в основном смягчает окислительный стресс, вызванный УФ-B у C. elegans через путь SKN-1/Nrf2.
X.-K. Tu и др. установили, что байкалин из S. bai-calensis Georgi обладает нейропротекторной активностью за счет антиапоптотических и противовоспалительных свойств [30]. Байкалин значительно снизил ферментативную активность миелопероксидазы и экспрессию мРНК индуцибельной сивтазы оксида азота и мРНК циклооксигеназы-2 в мозге крысы, он также значительно ингибировал нейронакьный апоп-тоз и экспрессию расщепленного белка каспазы-3 после постоянной окклюзии средней мозговой артерии.
Анализ влияния индивидуальных (зиклогически активных веществ на экспрессию белков SOD-3 и HSP-16.2 в нематодах. Экспрессия гена SOD-3 в нематодах, обработанных биологичесли активных веществ в течение 72 ч до приведения животных в состояние стресса. Продукты амплификации ллнов в полимеразной цепной реакции в режиме иттльногт времени составили 175 нп. Подход представляет собой оценку профилактического действия тестируемых биологически активных веществ, когда нематоды предварительно инкубировались с веществами в течение 72 ч, и только после этого подвергались стрессу путем поднятия температуры до 35 °С в течение 5 ч. Результаты подсчета уровня экспрессии гена SOD-3 в нематодах представлены на рисунке 4.
Экспрессия гена Н8Р-16.2 в нематодах, обработанных биологически активными веществами в течение 5 суток после приведения животных в состояние стресса. Продукты амплификации генов в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени составили 127 нп. Подход представляет собой оценку терапевтического действия тестируемых биологически активных веществ, при котором нематоды первоначально подвергались стрессу путем поднятия температуры до 35 X в течение 2 ч, и только после этого они инкубировались с биологически активными веществами в течение 5 суток. Результаты подсчета уровня экспрессии гена ЖР-16.2 в нематодах представлены на рисунке 5.
Q О м к S о о 1)
р
п с к
m
3,0
2,5
2,0 -
е,5
е,л -
0,5
I
и
I
ел
50
ело
200
Клнтрлвн
внововттттттттлтлвлвнвновнововКонцентрация биологически активных веществ,мкмоль/л
I Байтввин □ Транм-тлричная тимвлта ■ Урмлвлвая тимвлта
Рисунок 4. Влияние индивидуальных биологически активных веществ на экспрессию белка SOD-3 у Caenorhabditis elegans
Figure 4. Effect of biologically active substances on SOD-3 protein in Caenorhabditis elegans
Q О
S я и
и
р
п с к
m
1,8 1,6 1,4 -1,2 -
1,0 0,8 -0,6 0,4 0,2 0
I
D
.-'
10 50 100 200 Контроль
вововттттттттлтлвлвьвововоКонцентрация биологически активных веществ,мкмоль/л
I Байтавин □ Транм-тлричная тимвлта ■ Урмлвлвая тимвлта
Рисунок 5. Влияние биологически активных веществ на экспрессию белка HSP-16.2 у Caenorhabditis elegans
Figure 5. Effect of biologically active substances on HSP-16.2 protein in Caenorhabditis elegans
0
В ходе проведенных испытаний по изучению влияния индивидуальных биологически активных веществ в концентрациях 10, 50, 100 и 200 мкмоль/л на экспрессию SOD-3 и ЖР-16.2 в организме С. elegans установили, что нематоды в большей степени устойчивы к температурному стрессу, если они предварительно обработаны биологически активными веществами. Обнаружено значительно меньшее количество умерших животных, в этом случае, к концу эксперимента, по сравнению с даже более длительной инкубацией нематод в присутствии биологически активных веществ, обработанных после повышения температуры.
Нематоды более активно экспрессируют SOD-3, по сравнению с ЖР-16.2, в ответ на температурный стресс, увеличивая уровень экспрессии 80Б-3 с 1,7-и до 2,1- кратных размеров, по сравнению с увеличением экспрессии ЖР-16.2 от 1,5 до 1,6 раз.
Урсоловая кислота в 1,75-1,93 раза увеличивает концентрацию S0D-3 при 100 и 200 мкмоль/л соответственно. Транс-коричная кислота в 2 раза увеличивает концентрацию S0D-3 при 200 мкмоль/л. Байкалин не влиял на экспрессию S0D-3 ни при каких испытуемых концентрациях.
Урсоловая кислота увеличила экспрессию ЖР-16.2 при 10 мкмоль/мл в 1,6 раз, по сравнению с контролем. Байкалин при 10 мкмоль/мл увеличили экспрессию ЖР-16.2 в 1,5 раза. Транс-коричная кислота не влияла на экспрессию ЖР-16.2 ни при каких испытуемых концентрациях.
Н. Li и соавторы определили, что тепловой стресс (41 °С) вызывает макроскопические изменения в ткани матки мышей, изменяет активность антиоксидантных ферментов и факторы пути Кеар1/Мй2 [31]. Байкалин уменьшает макроскопические изменения, меняет активность антиоксидантных ферментов и факторы в пути Кеар1/№12. Защищает ткань матки от окисли-
тельных повреждений/апоптоза, вызванных тепловым стрессом, через путь Keap1/Nrf2.
В работе Yi. Yang и соавторы установили, что предварительная обработка урсоловой кислотой защищает легочные ткани от повреждения, вызванного тепловым стрессом, путем регулирования воспалительных цитокинов и развернутого ответа белка у мышей [32]. Добавление урсоловой кислоты может стать терапевтической стратегией для смягчения повреждений легких, вызванных высокой температурой, у людей и животных.
Влияние индивидуальных биологически активных веществ на накопление карбонилированных белков в организме C. elegans. После облучения нематод в 24-луночных планшетах в течение 5 мин. ультрафиолетовым светом при длине волны 314 нм планшет с нематодами перенесли в инкубатор на 1 ч при 20 °С. В ходе наблюдения за нематодами под микроскопом по истечении 1 ч обнаружено, что локомоторная подвижность нематод существенно снизилась, однако при этом большинство C. elegans оставались живыми. С окрашенных нематод в 96-луночном планшете сделаны снимки, для количественной оценки флуоресценции карбонилированных белков в их организме взяты не все нематоды. После предварительной обработки изображений с помощью программы Cell-Profiler 4.2.1 проведена корректировка их количества. Затем проведены преобразования изображений нематод в цифровые значения медианной интенсивности флуоресценции карбонилированных белков. На основании полученных данных, построены гистограммы медианной интенсивности карбонилированных белков в организме нематод при каждом тестируемом условии испытания, в сравнении с контролем. Данные представлены на рисунке 6.
В ходе проведенных испытаний по изучению влияния индивидуальных биологически активных веществ
х х I X
й а
У § § &
я В ^ §вт вй 2
X
В л ' ' в S и ^ о В й В ^ й и
вю
и
ft
о
^
30
25
20
15
10
Положительный контроль
Отрицательный контроль
Концентрациябиологическиактивныхвеществ,мкмоль/л I Байкалин □ Транс-коричная кислота ■ Урсоловая кислота
Рисунок 6. Влияние биологически активных веществ на накопление карбонилированных белков в организме
Caenorhabditis elegans
Figure 6. Effect of biologically active substances on carbonylated proteins in Caenorhabditis elegans
в концентрациях 10, 50, 100 и 200 мкмоль/л на накопление карбонилированных белков в организме C. ele-gans установлено, что активность всех испытанных биологически активных веществ является концентра-ционно зависимой, при этом для всех биологически активных веществах она различна. Все протестированные биологически активные вещества продемонстрировали снижение уровня карбонилированных белков при концентрациях 100 мкмоль/л.
Наибольшее влияние на снижение уровня карбони-лирования белков в теле нематод, по сравнению с контролем оказала урсоловая кислота. Она снижала уровень карбонилированных белков в 1,6 (50 мкмоль/л) и 1,8 (100 мкмоль/л) раза. Это единственные биологически активные вещества, которые влияют на снижение уровня карбонилирования белков при концентрации 200 мкмоль/л (в 1,1 раза). При концентрации 10 мкмоль/л наибольшее влияние оказала транс-коричная кислота (снижение уровня в 1,6 раза). Байкалин продемонстрировал умеренное снижение уровня карбонилированных белков, не превышающее в 1,3 раз уровня в контрольных нематодах. При этом биологически активные вещества проявляли свою активность в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкмоль/л.
Уровень снижения карбонилированных белков под влиянием урсоловой кислоты в концентрации 100 мкмоль/л сравним с уровнем блокирования реакции карбонилирования белков в присутствии положительного контроля - 0,2 М борогидрида натрия (ЫаВНД который специфически связывается только с карбонильной группой у белков, демонстрируя высокую избирательность взаимодействия урсоловой кислоты с карбонилированными белками в теле нематод.
В работе Р. М. ЛЪйоу с соавторами установили, что при введении внутрибрюшинно крысам в дозе 15 мг/кг массы тела байкалин повышает содержание восстановленного глутатиона в печени здоровых животных и активность глутатионсинтетазы и глюкозо-6-фосфодегидрогеназы в печени и почках в условиях окислительного стресса под действием различных токсикантов [33].
Нейропротекторное действие урсоловой кислоты против окислительного повреждения исследовали на изолированном мозге крысы учеными V. F. Salau и др. [34]. Исследования молекулярной стыковки выявили сильные молекулярные взаимодействия между урсоловой кислотой, каталазой и АТФазой. Эти результаты указывают на нейропротекторный эффект урсо-ловой кислоты против окислительного повреждения изолированного мозга крыс, что подтверждается ее способностью смягчать окислительный стресс, пури-нергические и холинергические дисфункции с сопутствующим подавлением протеолитической активности.
Влияние индивидуальных биологически активных веществ в концентрациях 10, 50, 100 и 200 мкмоль/л на накопление липофусцина в организме С. в^ат. В ходе выполнения исследования
поставлены задачи не только оценить влияние каждого отдельно взятого биологически активного вещества по сравнению с контрольными нематодами на накопление липофусцина в организме нематод, но также изучить эффективность этого влияния в течение продолжительной 15-дневной инкубации с биологически активными веществами. Выбраны 5-дневные интервалы спектрометрических измерений липофусцина. Перед началом спектрометрических измерений подсчитывали общее количество животных в каждой ячейке 96-луночного планшета. Полученные спектрометрические данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism с целью получения среднего значения автофлуоресценции липофусцина для шести экспериментальных повторов.
На основании исходных данных автофлуоресценции в теле нематод проводился подсчет разницы флуо-оресценции в каждый конкретный день спектрометрических измерений за вычетом значений флуоресценции на первый день измерений в тех же условиях. На основании полученных расчетных данных с использованием программы Microsoft Excel LTSC 2021 строились графики разницы в накоплении липофусцина в зависимости от продолжительности эксперимента, которые представлены на рисунках 7-9.
В ходе проведенных испытаний по изучению влияния индивидуальных биологически активных веществ в концентрациях 10, 50, 100 и 200 мкмоль/л на накопление липофусцина в организме C. elegans установлено, что накопление липофусцина под влиянием всех испытанных биологически активных веществ
н и
э
о о^
■о
С! Ci
s
С
s s п и к с
С!
s
al
ц
С РТ
s
к а
s
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
1 5 10 15
Продолжительность исследования, день
■200 мкмоль/л 10 мкмоль/л
100 мкмоль/л Контроль
50 мкмоль/л
Рисунок 7. Разница в накоплении липофусцина в организме Caenorhabditis elegansпод действием байкалина на протяжении эксперимента по отношению к первому дню измерений
Figure 7. Lipofuscin accumulation in Caenorhabditis elegans during baicalin treatment: experiment days 1-15
1 5 10 15
Продолжительность исследования, день
200 мкмоль/л 10 мкмоль/л
100 мкмоль/л Контроль
50 мкмоль/л
1 5 10 15
Продолжительность исследования,день
■200 мкмоль/л 10 мкмоль/л
100 мкмоль/л Контроль
50 мкмоль/л
Рисунок 8. Разница в накоплении липофусцина в организме Caenorhabditis elegans под действием транс-коричной кислоты на протяжении эксперимента по отношению к первому дню измерений
Figure 8. Lipofuscin accumulation in Caenorhabditis elegans during treatment with trans-cinnamic acid: experiment days 1-15
Рисунок 9. Разница в накоплении липофусцина в организме Caenorhabditis elegans под действием урсоловой кислоты на протяжении эксперимента по отношению к первому дню измерений
Figure 9. Lipofuscin accumulation in Caenorhabditis elegans during treatment with ursolic acid: experiment days 1-15
является концентрационно зависимым. Байкалин (100 и 200 мкмоль/л) продемонстрировал уменьшение накопления липофусцина уже на 5-й день после добавления к нематодам. Биологически активные вещества стабильно сдерживали накопление липофусцина в нематодах до конца 15-дневного эксперимента. Транскоричная кислота наиболее эффективно снижает накопление липофусцина при низких концентрациях, а именно на 68,3 % при 50 мкмоль/л и на 58,2 % при 10 мкмоль/л на 15-й день измерений флуоресценции. Наиболее эффективным в ингибировании накопления липофусцина оказалась урсоловая кислота как на протяжении всего 15-дневного эксперимента, так и в диапазоне всех испытанных концентраций. Наибольшие значения в разнице накопления липофусцина по отношению к начальным значениям через 1 день после обработки биологически активными веществами показаны для его концентрации 50 мкмоль/л. Урсоловая кислова в теле нематод приводит к уменьшению накопления жира и уменьшению количества активных форм кислорода, независимо от активации супероксиддисмутазы.
В работе В. Г. Банзаракшеева исследовали комплексное фитосредство на показатели перекислого окисления липидов [35]. Данное фитосредство включает: цветки Calendula officinalis L., плоды Crataegus sanguínea Pall., корни Scutellaria baicalensis Georgi, плоды Malus baccata (L.) Borkh., корневища Glycyr-rhiza glabra L., цветки и плоды Rosa sp., слоевище Cetraria islandica (L.) Ach. и др. Фитосредство на фоне введения адреналина, вызывающего расстройства уг-
леводного и липидного метаболизма, ингибирует процессы перекисного окисления липидов и повышает эндогенные резервы антиоксидантной защиты у крыс.
S. Tang и соавторы изучали эффект урсоловой кислоты против ожирения у крыс [36]. Для этого пе-рорально вводили дозу урсоловой кислоты (2,5, 5 и 10 мг/кг) крысам с гипергликемией в течение 8 недель и оценивали уровень глюкозы в крови через различные промежутки времени. У крыс, получавших урсоловую кислоту, наблюдалось снижение окислительного стресса в обработанной ткани поджелудочной железы за счет восстановления эффекта удаления свободных радикалов.
Выводы
Нейропротекторная активность всех испытанных биологически активных веществ падала с уменьшением их концентрации от 200 до 10 мкмоль/л. Показана зависимость продолжительности защиты парализованных нематод в результате нейротоксического действия бэта-амилоида Aß(1-42) от длительности инкубации животных в присутствии биологически активных веществ при более высокой температуре 25 °С. Для всех изученных биологически активных веществ она уменьшалась при увеличении длительности экспозиции в диапазоне от 18 до 62 часов инкубации.
Caenorhabditis elegans в большей степени устойчивы к температурному стрессу, если они предварительно обработаны биологически активными веществами. Обнаружено значительно меньшее количество умерших животных, в этом случае, к концу экспери-
мента, по сравнению с длительной инкубацией нематод в присутствии биологически активных веществ, обработанных после повышения температуры. Нематоды более активно экспрессируют SOD-3, по сравнению с HSP-16.2, в ответ на температурный стресс, увеличивая уровень экспрессии SOD-3 с 1,7- и до 2,1-кратных размеров, по сравнению с увеличением экспрессии HSP-16.2 от 1,5 до 1,6 раз.
Все протестированные биологически активные вещества продемонстрировали снижение уровня карбонилированных белков при концентрациях 100 мкмоль/л. Наибольшее влияние на снижение уровня карбонили-рования белков в теле нематод, по сравнению с контролем оказала урсоловая кислота. Уровень снижения карбонилированных белков под влиянием урсоловой кислоты в концентрации 100 мкмоль/л сравним с уровнем блокирования реакции карбонилирования белков в присутствии положительного контроля - 0,2 M борогидрида натрия (NaBH4), который специфически связывается только с карбонильной группой у белков, демонстрируя высокую избирательность взаимодействия урсоловой кислоты с карбонилированными белками в теле нематод.
Накопление липофусцина под влиянием всех испытанных биологически активных веществ, выделенных
из лекарственных растений, является концентрационно зависимым. Байкалин продемонстрировал уменьшение накопления липофусцина уже на 5-й день после добавления к нематодам. Наиболее эффективным в ингиби-ровании накопления липофусцина оказалась урсоловая кислота как на протяжении всего 15-дневного эксперимента, так и в диапазоне всех испытанных концентраций.
Критерии авторства
Все авторы внесли равный вклад в исследование и несут равную ответственность за информацию, опубликованную в данной статье.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution
All authors have contributed equally to the study and are equally responsible for the information published in this article.
Conflict of interest
The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this article.
References/Список литературы
1. Lissek T. Aging, adaptation and maladaptation. Frontiers in Aging. 2023;4:1256844. https://doi.org/10.3389%2 Ffragi.2023.1256844
2. Sukhikh S, Babich O, Prosekov A, Patyukov N, Ivanova S. Future of Chondroprotectors in the Treatment of Degenerative Processes of Connective Tissue. Pharmaceuticals. 2020;13(9):220. https://doi.org/10.3390/ph13090220
3. Milentyeva IS, Le VM, Kozlova OV, Velichkovich NS, Fedorova AM, Loseva AI, et al. Secondary metabolites in in vitro cultures of Siberian medicinal plants: Content, antioxidant properties, and antimicrobial characteristics. Foods and Raw Materials. 2021;9(1):153-163. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2021-1-153-163; https://elibrary.ru/ORGCXI
4. Chakraborty A, Chowdhury S, Bhattacharyya M. Effect of metformin on oxidative stress, nitrosative stress and inflammatory biomarkers in type 2 diabetes patients. Diabetes Research and Clinical Practice. 2011;93(1):56-62. https:// doi.org/10.1016/j.diabres.2010.11.030
5. Danyo EK, Ivantsova MN, Selezneva IS. Ionizing radiation effects on microorganisms and its applications in the food industry. Foods and Raw Materials. 2024;12(1):1-12. http://doi.org/10.21603/2308-4057-2024-1-583; https://elibrary. ru/XICYHK
6. Bodega G, Alique M, Puebla L, Carracedo J, Ramirez R. Microvesicles: ROS scavengers and ROS producers. Journal of Extracellular Vesicles. 2019;8(1):1626654. https://doi.org/10.1080/20013078.2019.1626654
7. Suleman M, Khan A, Baqi A, Kakar MS, Samiullah, Ayub M. Antioxidants, its role in preventing free radicals and infectious diseases in human body. Pure and Applied Biology. 2019;8(1):380-388. http://doi.org/10.19045/bspab.2018.700197
8. Okpoghono J, Ukperegbulem JK, Igue UB. Anti-lipidemic and protein restoration potential of Monodora myristica (Gaertn.) in rats fed with cassava containing crude oil. Foods and Raw Materials. 2024;12(2):249-255. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2024-2-602; https://elibrary.ru/LDHZWE
9. Yanase S, Yasuda K, Ishii N. Interaction between the ins/IGF-1 and p38 MAPK signaling pathways in molecular compensation of sod genes and modulation related to intracellular ROS levels in C. elegans. Biochemistry and Biophysics Reports. 2020;23:100796. https://doi.org/10.1016Zj.bbrep.2020.100796
10. Thimraj TA, George L, Asrafuzzaman S, Upadhyay S, Ganguly K. Oxidative signaling in chronic obstructive airway diseases. In: Chatterjee S, Jungraithmayr W, Bagchi D, editors. Immunity and Inflammation in Health and Disease. Academic Press; 2018. pp. 79-98. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-805417-8.00007-X
11. Wang J, Deng N, Wang H, Li T, Chen L, Zheng B, et al. Effects of orange extracts on longevity, healthspan, and stress resistance in Caenorhabditis elegans. Molecules. 2020;25(2):351. https://doi.org/10.3390/molecules25020351
12. Milentyeva IS, Vesnina AD, Fedorova AM, Ostapova EV, Larichev TA. Chlorogenic Acid and Biohanin A from Trifolium pratense L. Callus Culture Extract: Functional Activity In Vivo. Food Processing: Techniques and Technology. 2023; 53(4):754-765. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-4-2475; https://elibrary.ru/GGYCQG
13. Funikov SYu, Garbuz DG, Zatsepina OG. Kinetics of heat-shock response upon dysfunction of general transcription factor (HSF). Molecular Biology. 2014;48(2):263-269. https://doi.org/10.1134/S0026893314020058
14. Malik P, Mukherjee TK. Immunological methods for the determination of AGE-RAGE axis generated glutathi-onylated and carbonylated proteins as oxidative stress markers. Methods. 2022;203:354-363. https://doi.org/10.1016/). ymeth.2022.01.011
15. Kuzmic M, Javot H, Bonzom J-M, Lecomte-Pradines C, Radman M, Garnier-Laplace J, et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 2016;101:465-474. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.11.004
16. Chondrogianni N, Georgila K, Kourtis N, Tavernarakis N, Efstathios SG. Enhanced proteasome degradation extends Caenorhabditis elegans lifespan and alleviates aggregation-related pathologies. Free Radical Biology and Medicine. 2014;75:S18. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2014.10.632
17. Amir M, Vohra M, Raj RG, Osoro I, Sharma A. Adaptogenic herbs: A natural way to improve athletic performance. Health Sciences Review. 2023;7:100092. https://doi.org/10.1016/j.hsr.2023.100092
18. Kumar S, Singh B, Bajpai V. Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees: Traditional uses, phytochemistry, pharmacological properties and quality control/quality assurance. Journal of Ethnopharmacology. 2021;275:114054. https://doi.org/10.1016/j. jep.2021.114054
19. Yoon SJ, Kim SK, Lee NYo, Choi YeR, Kim HS, Gupta H, et al. Effect of Korean Red Ginseng on metabolic syndrome. Journal of Ginseng Research. 2021;45(3):380-389. https://doi.org/10.1016/j.jgr.2020.11.002
20. Babich O, Sukhikh S, Pungin A, Ivanova S, Asyakina L, Prosekov A. Modern Trends in the In Vitro Production and Use of Callus, Suspension Cells and Root Cultures of Medicinal Plants. Molecules. 2020;25(24):5805. https://doi.org/10.3390/ molecules25245805
21. Sergeeva IY, Permyakova LV, Mukhlynina ЕА, Anshukov AV. Influence of Trypsin Hydrolysate of Yeast, Activated with Atriplex sibirica L. Extract, on Cytotoxicity and Accumulation of Vitamin D. Biotekhnologiya. 2023;39(6):108-118. https://doi.org/10.56304/S0234275823060091; https://elibrary.ru/YUBXLW
22. Fedorova AM, Dyshlyuk LS, Milentyeva IS, Loseva AI, Neverova OA, Khelef MEA. Geroprotective activity of trans-cinnamic acid isolated from the Baikal skullcap (Scutellaria baicalensis). Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):582-591. https://doi.org/10.21603/2074-9414-2022-3-2388
23. Altintas O, Park S, Lee S-JV. The role of insulin/IGF-1 signaling in the longevity of model invertebrates, C. elegans and D. melanogaster. BMB reports. 2016;49(2):81-92. https://doi.org/10.5483/bmbrep.2016.49.2.261
24. Drake J, Link CD, Butterfield DA. Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model. Neurobiology of Aging. 2003;24(3):415-420. https://doi. org/10.1016/S0197-4580(02)00225-7
25. Faskhutdinova ER, Sukhikh AS, Le VM, Minina VI, Khelef MEA, Loseva AI. Effects of bioactive substances isolated from Siberian medicinal plants on the lifespan of Caenorhabditis elegans. Foods and Raw Materials. 2022;10(2):340-352. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2022-2-544; https://elibrary.ru/ZVCUUW
26. Meneely PM, Dahlberg CL, Rose JK. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 2019;19(1):e35. https://doi.org/10.1002/cpet.35
27. Tseverelakis GJ, Megalou EV, Filippidis G, Petanidou B, Fotakis C, Tavernarakis N. Label-free imaging of lipids depositions in C. elegans using third-harmonic generation microscopy. PLOS One. 2014;9(1):e84431. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0084431
28. Negi H, Saikia SK, Pandey R. 3ß-Hydroxy-urs-12-en-28-oic Acid Modulates Dietary Restriction Mediated Longevity and Ameliorates Toxic Protein Aggregation in C. elegans. The Journals of Gerontology: Series A. 2017;72(12):1614-1619. https://doi.org/10.1093/gerona/glx118
29. Yue Z, Liu H, Liu M, Wang N, Ye L, Guo C, et al. Cornus officinalis Extract Enriched with Ursolic Acid Ameliorates UVB-Induced Photoaging in Caenorhabditis elegans. Molecules. 2024;29(12):2718. https://doi.org/10.3390/ molecules29122718
30. Tu X-k, Yang W-z, Shi S-s, Wang C-h, Chen C-m. Neuroprotective effect of baicalin in a rat model of permanent focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 2009;34:1626-1634. https://doi.org/10.1007/s11064-009-9953-4
31. Li H, Cong X, Yu W, Jiang Z, Fu K, Cao R, et al. Baicalin inhibits oxidative injures of mouse uterine tissue induced by acute heat stress through activating the Keap1/Nrf2 signaling pathway. Research in Veterinary Science. 2022;152:717-725. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2022.10.005
32. Yang Yi, Li C, Liu N, Wang M, Zhou X, Kim IH, et al. Ursolic acid alleviates heat stress-induced lung injury by regulating endoplasmic reticulum stress signaling in mice. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2021;89:108557. https:// doi.org/10.1016/j.jnutbio.2020.108557
33. Abilov PM, Iriskulov BU, Boboeva ZN, Saydalikhodjaeva OZ. Analysis of the effectiveness of the use of a new drug based on Ganoderma lucidum and Alkhadai in the treatment of coronavirus infection caused by COVID-19. Journal of Hunan University (Natural Sciences). 2022;49(3):604-611.
34. Salau VF, Erukainure OL, Ayeni G, Ibeji CU, Islam MdS. Modulatory effect of ursolic acid on neurodegenerative activities in oxidative brain injury: An ex vivo study. Journal of Food Biochemistry. 2021;45:e13597. https://doi.org/10.1111/ jfbc.13597
35. Banzaraksheev VG. The influence of the complex phytoremedy on the indicators of lipid peroxidation and antioxidant protection in adrenalininduced dyslipoproteinemias. Bashkortostan Medical Journal. 2012;7(5):72-74. (In Russ.). [Банзаракшеев В. Г. Влияние комплексного фитосредства на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при адреналиновой дислипопротеинемии // Медицинский вестник Башкортостана. 2012. Т. 7. № 5. С. 72-74.]. https://elibrary.ru/PLLIPJ
36. Tang S, Fang C, Liu Yu, Tang L, Xu Yu. Anti-obesity and Anti-diabetic Effect of Ursolic Acid against Streptozotocin/ High Fat Induced Obese in Diabetic Rats. Journal of Oleo Science. 2022;71(2):289-300. https://doi.org/10.5650/jos.ess21258
