CC BY
20
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, соединение под лабораторным шифром РУ-1203 проявляло антиноцицептивные свойства при различных путях введения, в том числе и при приеме внутрь, что открывает перспективы создания на его основе эффективной пероральной лекарственной формы, в отличие от буторфанола.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брюзгин В. В. Лечение хронической боли у онкологических больных // Consilium medicum. — 2000. — Vol. 2, № 12. — P. 514—518.
2. Гречко О.Ю., Васильев П.М., Черников М.В. и др. // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7. — С. 1666—1667.
3. Гоечко О. Ю., Елисеева Н. В., Спасов А. А. и др. Поиск веществ с каппа-опиоидной активностью // Человек и лекарство: тезисы докладов XVII Российского национального конгресса апреля 2010 г — М., 2010. — С. 599—600.
4. Collett B., Harald B., et al. // European Journal of Pain. — 2006. — Vol. 10, № 4. — P. 287—333.
5. Gillis J. C, et al. // Drugs. — 1995. — Vol. 50, № 1. — P. 157—175.
6. Kivell B, Prisinzano T. E. // Psychopharmacology (Berl). — 2010. — Vol. 210, № 2. — Р. 109—119.
7. Le Bars D, Gozariu M, et al. // Pharmacol. Rev. — 2001. — Vol. 53, № 4. — Р. 597—652.
8. Park H. S, Lee H. Y, Kim Y. H, et al. // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. — 2006. — Vol. 16. — № 13. — P. 3609—3613.
9. Rostaing-Rigattieri S, et al. // Bull Cancer. — 2003. — Vol. 90, № 8. — Р. 795—806.
Н. А. Гурова, А. С. Питерсен, В. Ю. Федорчук, Д. В. Косолапова
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии
ВЛИЯНИЕ АМИЛОРИДА НА АКТИВНОСТЬ NA+/H+-ОБМЕННИКА ТРОМБОЦИТОВ
УДК 615.761:616.1-092.9
Установлено, что амилорид дозозависимо ингибировал №+/Н+-обменник и IC50 ингибирования составила 1,23 х 10-6 М/л. Острая токсичность амилорида изучалась на мышах при внутрибрюшинном введении, и ЛД50 составила 35 мг/кг, а условный терапевтический индекс равнялся 106,1 условных единиц.
Ключевые слова: №+/Н+-обменник, тромбоциты, амилорид, LD50.
N. A. Gurova, A. S. Pitersen, V. Y. Fedorchuk, D. V. Kosolapova
AMILORIDE EFFECT ON THE ACTIVITY OF PLATELET NA+/H+-EXCHANGER
It was determined that amiloride inhibited platelet Na+/H+-exchange in dose-dependent manner and IC50 was 1,23 х 10-6 M/L. Acute toxicity of amiloride was investigated in mice after i. p. administration, and LD50 amounted to 35 mg/kg. Conditional therapeutic index of 106,1 units was calculated.
Key words: Na+/H+-exchanger, platelets, amiloride, LD50.
Интенсивная терапия ишемической болезни сердца остается актуальной задачей современной кардиологии [5, 6, 7, 8, 10]. Однако применение в последние годы активных терапевтических и хирургических методов лечения способствовало возникновению новой серьезной проблемы — развитию постишемичес-кого реперфузионного синдрома, который приводит к увеличению тяжести и зоны повреждения и, как следствие, нарушению сократимости, развитию аритмий, острой сердечной недостаточности [3, 5, 6, 11].
Основные принципы современной кардиопротек-ции направлены на сохранение коронарного кровотока, замедление ремоделирования камер сердца, повышение толерантности к повреждающему действию различных экзо- и эндогенных факторов [4, 6—8, 10, 11].
Среди выдвигаемых новых подходов перспективным выглядит использование соединений, способствующих развитию так называемого «ишемического пре-кондиционирования» (ischemic preconditioning), своеобразной тренировки сердечной мышцы, повышающей ее адаптацию к ишемии и реперфузии [3]. Одной из таких групп являются ингибиторы №+/Н+-обменника изоформы 1 (NHE-1). Эта изоформа локализуется преимущественно в плазматической мембране миокарда, тромбоцитах и эритроцитах [3, 12, 13, 15] и вовлечена в регулирование внутриклеточного pH во время ишемии/ реперфузии. Однако чрезмерное стимулирование NHE-1 способствует увеличению содержания внутриклеточного Ca++, что приводит к аритмиям и «оглушению» миокарда и дальнейшему некрозу [3, 12]. Кардиопро-
текторное действие ингибиторов NHE-1 связано с уменьшением повреждающего действия чрезмерной активации данного обменника [3, 12, 13]. Одним из его первых известных ингибиторов является амилорид. В литературе встречаются неоднозначные данные об его активности в отношении NHE-1, а также его токсичности [3, 14]. Поэтому мы посчитали необходимым изучить NHE-1-ингибирующую активность препарата на тромбоцитах кролика, летальную дозу при внутрибрюшинном введении, а также рассчитать терапевтический индекс.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучение влияния амилорида на активность NHE-1 тромбоцитов кролика и острой токсичности.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для изучения влияния амилорида на активность №+/Н+-обменника была использована методика на тромбоцитах кролика, описанная Rosskopf D., et al. (1991) и Kusumoto K. (2002) [2, 15, 13]. Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащую 3,8 % цитрата натрия, в соотношении 1 : 10. Каждый образец центрифугировали с числом 1000 об./мин в течение 12 мин. Собирали надосадочную часть — плазму, богатую тромбоцитами (ПБогТ). Активацию NHE-1 проводили раствором пропионатта натрия (600 мкл, в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, CaCI2 1, MgCI2 1, глюкоза 10; pH 6.7; t = 37 оС). Для контроля изменения светопропускания в условиях нормальной рН использовали раствор Кребса (600 мкл, в ммоль/л: NaCl — 120, KCl—4,8, KH2PO4—1,2, MgSO4—2,5, NaHCO3— 25, CaCl2 — 2,6, глюкоза — 5,4; pH 7,4; t = 37 оС).
Амилорид (10 мкл) добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) и инкубировали 3—5 минут при температуре 37 оС, постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 об. в мин). Исследования проводились в диапазоне концентраций 10-7—10-5 М/л.
Изменения формы тромбоцитов регистрировали по изменению светопропускания [13, 15] с помощью лазерного агрегометра «БИ0ЛА-220 ЛА», Россия.
Рассчитывали Ю50-концентрацию соединения, при которой NHE ингибирующая активность составляет 50 %%. Величину IC50 амилорида определяли с помощью регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и активностью обменника Excel 2007 (MS Office XP, США).
Изучение острой токсичности амилорида проводили на 30 половозрелых мышах-самцах массой 20—30 мг/кг. Вещество вводили животным внутри-брюшинно в дозах 10, 20, 30, 40, 50 мг/кг.
Общая продолжительность наблюдения за животными составляла 14 дней. Первые сутки мыши находились под непрерывным наблюдением. У них отмечали общее состояние, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители и сроки гибели. Последующие 2 недели наблюдали за выживаемостью животных.
Расчет LD50 (мг/кг) производили с использованием пробит-анализа [9], реализованного в программе Excel 2007 (MS Office XP, США).
Терапевтический индекс рассчитывали с использованием известной формулы с учетом IC50 и LD50 амилорида.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При добавлении раствора пропионата натрия к ПБогТ происходит увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H+, посредством №+/Н+-обменника, ведущее к отеку тромбоцитов в результате аккумуляции воды в цитоплазме [13, 15]. При этом наблюдается облегчение светопропускания.
В контрольной серии экспериментов при добавлении к ПБогТ натрийпропионатного буфера происходил значительный рост светопропускания по сравнению с добавлением раствора Кребса (рис. 1).
----2------2--— --
1
.[TV 4----- ~ 4------
—!------1 "
¡1 м J
1'
Обозначения: 1 — контроль с раствором Кребса;
2 — контроль с натрия пропионатным буфером;
3 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10-5 М/л; 4 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10-6 М/л; 5 — опыт с амилоридом в дозе 1 х 10-7 М/л.
Рис. 1. Кривые записи изменения светопропускания при введении в пробы различных доз амилорида (лазерный агрегометр «БИОЛА-220 ЛА», Россия)
В условиях предварительного добавления к ПБогТ амилорида изменение светопропускания было незначительным (рис. 1), что вероятно связано с блокадой NHE и отсутствием сферуляции тромбоцитов. Это согласуется с данными литературы [13, 15]. В ходе проведенного исследования было показано дозозависимое угнетение активности NHE-1 при использовании амилорида в диапазоне концентраций 10-7—10-5 М/л (рис. 1). Рассчитана величина 1С50, которая составила 1,23*10-6 М/л (рис. 2).
При изучении острой токсичности амилорида при внутрибрюшинном введении мышам было показано, что в течение первого часа после введения соединения во всех экспериментальных группах
изменений не отмечалось: сохранялась активная поисковая деятельность, тактильная и болевая чувствительность, отсутствовали судороги.
■7 -6,5 -6 -5,5 -5 -4,5 -4
Lg концентрации
Рис. 2. Зависимость ингибирующего эффекта амилорида на Na+/H+-обменник от концентрации (расчет величины Ю50)
Однако в течение суток у некоторых животных наблюдалось увеличение частоты дыхания, угнетение двигательной активности и координации в движениях, снижение тонуса скелетных мышц, отсутствие реакций на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, появление судорог, смерть животных.
По результатам исследования гибель животных наблюдалась, начиная с дозы 20 мг/кг. С увеличением вводимой дозы амилорида количество погибших животных возрастало.
Для расчета LD50 процент гибели был переведен в пробит-баллы с помощью специальных таблиц [9], и рассчитан логарифм концентраций (рис. 3).
6
♦ y = 4,500x-1,949
/ R2 = 0,912
// -^—острая токсичность
/ J -Линейная (острая
токсичность)
1 2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8
Рис. 3. Дозовая зависимость гибели в координатах дозы-пробит» при изучении острой токсичности амилорида
Рассчитана величина LD50 для одних суток, которая для препарата амилорида при внутри-брюшинном введении составила 35 мг/кг. В период двухнедельного наблюдения дополнительной гибели животных не было. Учитывая классификацию токсичности химических веществ при парентеральном способе введения по Березовской [1], амилорид можно отнести к умеренно токсичным.
Был рассчитан терапевтический индекс, который составил 106,1 условных единиц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Амилорид оказывает дозозависимое ингиби-рующее действие на активность NHE-1 тромбоцитов кролика. 1С50 составила 1,23*10-6 М/л. Полученные данные сопоставимы с литературными данными (база данных EMBL-EBI, 2010). Амилорид относится к умеренно токсичным соединениям, летальная доза составляет 35 мг/кг. Терапевтический индекс амилорида — 106,1 условных единиц.
ЛИТЕРАТУРА
1. Березовская И. В. // Хим.-фармац. журн. — 2003. — № 3 (37). — С. 32—34.
2. Гурова Н. A., Спасов A. A., Питерсен A. С. // Вестник ВолгГМУ. — 2011. — № 2 (38). — С. 70—72.
3. Зверев Я. Ф., Брюханов В. М. // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. — 2003. — № 3 (2). — С. 16—34.
4. Иежица И. Н., Спасов А. А., Харитонова М. В. // Микроэлементы в медицине. — 2008. — № 1 —2 (9). — С. 53—54.
5. Мамедов М. Н., Канорский С. Г., Концевая А. В. // Кардиология. — 2011. — № 4. — С. 56—64.
6. Михин В.П., Савельева В.В. // Российский кардиологический журнал. — 2009. — № 1 (75). — С. 49—56.
7. Петров В. И., Бакумова П. А., Воронин С. П. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. — 2006. — № 4. — С. 28—31.
8. Петров В. И., Магницкая О. В., Лиходеева Ю. В., Малахов А. И. // Саратовский научно-медицинский журнал. — 2011. — №2 (7). — С. 410—451.
9. Платонов А. Г., Ахалая М. Я. Дозовая зависимость постлучевой гибели. Расчет полулетальной дозы ЛД50 методом пробит-анализа. — М., 2006. — 33 с.
10. Спасов А. А., Косолапов В. А., Островский О. В. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2003. — № 4 (66). — С. 17—20.
11. Тюренков И. Н., Перфилова В. Н., Гречко О. Ю. // Вестник ВолГМУ. — 2010. — № 1 (33). — С. 74—76.
12. Fliegel L. // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. — 2008. — № 44. — Р. 228—237.
13. Kusumoto K., Igata H., Abe A., et al. // British Journal of Pharmacology. — 2002. — № 135. — Р. 1995—2003.
14. Oliveira P., Sousa M., Barros A., Moura T. // Reproduction. — 2009. — № 137. — P. 354—355.
15. Rosskopf D., Morgenstern E., Scholz W., et al. // Journal of Hypertension. — 1991. — № 9. — Р. 231—238.
