CC BY
39
Ind. Pharm. - 1996. - Vol. 22. - P. 1139 - 1144.
8. Lien E. J, Gan H. QSAR analysis of skin permeability of various drugs in man as compared to in vivo and in vitro studies in rodents // Pharm. Res. — Vol. 12. - P. 583 - 587.
9. Patrick. Selenium biochemistry and cancer: A revive of the literature// Alter. Med. Rev. - 2004. - Vol. 9 (3). -Р. 239 - 258.
10. Pulat M, Abbasoglu U. Water and antimicrobial agent permetation of PU and PHEMA membranes in relation to their surface and bulk properties // J. Biomater. Appl. - 1995. - Vol. 9. - P. 363 - 371.
11. Sarpotdar P. P., Gaskill J. L, Giannini R. P Effect of polyethylene glycol 400 on the penetration of drugs through human skin in vitro// J. Pharm. Sci. — 1986. — Vol. 75. — P. 26 — 28.
12. Sieh Hearam, Jun H.W. Effectiveness and mode of action of isopropyl myristate as a permeation enhancer for naproxen throught shed snake skin // J. Pharm. Sci. — 1996. — Vol. 48. — P. 812 — 816.
13. Thomas T, West I. et al. Modification of erythrocyte Na+ / Li+ countertransport kinetics by two types of thiol group// Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1235. — P. 317 — 322.
УДК616.36-001 - 003.93 - -003.92-092.9: 615.27
ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕПАТОЦИТОВ ПЛОДОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ПЕЧЕНИ
Любовь Петровна Романова, Игорь Иванович Малышев*
Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, г. Чебоксары
Реферат
Цель. Изучение пролиферативной активности гепатоцитов плодов и новорожденных крысят после механической травмы печени.
Методы. Применялись гистологический, морфометрический и статистический методы. С помощью оригинальной методики стальной иглой плодам крыс наносилась внутриутробная механическая травма печени.
Результаты. Морфологическое изучение заживления показало, что у подопытных животных, получавших биологически активные вещества «Трепел» и «Сувар», воспалительная реакция вокруг очага травмы была выражена в значительно меньшей степени, а образование соединительной ткани на месте погибшей ткани было более замедленным, чем у контрольных крысят. Подсчёт числа митозов и двуядерных гепатоцитов установил их значительное увеличение у животных подопытной группы; при этом активация пролиферации гепатоцитов протекала на фоне полиплоидизации гепатоцитов и увеличения числа двуядрышковых гепатоцитов, что свидетельствовало об усилении белок-синтетической функции печёночных клеток.
Выводы. Биологически активные вещества «Трепел» и «Сувар» снижают реактивно-воспалительные изменения вокруг очага травмы, тормозят коллагенообразование и одновременно активизируют пролиферацию гепатоцитов. Это приводит к тому, что у подопытных животных активно делящиеся гепатоциты механически сдавливают участок и уменьшают его размеры, при этом развивающаяся соединительная ткань заполняет лишь незначительную часть зоны повреждения. У контрольных животных воспалительная реакция преобладает над пролиферацией гепатоцитов, в результате этого участок травмы на большем протяжении замещается соединительной тканью. Активизация биологически активными веществами «Трепел» и «Сувар» пролиферативной активности гепатоци-тов способствует более полноценному восстановлению печёночной ткани.
Ключевые слова: плоды и новорожденные крысята, механическая травма печени, биологически активные вещества, гепатоциты, пролиферация.
THE INFLUENCE OF BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF HEPATOCYTES OF THE FETUSES AND NEONATAL RATS AFTER MECHANICAL LIVER INJURY. L.P. Romanova, I.I. Malyshev. Chuvash State University named after I.N. Ulyanov, Cheboksary city. Aim. To study the proliferative activity of hepatocytes of fetuses and newborn rats after mechanical liver injury. Methods. Used were histological, morphometric and statistical methods. An original technique of applying intrauterine mechanical liver injury to the rat fetus with a steel needle was used. Results. Morphological study of wound healing showed that in the experimental animals treated with biologically active substances «Trepel» and «Suvar» the inflammatory reaction around the focus of injury was expressed to a much lesser degree, and the formation of connective tissue in place of the necrotized tissue was more sustained than such of the control rats. Calculation of the number of mitoses and binucleated hepatocytes showed their significant increase in the animals of the experimental group; at the same time the activation of proliferation of hepatocytes was accompanied by polyploidization of hepatocytes and increase in the number of binucleated hepatocytes, which indicated the increase in the protein-synthetic function of the liver cells. Conclusions. Biologically active substances «Trepel» and «Suvar» reduce the reactive inflammatory changes around the injury focus, inhibit collagen formation and simultaneously stimulate the proliferation of hepatocytes. This leads to the fact that in experimental animals the actively dividing hepatocytes mechanically compress the area and reduce its size, and at the same time the connective tissue fills only a small fraction of the lesion. In control animals, the inflammatory response dominates over the proliferation of hepatocytes, as a result of this the injury site is almost entirely replaced by connective tissue. Activation by the biologically active substances «Trepel» and «Suvar» of the proliferative activity of hepatocytes contributes to a full recovery of liver tissue. Key words: fetuses and neonatal rats, mechanical liver injury, the biologically active substances, hepatocytes, proliferation.
Адрес для переписки: malichev- [email protected] 904
Казанский медицинский журнал, 2011 г., том 92, № 6
Повреждения печени различного характера часто имеют место у плодов во внутриутробном периоде и у новорожденных. Известно, что у молодых млекопитающих регенерация печени осуществляется хорошо. Тем не менее в литературе даже в условиях стимуляции регенерации в эксперименте нам не встретилось описания полного или практически полного восстановления печени у плодов и новорожденных после воздействия различных дестабилизирующих факторов. Поэтому и в настоящее время актуальным является поиск средств, стимулирующих регенераторные процессы в печени после ее повреждения в раннем онтогенезе.
В последние годы в ветеринарии и в меньшей степени в медицине стали применяться естественные цеолиты. В ряде работ было показано, что использование природного цеолита Алатыр-ского месторождения Чувашской Республики под названием «Трепел» в сочетании с препаратом «Сувар», созданным на основе природных терпеноидов оказывает положительное влияние на многие стороны жизнедеятельности животных [1, 4]. Изучение влияния природных цеолитов в сочетании с иммунокорректорами на регенерацию внутренних органов ранее не изучалось.
Цель работы — оценка влияния биологически активных веществ «Трепел» и «Сувар» на пролиферацию гепатоцитов после механической травмы печени у плодов крыс и новорожденных крысят.
Эксперименты были поставлены на 28 беременных беспородных самках крыс массой 257 — 310 граммов. Объектом исследования являлась печень 112 плодов крыс, которой по разработанной методике (патент РФ на изобретение № 2262153 от 10.10 2005 г.) внутриутробно наносили механическую травму. Операцию производили на 16-17-е сутки беременности. После послойного разреза кожи и мышц передней брюшной стенки в операционную рану выводили матку с находившимися в ней плодами. В эти сроки беременности стенка матки истончалась настолько, что через неё были хорошо видны плоды. Пальцами плоды в матке осторожно поворачивали на 90о таким образом, чтобы переднебоковая поверхность брюшной стенки плодов находилась в месте предполагаемого прокола и хорошо контролировалась глазом. Стальной иглой с ограничителем выполняли прокол вначале стенки матки, а затем плодного пузыря и плода в правом подреберье в месте проекции печени. Прокол осуществляли стальной иглой длиной 8 см и диаметром 0,2 см, которая на расстоянии 0,4 см от конца имела ограничитель, препятствующий более глубокому проникновению иглы в ткани; благодаря такой методике получали достаточно стереотипный объем повреждения.
Самкам начиная с дня операции к основному рациону питания в порошкообразном виде добавляли биологически активные вещества «Трепел» в дозе 1,25 мг/кг и «Сувар» — 50 мк/кг; выбор дозы определяли литературные сведения [ 1, 2 ].
Корм давали один раз в сутки утром, к вечеру он был съеден, что ежедневно контролировалось визуально.
Исследования проводили с соблюдением приказа Министерства высшего и среднего образования СССР от 13.11.1984 г. «О правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крыс выводили из эксперимента с помощью эфира в сроки с 1 до 30-х суток после операции. Анализ материала производили на 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 20 и 30-е сутки, при этом на каждый срок приходилось от 11 (на 9-е сутки ) до 15 (15-е сутки ) наблюдений. В ранние сроки после операции ( 1-3-и сутки ) живые плоды извлекали из матки с помощью кесарева сечения. Начиная с 5-х суток оперированные плоды рождались самостоятельно и далее росли и развивались нормально.
В качестве контрольных были взяты 100 плодов и новорожденных крысят аналогического возраста и одинаковой массы тела. В аналогичных условиях им внутриутробно наносили повреждение печени, однако биологически активные вещества в рацион животных не вводили. Печень крыс подопытной и контрольной групп после фиксации в 10%-нейтральном формалине полностью заключали в парафин. С парафиновых блоков изготавливали серийные гисто-то-пографические срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином, по ван Гизону, железным гематоксилином по Гейденгайну, выполняли реакцию Фёльгена. Пролиферативную активность печени оценивали с помощью подсчета митозов и двуядерных гепатоцитов (на 7000 клеток при х 900); в тех же полях зрения подсчитывали дву-ядрышковые клетки. Количество ДНК в ядрах гепатоцитов определяли в микроскопе Биолам-70 с помощью фотометрирования с использованием микрофотонасадки ФМЭЛ-1 и фотометра ФЭУ-79А в проходящем свете с запирающим светофильтром с максимумом светопропускания на длине волны 570 нм с подаваемым напряжением 900В. Результаты подвергали обратному десятичному логарифмированию по формуле А = Lg U1/U0, где А - оптическая плотность, U1 - показания вольтметра на ядре, U0 - показания вольтметра на неокрашенных участках препаратах. Диплоидным эталоном служили лимфоциты периферической крови и малые лимфоциты лимфатических узлов. Статистическая обработка цифровых данных производилась по программе «Статистика» с привлечением пакета программ Microsoft office (Word Excel) Pentium 166 MMX. Статистическую достоверность определяли с помощью критерия Стьюдента (t).
Заживление повреждения печени у животных обеих групп протекало принципиально одинаково. В 1-е сутки после операции у животных место травмы было представлено дефектом ткани печени, заполненным эритроцитами и погибающими печеночными клетками. На 3-и сутки вокруг очага травмы развивалась воспалительная реакция, представленная молодыми
Количество митозов, двуядерных и двуядрышковых гепатоцитов (в%о) живот ных подопыт ной и контрольной групп в зависимости от времени после операции (М±м)
Время после операции, сутки Количество митозов Количество двуядерных гепатоцитов Количество двуядрышковых гепатоцитов
опыт контроль опыт контроль опыт контроль
1-е 2,6±1,2 1,8±0,4 14,7±2,5 15,0±1,8 29±1,83** 25±2,64
3-и 6,5±2,4* 4,5±1,4 12,8±4,6 14,4±2,7 49±5,62* 37±3,45
5-е 8,2±3,8* 6,1±1,9 16,4±3,5 15,2±2,6 41±5,37* 30±2,73
7-е 7,3±4,8* 2,1±0,8 38,2±6,4* 20,3±4,5 36±4,71** 30±3,09
9-е 6,4±2,8* 1,0±0,4 39,1±8,1* 25,4±5,7 35±2,83** 30±1,90
11-е 4,6±2,8 - 39,3±9,0* 26,0±3,7 39±4,36* 30±3,53
15-е 3,6±1,8 - 36,4±5,5* 21,8±2,7 30±2,85** 25±1,91
20-е 0,8±0,1 - 37,3±6,6* 27,1±3,0 38±4,36* 26±2,74
* р<0,001.
мезенхимальными элементами, которая в постепенно (на 9-е сутки у подопытных и на 7-е сутки у контрольных животных) приобретала преимущественно фибробластический характер. Вокруг места повреждения начинала развиваться грануляционная ткань, по периферии появлялись нежные, тонкие волокна, окрашивающиеся по ван Гизону в бледно-розовый цвет, которые постепенно начинали заполнять дефект. В итоге на месте повреждённого участка печени возникала соединительная ткань: у подопытных крысят она определялась на 11-е сутки, у контрольных животных — на 9-е сутки. Вместе с тем у подопытных и контрольных животных заживление участка травмы имело и различия. Так, у подопытных животных воспалительная реакция была выражена слабо, количество фибробластов в инфильтрате было небольшим, и они появлялись вокруг очага повреждения позже, чем у контрольных животных. Детальное описание морфологического заживления механической травмы печени у плодов и новорожденных крысят приводится в ранее опубликованной работе [2].
У животных обеих групп в печени после операции отмечалась активация митотического деления гепатоцитов (см. табл.). Количество митозов у животных подопытной группы насчитывалось больше, и они прослеживались в ткани печени дольше, чем в контроле. Близкая картина наблюдалась и в отношении двуядер-ных гепатоцитов. До 5-х суток включительно их количество в печени было небольшим, резко возрастая на 7-е сутки, причем у животных подопытной группы статистически достоверно интенсивнее, чем у животных контрольной группы. Увеличение числа митозов и двуядер-ных клеток у подопытных крысят протекало на фоне увеличения у них двуядрышковых клеток, что свидетельствовало об усилении бе-лок-синтетической функции гепатоцитов [3]. После механического повреждения печени у подопытных животных возникало изменение плоидности гепатоцитов. В 1-е сутки большинство клеток были диплоидными. На 5-е сутки в печени начинали преобладать тетраплоидные 906
гепатоциты; одновременно стали фиксироваться октаплоидные и 16п-плоидные гепатоциты. Преобладание тетраплоидных гепатоцитов имело место до 15-х суток включительно; начиная с 20-х суток гепатоциты вновь становились преимущественно диплоидными. У контрольных крысят на протяжении всего эксперимента преобладали диплоидные гепатоциты.
Выполненное исследование свидетельствует о стимулирующем влиянии биологически активных веществ «Трепел» и «Сувар» на заживление механической травмы печени плодов крыс и новорожденных крысят. Снижалась экссудативная реакция, подавлялась активность фибробластов и усиливалась пролиферация гепатоцитов. Быстрое заполнение участка травмы пролиферирующими гепатоцитами способствовало уменьшению количества в этой зоне соединительной ткани. У контрольных животных после механической травмы реактивно-воспалительные процессы в значительной степени преобладали над возникающими регенераторными проявлениями, в результате этого дефект печени на большем протяжении замещался соединительной тканью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Колотилова М.Л., Иванов Л Н. Цеолитсодержащий трепел в медицине. — Чебоксары. Издательство РГУП «ИПК Чувашия», 2003. — 119с.
2. Малышев И.И., Романова Л.П., Воробьева О.В. Микроскопическая морфология заживления механической травмы печени у плодов и новорожденных крысят при применении биологически активных веществ «Трепел» и «Сувар» // Вестник Чуваш. гос. пед. ун-та им. И.Я. Яковлева. — 2010. — №4 (68). — С. 117 — 121.
3. Садовникова В.В., Садовникова И.В., Иванова Н.В. Морфологические изменения в печени крыс при токсическом медикаментозном гепатите и стимуляции ре-паративных процессов // Морфология. — 2001. — №3. — С. 63 — 65.
4. Скребков Г.П. О месторождении и свойствах трепелов Чувашии // Применение местных сырьевых ресурсов в народном хозяйстве. Трепел. Чебоксары. Издательство Чуваш. гос. ун-та им. И.Н. Ульянова, 1997. — С. 6 — 13.
