CC BY
96
ВЛИЯНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНИ МОРСКИХ СВИНОК В НОРМЕ И ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ РАНЫ В ОБЛАСТИ БРЮШНОЙ СТЕНКИ
© Ишунина Т.А.*
Курский государственный медицинский университет, г. Курск
В настоящем исследовании изучено влияние аскорбиновой кислоты (АК) на метаболическую и митотическую активность гепатоцитов морских свинок в норме и в период заживления раны в области брюшной стенки. Введение АК сопровождалось гипертрофией гепатоцитов, увеличением содержания эухроматина в ядрах и РНК в цитоплазме, что свидетельствует об усилении секреторной активности клеток печени. Повышение плотности расположения гепатоцитов и увеличение количества двуядерных клеток на фоне приёма АК демонстрируют положительный эффект витамина С на регенераторные способности печени.
Ключевые слова: аскорбиновая кислота, печень, ДНК, РНК, площадь клеток, митотическая активность, метаболическая активность.
Аскорбиновая кислота (АК), известная под названиями аскорбат, L-аскорбиновая кислота, витамин С, служит жизненно важным донором электронов. Она выступает в роли ко-фактора 8 ферментов, участвующих в гид-роксилировании коллагена, биосинтезе карнитина и норадреналина, метаболизме тирозина и образовании пептидных гормонов. Помимо этого АК является мощным водорастворимым анти-оксидантом [4, 6, 7]. В связи с этим, её концентрация в плазме снижается при патологических состояниях, связанных с острым или хроническим окислительным стрессом, такими как инфаркт миокарда, острый панкреатит, сахарный диабет, инфекционные процессы, курение. При гипохлоргидрии, атрофическом гастрите, инфицировании Helicobacter pylori и раке желудка наблюдается уменьшение содержания АК в желудочном соке. Назначение диет с высоким содержанием витамина С приводит к снижению артериального давления и риска развития рака желудка. Внутривенное введение высоких доз витамина С сокращает скорость роста злокачественных опухолей, улучшает общее состояние таких больных. Примечательно, что в этом случае АК выступает в противоположной роли про-оксиданта за счёт увеличения образования перекиси водорода и высоко реактивных повреждающих гидроксильных радикалов [3, 6, 7].
Практически все вышеперечисленные физиологические и биохимические эффекты АК связаны с её функционированием в качестве донора электронов. Интересно, что АК отдаёт 2 своих электрона из двойной связи меж-
Доцент кафедры Г истологии, эмбриологии, цитологии, кандидат медицинских наук, доцент.
Медицинские науки
39
ду 2-м и 3-им углеводом последовательно. После потери первого электрона образуется свободный радикал, именуемый полудегидроаскорбиновой кислотой или аскорбил-радикалом (А-Р). Отдав второй электрон, А-Р превращается в дегидроаскорбиновую кислоту (ДАК). Как А-Р, так и ДАК могут обратно восстанавливаться до АК [4, 6] Указанные физико-химические свойства АК лежат в основе её способности восстанавливать азотно-кислое се-ребро,что позволяет достоверно определить её содержание в тканях посред-стом серебрения. ДАК, не восстановленная до АК, подвергается гидролизу до 2,3-дикетогулоновой кислоты, которая впоследствии метаболизируется до ксилозы, ксилоната, ликсоната и оксалата. Причём, избыточное накопление последнего может привести к образованию у людей оксалатных камней. Как АК, так и ДАК подлежат фильтрации и реабсорбции в почках. При этом концентрация АК в моче значительно выше, чем ДАК [6].
Помимо поступления с пищей, АК синтезируется de novo из глюкозы в печени большинства млекопитающих за исключением морских свинок, приматов и человека [1, 2, 8]. Отсутствие синтеза АК в печени человека и названных животных связано с нарушениями в структуре гена L-гулонолакто-новой оксидазы, которая катализирует последнюю реакцию в цепи биосинтеза АК [1]. У человека имеется нетранскрибируемая копия этого гена, лишённая восьмого и большей части одиннадцатого экзонов. Более того, в ней обнаружены множественные мутации, проявляющиеся отсутствием или добавлением нуклеотидов, несоответствием правилу GT/AT на границе ин-тронов и экзонов [5]. Полагают, что утрата биосинтеза АК у вышеперечисленных видов связана с более высокой активностью их супероксид дисму-тазы, катаболизирующей формирование перекиси водорода. Так как заключительный этап образования АК также сопровождается выделением этого токсичного соединения, то становится понятным стремление сократить объём эндогенной перекиси водорода за счёт выключения биосинтеза АК. Интересна и другая точка зрения о том, что нарушение выработки АК с её мощным антиоксидантом свойствами способствовало более быстрой эволюции приматов и человека посредством увеличения числа мутаций в геноме [1].
Несмотря на многочисленные сведения, касающиеся содержания и накопления АК в печени, вопрос о её клеточной локализации в этом органе и влиянии на гепатоциты остаётся неизученным. Известно, что АК поступает в гепатоциты через Na+ - зависимый транспортёр SVCT1 [1, 6]. Однако, влияние АК на метаболизм гепатоцитов практически не изучено. Учитывая вышесказанное и принимая во внимание участие АК в процессах регенерации, целью настоящего исследования стало изучение эффекта АК на метаболическую и митотическую активность гепатоцитов и содержание в них ДНК и РНК в норме и после моделирования раневого процесса в области брюшной стенки. В качестве показателей метаболической (синтетической) активности определяли площадь сечения гепатоцитов и их ядер, а также
40
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
интенсивность окрашивания ДНК и РНК. О митотической активности судили на основании изменений плотности расположения гепатоцитов и частоте встречаемости двуядерных клеток. Исследование проведено на морских свинках, так как подобно человеку они не способны синтезировать эндогенную АК и зависят от её поступления с пищей. Поэтому результаты, полученные на морских свинках, могут быть экстраполированы на человека [1, 6].
Материалы и методы
В работе использованы 14 морских свинок, разделенных на 4 группы: 1) интактные, 2) животные, получавшие 0.2 мл 5 % раствора АК подкожно каждый день, 3) морские свинки, которым произведен разрез брюшной стенки на протяжении 3 см с последующим наложением шва и 4) морские свинки, которым производили разрез брюшной стенки с последующим наложением шва, и ежедневно вводили АК в течение 7 дней до и после операции. Различия в концентрации АК определяли по уровню её экскреции с мочой дихлорлиндофеноловым способом. Все эксперименты проводились при соблюдении правил гуманного обращения с животными. Фрагменты печени подопытных животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 12 мкм импрегниро-вали по методике Барнетта и Бурна и докрашивали гематоксилином для выявления АК в гепатоцитах. Часть срезов окрашивали поликлональными антителами SVCT 1 (H-78) (Santa Cruz), специфично распознающими мембранный транпортёр АК SVCT 1. Для одновременного выявления ДНК и РНК применялось окрашивание метиловым зелёным и пиронином по методике Паппенгейма и Унны в модификации Bancroft and Cook [9]. NH2 группы метилового зелёного связываются с фосфатными группами двойной спирали ДНК. Пиронин окрашивает в красный цвет тканевые структуры, имеющие отрицательный заряд. При совместном использовании метиловый зелёный преимущественно и специфично связывается с ДНК, а пиронин - с РНК [9]. Интенсивность окраски ядер и цитоплазмы оценивалась полуколичественно с помощью шкалы от 0 до 4 арбитражных единиц. С помощью программы Image J определяли площадь гепатоцитов и их ядер. Ядерноцитоплазматическое отношение вычисляли путём деления площади ядра на площадь всей клетки. При увеличении в 280 раз в полях зрения площадью 1600 мкм2 подсчитывали общую плотность расположения гепатоцитов и количество двуядерных клеток. Статистическая обработка данных проводилась в программе Excel. Достоверность различий определялась по значению t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Результаты импрегнации АК и иммуноцитохимического окрашивания SVCT 1 подтвердили, что вводимая подкожно АК поступает в гепатоциты по-
Медицинские науки
41
средством этого транспортёра и накапливается в них. Как количество гранул с АК в гепатоцитах, так и экспрессия SVCT 1 в печени у морских свинок, получавших АК подкожно, были значительно повышены по сравнению с животными, которым АК не вводили (рис. 1).
Рис. 1. Экспрессия мембранного транпортёра АК SVCT 1 в печени морских свинок
После моделирования раневого процесса у морских свинок, не получавших АК, наблюдалось увеличение размеров гепатоцитов (р < 0.0001) и их ядер (р = 0.0007). Вследствие более значительного увеличения размеров гепатоцитов по сравнению с их ядрами, в этой группе достоверно снижалось ядерно-цитоплазматическое отношение (р = 0.027). Введение АК не влияло на размеры ядер гепатоцитов независимо от наличия воспалительного процесса. В то же время после введения АК наблюдалось резкое увеличение площади гепатоцитов у животных, которым оперативное вмешатель-
42
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ство не производилось (р = 0.001). В результате в этой экспериментальной группе происходило значимое снижение ядерно-цитоплазматического отношения (р = 0.03). Некоторое увеличение размеров гепатоцитов у животных 4-ой группы по сравнению со 2-ой говорит о независимом аддитивном эффекте АК на метаболическую активность гепатоцитов при регенераторных процессах в организме.
Интенсивность окрашивания ядер метиловым зелёным снижалась после введения АК, но увеличивалась после моделирования раневого процесса. Следует отметить, что снижение интенсивности окраски ядер свидетельствует о преобладании эухроматина, а увеличение этого показателя - о превалировании гетерохроматина. Так, содержание гетерохроматина увеличивалось у животных 3-ей группы по сравнению с интактной контрольной группой № 1 и было повышено в 4-ой группе по сравнению со 2-ой (р < 0.0001). В то же время интенсивность окрашивания ДНК значительно снижалась во 2-ой группе по сравнению с 1-ой и в 4-ой группе по сравнению с 3-ей (р < 0.0001), что говорит о преобладании эухроматина в ядрах гепатоцитов животных, которым вводили АК. Содержание РНК в цитоплазме, оцениваемое по окраске пиронином, значительно повышалось во 2-ой группе по сравнению с 1 -ой и в
4-ой группе по сравнению с 3-ей (р < 0.0001).
У животных, получавших АК, наблюдалось достоверное увеличение плотности гепатоцитов (р = 0.025) и количества двуядерных клеток. Наиболее высокими эти показатели оказались в 4-ой экспериментальной группе
(р = 0.0001).
Заключение
Таким образом, при подкожном введении АК транспортируется в гепа-тоциты через SVCT 1 и накапливается в них. Под влиянием АК происходит активизация транскрипции, в результате чего снижается содержание гетерохроматина и увеличивается концентрация эухроматина в ядре, а в цитоплазме повышается уровень РНК. Обнаруженные изменения свидетельствуют об усилении секреторной функции гепатоцитов на фоне приёма АК. Об этом свидетельствуют и результаты морфометрического анализа, продемонстрировавшие гипертрофию гепатоцитов и снижение ядерно-цитоплазматического отношения на фоне приёма аскорбиновой кислоты. Помимо этого, введение витамина С улучшает процессы регенерации в печени.
Список литературы:
1. Arrigoni O., De Tullio M.C. Ascorbic acid: much more than just an antioxidant // Biochimica et Biophysica Acta. - 2002. - Vol. 1569. - P. 1-9.
2. Chatteijee I.B. Evolution and biosynthesis of ascorbic acid // Science. -1973. - Vol. 182. - P. 1271-1272.
3. Li Y. Schellhorn H.E. New developments and novel therapeutic perspectives for vitamin C // J. Nutr. - 2007. - Vol. 137. - P. 2171-2184.
Медицинские науки
43
4. Linster C.L., Van Schaftingen E. Vitamin C. Biosynthesis, recycling and degradation in mammals // FEBS Journal. - 2007. - Vol. 274. - Р. 1-22.
5. Nishikimi M., Fukuyama R., Minoshima S., Shimizu N., Yagi K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-y-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269, № 18. - Р 13685-13688.
6. Padayatty S.J., Katz A., Wang Y, Eck P., Kwon O., Lee Je-H., Chen S., Corpe C., Dutta A., Dutta S.K., Levine M. Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention // Journal of the American College of Nutrition. - 2003. - Vol. 22, № 1. - Р. 18-35.
7. Padayatty S.J., Levine M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin C // CMAJ. - 2001. - Vol. 164, № 3. - Р. 353-355.
8. Wilson J.X. The physiological role of dehydroascorbic acid // FEBS. -
2002. - Vol. 527. - Р. 5-9.
9. Bancroft J.D., Cook H.C. Mannual of histological techniques and their diagnostic application // Edinburgh: Churchill Livingstone. - 1994.
